Foxl2基因在蝦夷扇貝發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析*

趙 丹 周麗青 鄭言鑫 孫秀俊 吳 彪 劉志鴻 吳 宙,3 吳 磊,4

基因在蝦夷扇貝發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析*

趙 丹1,2周麗青1,2①鄭言鑫5孫秀俊2吳 彪2劉志鴻2吳 宙2,3吳 磊2,4

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 3. 浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 浙江 舟山 316022； 4. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇 連云港 222005； 5. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長島增殖實(shí)驗(yàn)站 山東 煙臺(tái) 265800)

是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor,)基因家族的重要成員之一，在卵巢發(fā)育和性別調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。為探究在蝦夷扇貝()性腺發(fā)育中的表達(dá)調(diào)控模式，利用生物信息學(xué)方法分析了蝦夷扇貝的序列特征；采用半定量PCR(RT-PCR)檢測了在不同組織中的表達(dá)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和原位雜交技術(shù)(ISH)揭示了在性腺發(fā)育4個(gè)時(shí)期(增殖期、生長期、成熟期和排放期)的時(shí)空表達(dá)變化。結(jié)果顯示，蝦夷扇貝序列包含基因家族共有的FH結(jié)構(gòu)域；多重序列比較分析顯示，蝦夷扇貝與櫛孔扇貝()、歐洲大扇貝()的相似性最高，分別為98%、96%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，在不同物種以及進(jìn)化的過程中，基因具有較高的保守性。定量分析和原位雜交結(jié)果顯示，原位雜交陽性信號(hào)主要定位在生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在蝦夷扇貝的鰓、腎、肝胰腺、精巢中，都可檢測到少量轉(zhuǎn)錄本的存在，在卵巢中表達(dá)量最高，且在卵巢成熟期達(dá)到最高值。隨著性腺發(fā)育和精細(xì)胞的逐級(jí)分化，的表達(dá)量呈下降趨勢，這與原位雜交的結(jié)果一致。研究表明，在蝦夷扇貝卵巢發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用，推測其是雌性蝦夷扇貝性腺發(fā)育調(diào)控中的關(guān)鍵基因，可為今后闡明其在蝦夷扇貝性別分化進(jìn)程中的功能提供理論依據(jù)。

蝦夷扇貝；；熒光定量PCR；原位雜交；性腺發(fā)育

是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor,)超家族的成員之一，主要在垂體和卵巢中表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)其目的靶基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)，參與生殖細(xì)胞的增殖與分化，在動(dòng)物卵巢發(fā)育和維持中發(fā)揮重要作用(Uhlenhaut, 2011)，與卵巢生殖細(xì)胞分化和卵巢功能的維持密切相關(guān)(Ellsworth, 2006; Boulanger, 2014)。

迄今為止，基因功能的深入研究集中在脊椎動(dòng)物和部分無脊椎動(dòng)物，且結(jié)構(gòu)高度保守。是脊椎動(dòng)物卵巢分化的特異性標(biāo)志物(Alam, 2008)。據(jù)報(bào)道，在蛙()卵巢分化的早期起關(guān)鍵作用(Oshima, 2008)；是山羊()雌性性別決定因子(Boulanger, 2014)；的失活會(huì)導(dǎo)致小鼠()卵巢發(fā)育異常(Escalier, 2002)；同時(shí)，敲除和會(huì)導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出由雌性逆轉(zhuǎn)為雄性的特征(Ottolenghi, 2008)。在雄性雞()胚性腺中的錯(cuò)誤表達(dá)抑制了睪丸發(fā)育途徑(Major, 2019)。以上研究表明，在脊椎動(dòng)物卵巢中特異性表達(dá)，對(duì)卵巢的發(fā)育起著重要作用。相對(duì)于脊椎動(dòng)物，基因在無脊椎動(dòng)物的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，主要在櫛孔扇貝()和長牡蠣()的性腺和唇瓣中表達(dá)，其中，處于生長期卵巢的表達(dá)量是精巢的8倍(劉曉玲, 2012; Naimi, 2009)。在三角帆蚌()中，主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞中，與哺乳動(dòng)物相似(葉容暉等, 2018)。

蝦夷扇貝()因其多樣的性別表現(xiàn)形式被認(rèn)為是確定動(dòng)物性別分化相關(guān)基因的最佳研究對(duì)象。蝦夷扇貝隸屬于瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)，是我國北方重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種。已有相關(guān)研究表明，在扇貝雌性性腺中含量豐富(Li, 2018)，可能是扇貝性別決定和分化的關(guān)鍵候選基因(Li, 2016)。但對(duì)于蝦夷扇貝基因在性腺發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)模式尚未見有詳細(xì)的報(bào)道。為進(jìn)一步了解在蝦夷扇貝性腺發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)特征，本研究克隆了蝦夷扇貝cDNA編碼區(qū)序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并觀察其組織表達(dá)規(guī)律，旨在為在蝦夷扇貝性腺發(fā)育過程中的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用貝為2齡蝦夷扇貝，購自山東煙臺(tái)長島生鮮市場，性腺生殖周期包含增長期、生長期、成熟期和排放期共4個(gè)時(shí)期，體重為(73.34±20.50) g。選取正常進(jìn)食、排便的個(gè)體，取扇貝部分性腺組織用于RNA提取和組織分布檢測，部分性腺組織浸入原位雜交固定液(Servicebio, 中國)中。組織切片法結(jié)合性腺組織涂片法鑒定性別。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

取大約50 mg冷凍的性腺組織，在研缽中用液氮充分研磨。采用Trizol法提取蝦夷扇貝性腺總RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific, 美國)檢測其純度與濃度，選取OD260 nm/280 nm值在1.90～2.2范圍、RNA濃度>1000 ng/μL的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RNA鑒定合格后，采用HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(Vazyme, 中國)并參照說明書合成cDNA。–20℃保存。

1.3 Foxl2基因的生物學(xué)分析

蝦夷扇貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的基因編碼序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果顯示，與蝦夷扇貝的(登錄號(hào)：XM_021497746)完全吻合，命名為。

采用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)確定的開放閱讀框。在線分析軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode. cgi?NORMAL=1)預(yù)測結(jié)構(gòu)和功能域。使用SignalP 5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測PyFoxl2蛋白的信號(hào)肽，并使用TMHMM 2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測跨膜區(qū)域。使用BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)對(duì)進(jìn)行堿基同源性分析，并進(jìn)行蛋白質(zhì)序列相似性搜索。使用swiss model (https://swissmodel. expasy.org/)預(yù)測蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過Jalview比對(duì)來自不同物種的序列，并使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 半定量RT-PCR

根據(jù)所獲得的mRNA轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物Foxl2-F和Foxl2-R (表1)。以蝦夷扇貝生長期的cDNA為模板，使用2×Master Mix for PAGE試劑盒(Vazyme, 中國)對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 3 min (預(yù)變性)；95℃ 15s，60℃ 15 s (退火)，循環(huán)35次；72℃ 5 min (徹底延伸)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因。

1.5 熒光定量

根據(jù)開放閱讀框ORF (open reading frame)設(shè)計(jì)定量qRT-PCR引物：QFoxl2-F和QFoxl2-R。使用基因(鮑相渤等, 2011)作為內(nèi)參基因校正cDNA模板(表1)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

Tab.1 Primers used in this experiment

分別以蝦夷扇貝不同發(fā)育時(shí)期的性腺cDNA為模板對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。使用ChamQ SYBR Color qPCR master mix試劑盒(Vazyme, 中國)按照下列參數(shù)配制qPCR反應(yīng)體系：2× ChamQ STBR Color qPCR master mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，50× ROX reference dye 1 0.4 μL，滅菌蒸餾水6.8 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s(預(yù)變性)；95℃ 10 s，60℃ 30 s (退火)，循環(huán)40次；在StepOnePlusTM(美國)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每次反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，各個(gè)樣品3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采取2–ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。利用Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.6 原位雜交

根據(jù)基因的ORF區(qū)設(shè)計(jì)原位雜交探針YFoxl2。取部分性腺組織，切成2 mm左右的厚度，用滅菌的鑷子置于原位雜交液中常溫固定24 h用于切片處理。正式原位雜交步驟：固定的組織經(jīng)石蠟切片后依次放入二甲苯Ⅰ 15 min–二甲苯Ⅱ 15 min–無水乙醇Ⅰ 5 min–無水乙醇Ⅱ 5 min–85%酒精5 min –75%酒精5 min–DEPC水洗。用胃蛋白酶處理，使靶核酸片段暴露，預(yù)雜交緩沖液(不含探針和硫酸葡聚糖)37℃孵育1 h，接著滴加含探針的雜交液，55℃雜交過夜。進(jìn)行非特異結(jié)合探針的洗脫和殘余RNA的消化后，用BSA(bovine serum albumin)封閉非特異性抗體1 h，滴加鼠抗地高辛標(biāo)記488(anti-DIG-488)進(jìn)行抗體孵育37℃ 40 min，洗滌，最后顯色液(DAPI)進(jìn)行顯色，于尼康正置熒光顯微鏡(日本)下觀察并采集圖像。

圖1 PyFoxl2叉頭保守區(qū)推測的三維結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

2.1 PyFoxl2序列分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，ORF序列長度為1107 bp，編碼368個(gè)氨基酸。存在保守的FH結(jié)構(gòu)域(128～218 bp)；FH結(jié)構(gòu)域存在一個(gè)疑似核定位信號(hào)序列(nuclear localization signal sequence) RRRRMRR。PyFoxl2蛋白無信號(hào)肽，不存在明顯的跨膜區(qū)域。因此，推測其為一個(gè)胞內(nèi)蛋白，不屬于膜蛋白。

2.2 PyFoxl2空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用Swiss-Model同源建模服務(wù)器預(yù)測了PyFoxl2蛋白三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，該蛋白保守區(qū)主要由3個(gè)α螺旋、4個(gè)β折疊和2個(gè)翼狀結(jié)構(gòu)組成(圖1)。

2.3 PyFoxl2氨基酸序列同源性及進(jìn)化樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫里選擇7個(gè)代表性的物種的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PyFoxl2與軟體動(dòng)物的氨基酸序列相似度較高，其中，與櫛孔扇貝、歐洲大扇貝()的相似性最高，分別為98%、96%，與美洲牡蠣()的相似性為73% (圖2)。

為了了解在不同物種中的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法對(duì)18個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，軟體動(dòng)物聚為一支，無脊椎動(dòng)物軟體動(dòng)物聚為一支,節(jié)肢動(dòng)物門單獨(dú)分出一支。其中，蝦夷扇貝先與櫛孔扇貝、長牡蠣、合浦珠母貝()等聚為一支，這顯示它們的親緣關(guān)系較近，形成的獨(dú)立分支再與三角帆蚌聚為一支，最后與脈紅螺()聚為一支，為軟體動(dòng)物門(Mollusca)(圖3)。

圖2 蝦夷扇貝Foxl2與其他物種的同源性序列比對(duì)

橫線為FH結(jié)構(gòu)域，紅色的框?yàn)楹硕ㄎ恍盘?hào)序列

物種NCBI登錄號(hào)。櫛孔扇貝：AFB35647.1；合浦珠母貝：QBX88970.1；美洲牡蠣：XP_022345405.1；歐洲大扇貝：XP_033724493.1；加州雙斑蛸：XP_014785648.1；蝦夷扇貝：XP_021353421.1；皺紋盤鮑：AWV50516.1。

橫線為DM結(jié)構(gòu)域，紅色的框?yàn)楹硕ㄎ恍盘?hào)序列

Species NCBI Login No.: AFB35647.1;: QBX88970.1;: XP_022345405.1;: XP_033724493.1;: XP_014785648.1;: XP_021353421.1;: AWV50516.1

The horizontal line is the forkhead domain, and the red box is the nuclear localization signal sequence

2.4 PyFoxl2在各組織中的表達(dá)

RT-PCR分析在蝦夷扇貝生長期不同組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在鰓、腎、肝胰腺中都可檢測到少量轉(zhuǎn)錄本的存在，但在外套膜、閉殼肌中未見表達(dá)。在卵巢中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量顯著高于精巢(圖4)。

2.5 PyFoxl2在性腺發(fā)育不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

通過qRT-PCR分析構(gòu)建了在蝦夷扇貝性腺發(fā)育的時(shí)空表達(dá)模型。結(jié)果顯示，在精巢的性腺發(fā)育周期中呈下降趨勢；在卵巢中呈先上升后下降的趨勢，其中，在成熟期達(dá)到最大值(圖5)。

2.6 PyFoxl2 mRNA在性腺組織中的細(xì)胞學(xué)定位

原位雜交結(jié)果顯示，定位于所有生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在卵巢中，與陰性對(duì)照組相比，mRNA在各時(shí)期的性腺分化細(xì)胞中均檢測到陽性信號(hào)。其中，卵原細(xì)胞的陽性信號(hào)最弱(圖6A1～A2)。卵巢增殖期的陽性信號(hào)弱于生長期和成熟期。在精巢中，與陰性對(duì)照組相比，在精原和精母細(xì)胞中的表達(dá)呈陽性。在成熟期精巢中，陽性信號(hào)隨著生殖細(xì)胞的分化而逐漸減弱，精子中沒有檢測到信號(hào)(圖6B1～B4)。

圖3 不同物種Foxl2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 PyFoxl2在不同組織中的表達(dá)

1：DL 2000 marker；2：去離子水；3：鰓；4：外套膜； 5：腎；6：肝胰腺；7：閉殼??；8：卵巢；9：精巢

1: DL 2000 marker; 2: Deionized water; 3: Gill; 4: Mantle; 5: Kidney; 6: Hepatopancreas; 7: Adductor muscle; 8: Ovary; 9: Testis

圖5 PyFoxl2在蝦夷扇貝性腺發(fā)育的時(shí)空表達(dá)模式

3 討論

本研究分析了的序列，發(fā)現(xiàn)其含有基因家族的FH保守結(jié)構(gòu)域序列特征。家族都含有一個(gè)叉頭樣DNA結(jié)合區(qū)域，該叉頭結(jié)構(gòu)由90個(gè)氨基酸組成(曲中玉等, 2006)，包含3個(gè)α螺旋、4個(gè)β折疊和2個(gè)翼狀結(jié)構(gòu)。其α螺旋與靶基因DNA雙螺旋大溝結(jié)合，其β折疊則與小溝結(jié)合(Fan, 2011)，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。Foxl2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白只有通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，才能發(fā)揮其調(diào)控作用，而核定位信號(hào)序列是核內(nèi)功能蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是一些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的必要片段。通過序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在蝦夷扇貝中發(fā)現(xiàn)的疑似核定位信號(hào)為RRRRRMRR，不同物種Foxl2的叉頭框保守區(qū)都存在這個(gè)核定位信號(hào)序列。人() Foxl2蛋白也在保守區(qū)的C端具有一段精氨酸和賴氨酸區(qū)(RRRRRMKR)，即Foxl2蛋白的細(xì)胞核定位信號(hào)序列，參與該蛋白由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的調(diào)控(Beysen, 2008)，該區(qū)域序列的突變將導(dǎo)致Foxl2轉(zhuǎn)錄因子不能順利地進(jìn)行亞細(xì)胞定位，只能聚集在細(xì)胞核外，影響其功能的正常發(fā)揮。蝦夷扇貝Foxl2轉(zhuǎn)錄因子的疑似核定位信號(hào)如何引導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并發(fā)揮功能有待今后進(jìn)一步探討。

對(duì)于不同物種的比較表明，主要在卵巢中表達(dá)。除此之外，有學(xué)者在硬骨魚類的腦垂體和鰓中檢測到少量的表達(dá)，并認(rèn)為在腦–垂體–性腺軸中具有潛在的作用(Alam, 2008; Wang, 2004)。本研究通過RT-PCR在蝦夷扇貝鰓、腎和肝胰腺中都檢測到轉(zhuǎn)錄本的存在。也有學(xué)者在三角帆蚌的研究中發(fā)現(xiàn)，在性腺、鰓、閉殼肌、足部、外套膜和腎臟中均有表達(dá)，在卵巢的表達(dá)水平顯著高于精巢(Wang, 2020)。在櫛孔扇貝的肝胰腺有微弱的表達(dá)(劉曉玲, 2012)。以上研究提示，基因功能不僅限于性腺和腦垂體方面，可能在其他組織中也具有一定的功能。

圖6 PyFoxl2在蝦夷扇貝性腺發(fā)育不同時(shí)期的細(xì)胞學(xué)定位

A：卵巢；B：精巢；1：增殖期；2：生長期；3：成熟期；4：陰性對(duì)照

Mo：成熟卵；Oc：卵母細(xì)胞；Og：卵原細(xì)胞；Sc：精母細(xì)胞；Sg：精原細(xì)胞；St：精細(xì)胞；Sz：精子

A: Ovary; B: Testis; 1: Proliferation stage; 2: Growing stage; 3: Mature stage; 4: Negative control;

Mo: Mature eggs; Oc: Oocyte; Og: Oogonium; Sc: Spermatocyte; Sg: Spermatogonium; St: Sperm cells; Sz: Sperm

Loffler等(2003)研究認(rèn)為，小鼠在性別決定后，的表達(dá)立即上調(diào)，促進(jìn)卵巢分化。本研究通過對(duì)蝦夷扇貝性腺發(fā)育不同時(shí)期的時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢增殖期到生長期的表達(dá)量顯著增加，維持在成熟期，而處于增殖期的蝦夷扇貝性腺幾乎可以判斷出性別(高悅勉等, 2007)。因此，推斷可能也是在蝦夷扇貝性別決定后表達(dá)上調(diào)。在精巢中，其表達(dá)量整體呈下降趨勢。這個(gè)研究結(jié)果與長牡蠣中的相一致，在長牡蠣性腺中，生長期卵巢的表達(dá)量是精巢的8倍(Naimi, 2009)。長牡蠣性腺是一個(gè)季節(jié)性發(fā)育的非持續(xù)表達(dá)的器官，配子每年從生殖細(xì)胞開始增殖、分化、成熟。隨著性腺小管的生長和分支，它們通過周圍的結(jié)締組織擴(kuò)散，然后，結(jié)締組織退化(Berthelin, 2001; Fabioux, 2004)。在蝦夷扇貝卵巢中的表達(dá)量隨著性腺的發(fā)育呈先上升后下降的趨勢，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明基因的表達(dá)與卵細(xì)胞分化息息相關(guān)。而原位雜交陽性信號(hào)變化驗(yàn)證了在卵巢發(fā)育中的周期性表達(dá)變化。此外，通過原位雜交定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)，僅定位在蝦夷扇貝的生殖細(xì)胞中，在成熟卵和卵母細(xì)胞中均檢測到強(qiáng)陽性信號(hào)；隨著雄性生殖細(xì)胞的逐級(jí)分化，陽性信號(hào)減弱。這個(gè)結(jié)果也與長牡蠣的一致，Naimi等(2009)認(rèn)為這一結(jié)果可能提示基因在長牡蠣精巢發(fā)育成熟過程中也有一定的作用。而在櫛孔扇貝中，不僅定位在生殖細(xì)胞中，在體細(xì)胞中也有陽性信號(hào)(劉曉玲, 2012)。由此推測，對(duì)蝦夷扇貝卵巢發(fā)育的調(diào)控起更重要的作用。

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Expression Pattern of theGene in the Scallopduring Development

ZHAO Dan1,2, ZHOU Liqing1,2①, ZHENG Yanxin5, SUN Xiujun2, WU Biao2, LIU Zhihong2, WU Zhou2,3, WU Lei2,4

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China; 3. National Engineering Research Center for Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan, Zhejiang 316022, China; 4. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang, Jiangsu 222005, China; 5. Changdao Enhancement and Experiment Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Yantai, Shandong 265800, China)

an important member of the(forkhead transcription factor) gene family, plays an important role in ovarian development and sex regulation. To explore the mode of expression regulation in the sex differentiation of the scallop, we analyzed thegene sequence characteristics ofusingbioinformatics methods, and the expression ofin different tissues was detectedsemi-quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Quantitative RT-PCR andhybridization revealed the temporal and spatial expression changes ofin the four stages of gonadal development (proliferation, growth, maturation, and emission stage). The results showed that thesequence ofcontains the FH domain shared by thegene family, and the multiple sequence comparison analysis showed thathas the highest similarity withand(98% and 96%, respectively). The phylogenetic tree analysis showed that thegene is highly conserved in different species and in the process of evolution. The results of the quantitative analysis andhybridization showed that the positive signal of thehybridization was mainly located in the cytoplasm of the germ cells. A small amount oftranscripts were detected in the gills, kidneys, hepatopancreas, and testes. The expression level ofwas the highest in the ovary and peaked in the mature stage of the ovary. In contrast, with the development of the testis and the gradual differentiation of the male gametes, the expression ofshowed a declining trend, which is consistent with the results of thehybridization. In conclusion,may play a key role in the ovarian development of. It is a key gene in the regulation of sex differentiation in female. This study provides a theoretical basis for advancing our understanding of the sex differentiation and gonadal development of.

;; Real-time quantitative PCR;hybridization; Gonadal development

S917

A

2095-9869(2022)03-0138-08

10.19663/j.issn2095-9869.20210315001

http://www.yykxjz.cn/

趙丹, 周麗青, 鄭言鑫, 孫秀俊, 吳彪, 劉志鴻, 吳宙, 吳磊.基因在蝦夷扇貝發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(3): 138–145

ZHAO D, ZHOU L Q, ZHENG Y X, SUN X J, WU B, LIU Z H, WU Z, WU L. Expression pattern of thegene in the scallopduring development. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 138–145

ZHOU Liqing, E-mail: zhoulq@ysfri.ac.cn

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31672637)、浙江重中之重開放課題(KF2018008)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFD0900800)共同資助 [This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31672637), Zhejiang Provincial Top Discipline of Bioengineering of China (KF2018008), and National Key Research and Development Program of China (2018YFD0900800)]. 趙 丹，E-mail: 1282095341@qq.com

周麗青，副研究員，E-mail: zhoulq@ysfri.ac.cn

2021-03-15,

2021-04-15

(編輯 馮小花)