膽南星拮抗熱性驚厥模型小鼠腦組織損傷及炎癥的作用研究

曾平,閆玉梅，郁紅禮,3,4,吳皓,3,4,陶興寶,謝雨薇,程硯秋,王彩霞,王賀鵬,陳勁松

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.精華制藥集團股份有限公司，江蘇 南通 226000；3.江蘇省中藥炮制重點實驗室,江蘇 南京 210023;4.國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心,江蘇 南京 210023;5.四川仟源中藥飲片有限公司,四川 廣漢 618304)

膽南星(Arisaema cum Bile)是天南星的常用炮制品之一,由制天南星的細粉與牛、羊或豬膽汁加工而成,或由生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁發(fā)酵加工而成,具有清熱化痰、息風定驚之功,臨床常用于治療中風痰迷、癲狂驚癇等癥[1]?！侗静輩R言》有云:“如小兒驚風驚痰,四肢搐搦,……非膽星不能療也”[2]?，F(xiàn)代臨床文獻亦顯示膽南星常用于治療小兒熱性驚厥[3]。熱性驚厥是兒童常見疾病,現(xiàn)代藥理研究認為該病發(fā)生與免疫炎癥過程密切相關,炎癥因子大量釋放引起機體發(fā)熱,進而引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經元興奮,形成異常放電，導致熱性驚厥發(fā)生[4]。長時間反復發(fā)作的熱性驚厥可引起海馬神經元細胞損傷，誘發(fā)腦內炎癥反應,進一步導致驚厥發(fā)作、神經元細胞損傷等[5]。文獻顯示膽南星具有抗炎[6]、鎮(zhèn)靜[7]等藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)膽南星具有顯著的抗驚厥作用[8],但其抗熱性驚厥藥效作用及其機制不明。本研究基于熱性驚厥發(fā)病機制構建熱性驚厥小鼠模型[9],考察膽南星拮抗熱性驚厥模型小鼠腦組織損傷、炎癥的影響,為膽南星抗熱性驚厥效應物質基礎研究提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器

膽南星(四川仟源中藥飲片公司,批號:190401);戊四氮(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:P815563-5g);丙戊酸鈉(上海源葉生物科技有限公司,貨號:S60377-5g);阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,貨號:68469);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,貨號:902-0000-522);COX-2、iNOS抗體(成都正能生物技術有限公司,貨號:R23971、340668);γ-氨基丁酸A型受體(GABAAR)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、β-actin、GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:12410-1-AP、16825-1-AP、23660-1-AP、10494-1-AP);電子體溫計[歐姆龍(大連)有限公司,貨號:MC-246];干酵母(安琪酵母股份有限公司,批號:CF20200324W2F33);液體石蠟(山東德新康醫(yī)療科技有限公司,批號:200603);PGE2、cAMP ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:ml037542、ml057902)。

多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號:SpectraMax i3X)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號:ABI7500);組織研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司,型號:Tiss-24);垂直凝膠電泳及電轉印儀(美國Bio-rad公司,型號:Mini P-4);全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號:Tanon 5200);超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司,型號:NanoDrop OneC)。

膽南星水提物制備:取適量飲片于8倍量水中浸泡1 h,煮沸后小火煎煮30 min,放冷后,4 000 r·min-1離心5 min,取上清液;再次將殘渣加6倍量水煎煮,煮沸后小火煎煮20 min,放冷后,4 000 r·min-1離心5 min,取上清液,合并2次上清液,置于蒸發(fā)皿上揮至合生藥量0.5 g·mL-1。

1.2 動物

SPF級ICR小鼠,雄性,體質量22～24 g,購自南京市青龍山動物養(yǎng)殖場,許可證號：SCXK(蘇)2019-0002,動物實驗通過南京中醫(yī)藥大學倫理委員會審查,倫理號:202005A022。SPF級屏障環(huán)境飼養(yǎng),自由飲水、進食,室溫22～25 ℃,濕度40%～70%。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

ICR小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后,先適應性測量肛溫2 d,隨后對小鼠進行連續(xù)3 d的肛溫測量,每天2次。篩選測溫溫差≤0.5 ℃的小鼠作為實驗對象,隨后按照隨機數(shù)表進行分組。60只小鼠分為空白組,模型組,陽性藥組(300 mg·kg-1丙戊酸鈉與200 mg·kg-1阿司匹林聯(lián)合給藥),膽南星低劑量組(0.5 g·kg-1)、中劑量組(1.0 g·kg-1)、高劑量組(2.0 g·kg-1)，每組10只。實驗前12 h禁食不禁水,空白組和模型組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,其余給藥組以20 mL·kg-1給予相應藥物,每日1次,連續(xù)給藥7 d。末次給藥后除空白組外,其余各組皮下注射20%干酵母混懸液(10 mL·kg-1)致發(fā)熱模型,8 h后測量肛溫。隨即除空白組外,其余各組腹腔注射戊四氮溶液(60 mg·kg-1)。記錄30 min內各組小鼠驚厥表現(xiàn),然后眼眶靜脈叢取血,離心取血清備用,同時,分別在冰上解剖小鼠，取出腦組織、海馬組織及其他臟器,放于液氮中備用。

2.2 小鼠行為學觀察

驚厥行為學觀察[10]:記錄30 min內小鼠的驚厥表現(xiàn)，驚厥判斷標準見表1。驚厥潛伏期:末次腹腔注射戊四氮溶液至小鼠首次出現(xiàn)2級反應。驚厥持續(xù)時間:首次出現(xiàn)2級反應至末次出現(xiàn)2級反應之間的時間。

表1 驚厥行為學表現(xiàn)判斷評級

2.3 HE染色

每組隨機選擇3只小鼠吸入異氟烷麻醉后,心臟灌流,首先注入一定體積生理鹽水進行灌流,清除血液,待肝臟等器官轉呈灰白色后,緩慢注入4%多聚甲醛,待小鼠四肢僵硬,停止灌注,取下大腦,固定,備用。通過HE染色評估海馬神經元損傷病理表現(xiàn)。

2.4 ELISA法檢測血清中cAMP、PGE2水平

血液室溫自然凝固20 min,于4 ℃、3 000 r·min-1離心20 min,收集上清,按試劑盒說明書以ELISA法檢測血清中cAMP、PGE2水平。

2.5 Western blot法檢測小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP、GABAAR蛋白表達水平

冰上稱取一定量腦組織置于含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的預冷RIPA中勻漿并離心,然后使用BCA法測定上清液的蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,然后將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后,將每個PVDF膜與一抗[兔抗COX-2(1∶1 000)、iNOS(1∶500)、GFAP(1∶5 000)、GABAAR(1∶1 000),鼠抗β-actin(1∶3 000)、GAPDH(1∶3 000)]在4 ℃下孵育過夜。次日洗滌PVDF膜,然后與相應的二抗(1∶3 000)孵育2 h。洗滌PVDF膜后使用ECL試劑在曝光機下拍攝蛋白條帶,并使用Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

2.6 qPCR法檢測小鼠海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平

采用Trizol法從小鼠海馬組織中提取總RNA,使用Nano-Drop超微量紫外分光光度計測量RNA濃度。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix預混液制備樣品及擴增。擴增條件為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性10 s,退火/延伸60 ℃ 34 s,共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達水平,選擇β-actin作為內參。引物序列見表2。

表2 目的基因的引物序列

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠肛溫變化的影響

各組小鼠的基礎肛溫沒有顯著性差異。皮下注射20%干酵母混懸液造模8 h后,與空白組比較,模型組小鼠肛溫顯著升高(P<0.05),表明發(fā)熱小鼠模型造模成功。與模型組比較,陽性藥組及膽南星高劑量組小鼠肛溫均顯著降低(P<0.05),表明膽南星具有解熱作用。見圖1。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.2 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠驚厥發(fā)作潛伏期、驚厥持續(xù)時間及腦組織GABAAR蛋白表達的影響

空白組與陽性藥組未發(fā)生驚厥表現(xiàn)，模型組發(fā)現(xiàn)驚厥表現(xiàn)。與模型組比較,膽南星高劑量組可顯著延長驚厥潛伏期(P<0.05),縮短驚厥持續(xù)時間(P<0.01),顯著上調腦組織GABAAR蛋白表達(P<0.05),表明膽南星具有抗驚厥作用,見圖2。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=10。

3.3 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠血清cAMP、PGE2水平的影響

ELISA結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠血清cAMP、PGE2水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,陽性藥組及膽南星高劑量組小鼠血清cAMP、PGE2水平均顯著降低(P<0.01),表明膽南星發(fā)揮解熱作用的機制可能與抑制小鼠血清cAMP、PGE2等內源性介質釋放有關。見圖3。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=6。

3.4 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠海馬區(qū)神經元細胞形態(tài)的影響

HE染色病理切片結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠的腦組織海馬整體結構異常,海馬區(qū)神經元數(shù)量異常,錐體細胞形態(tài)異常,可見神經元細胞核固縮深染,排列不規(guī)整,表明長時間的驚厥發(fā)作破壞了神經元細胞的正常形態(tài)結構。與模型組比較,膽南星高劑量組海馬神經元形態(tài)明顯改善,錐體細胞表現(xiàn)正常,排列相對整齊,核仁清晰，表明膽南星能有效改善海馬神經元細胞形態(tài),保護其免受驚厥誘發(fā)的神經元損傷,具有一定的神經保護作用,見圖4。

注：藍色箭頭代表海馬區(qū)神經元細胞形態(tài)。

3.5 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響

qPCR法結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,膽南星高劑量組小鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05),表明膽南星可降低海馬組織炎癥因子釋放,具有拮抗腦組織炎癥的作用,見圖5。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。±s,n=3。

3.6 膽南星水提物對熱性驚厥小鼠腦組織iNOS、COX-2、GFAP表達的影響

Western blot分析結果顯示,與空白組比較,模型組小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,膽南星高劑量組小鼠腦組織COX-2、iNOS、GFAP蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05),表明膽南星能夠下調相關蛋白的表達,緩解腦內炎癥反應的發(fā)生,降低腦組織損傷,見圖6。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01?！纒,n=3。

4 討論

膽南星功效為清熱化痰,息風定驚,對《中國藥典》2020年版收載的含有膽南星中成藥的分析表明膽南星臨床主要用于治療小兒高熱驚風、小兒支氣管炎、小兒風熱感冒等疾病[1]。小兒急驚風現(xiàn)代病理表現(xiàn)通常為熱性驚厥,由于炎癥反應誘發(fā)的機體發(fā)熱及驚厥發(fā)生通常是熱性驚厥的發(fā)病機制之一[11]。

熱性驚厥是兒童常見的一種驚厥性疾病,現(xiàn)代研究認為該病發(fā)生與免疫炎癥過程密切相關。當熱性驚厥發(fā)生時,機體的炎癥反應促進cAMP、PGE2等炎癥介質的釋放,進而導致發(fā)熱反應,可引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經元興奮,異常放電導致驚厥發(fā)生[4]。文獻顯示,神經元細胞的抑制和活化與驚厥的發(fā)生密切相關,抑制性神經遞質GABA與GABA受體結合后可抑制突觸后電位,進而降低神經元興奮性[12],隨即抑制驚厥的發(fā)生。此外,長時間的熱性驚厥發(fā)作可引起海馬神經元細胞損傷進而誘發(fā)腦內炎癥反應,同時激活星形膠質細胞,此時GFAP大量表達[13],活化的星形膠質細胞可導致iNOS與COX-2的大量表達,并且促進大量炎癥因子釋放[14-15]。

本研究首次采用皮下注射20%干酵母混懸液再以戊四氮溶液為致驚劑構建熱性驚厥模型[16-17]。相較于空白組,造模后的小鼠肛溫及驚厥發(fā)生相關指標、小鼠腦組織炎癥因子水平都有顯著性差異(P<0.05),表明造模成功。與模型組比較,膽南星水提物高劑量組能有效延長熱性驚厥的潛伏期(P<0.05),縮短驚厥持續(xù)時間(P<0.01),下調GABAAR蛋白的表達(P<0.05),同時降低模型小鼠肛溫(P<0.05),降低血清cAMP、PGE2水平(P<0.01),表明膽南星具有解熱、拮抗熱性驚厥的作用。HE染色病理切片觀察發(fā)現(xiàn),模型組海馬區(qū)神經元形態(tài)發(fā)生改變，受到損傷,膽南星組海馬區(qū)神經元形態(tài)未見明顯變化,表示膽南星能夠保護海馬區(qū)神經元。同時,模型組小鼠GFAP蛋白(主要存在于星形膠質細胞中)表達量顯著上調(P<0.05),膽南星高劑量組GFAP蛋白表達下調(P<0.05)。GFAP是中樞神經系統(tǒng)應激后星形膠質細胞活化的最佳標志物之一，星形膠質細胞通常在神經系統(tǒng)中作出反應，表明膽南星具有抑制星形膠質細胞激活的作用。高劑量膽南星能夠下調iNOS、COX-2蛋白的表達(P<0.05),同時下調海馬組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平(P<0.05),表明膽南星在發(fā)揮抗驚厥藥效的同時抑制了腦內炎癥反應的發(fā)生。由于腦內炎癥反應的發(fā)生可提高驚厥發(fā)作易感性[18],膽南星拮抗熱性驚厥的作用一定程度可能與其抑制腦內炎癥反應相關。上述研究表明,膽南星具有顯著的抗熱性驚厥、保護海馬神經元免受損傷、抑制腦內炎癥發(fā)生的作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)膽南星通過上調GABAAR蛋白發(fā)揮抗驚厥作用,其機制也可能與調節(jié)神經遞質系統(tǒng)有關,課題組后續(xù)將繼續(xù)對膽南星抗熱性驚厥機制開展進一步研究。

本實驗研究結果表明膽南星具有抗熱性驚厥的藥效作用,但關于膽南星中的效應物質仍然有待深入探討。課題組前期研究表明膽南星中含有大量膽酸類成分[19],Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)膽酸類成分抗熱性驚厥的機制可能與抑制腦內炎癥發(fā)生相關。因此,膽酸類成分是否作為膽南星拮抗腦組織炎癥反應的主要物質基礎,后續(xù)將基于本研究構建的動物模型及研究結果進行深入研究。