響應(yīng)面法對青稞紅曲中兩種Monacolin K 的提取工藝優(yōu)化

譚友莉，馬云桐，黃 鳳，文 靜，余志芳，歐 泉

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

青稞紅曲是紅曲霉屬真菌接種于青稞上發(fā)酵而成的一種麥曲。其含有的Monacolin K(即洛伐他汀)成分是對3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶起抑制作用的物質(zhì)［1］，具有降血壓、降血脂、減少動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、防治冠心病等作用［2，3］。在紅曲中Monacolin K 以開環(huán)的酸型和內(nèi)酯型兩種形態(tài)存在［4］。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)酸型Monacolin K 因能被人體直接吸收，發(fā)揮降脂作用，減少了肝、腎負(fù)擔(dān)，而優(yōu)于需在體內(nèi)水解轉(zhuǎn)化為開環(huán)型發(fā)揮藥效的內(nèi)酯型Monacolin K［5］。因此，有效提取青稞紅曲中Monacolin K，并準(zhǔn)確測定其兩種形態(tài)的含量和比例，對開發(fā)該藥物資源和體現(xiàn)其降脂作用具有重要意義。本文采用超聲提取法，用響應(yīng)面法對主要影響因子提取時(shí)間、溫度和料液比之間的單一和交互作用等進(jìn)行了較深入的研究，得出最佳提取青稞紅曲中Monacolin K 的工藝參數(shù)，并采用HPLC 法同時(shí)測定內(nèi)酯型和酸型Monacolin K 的含量及比例，為青稞紅曲中Monacolin K 的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

圖1 酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of acid form and lactone form of Monacolin K

1 材料與儀器

1.1 材料

青稞紅曲(批號:20140605):由西藏月王生物技術(shù)有限公司提供。甲醇、乙腈為色譜純［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］，磷酸、氫氧化鈉為分析純(成都市科龍化工試劑廠)，內(nèi)酯型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品(C24H36O50，99.4%，批號:100600- 201003;中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(G1322A 溶劑脫氣器，G1311A 四元泵，G1315C 二極管陣列檢測器);十萬分之一天平［賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司］;JA1003 千分之一天平(上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司);KQ5200E 超聲清洗器機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);DZKW-4 電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃，流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸水(60∶40，v/v)，流速1.0 mL/min，檢測波長:238 nm，參比波長(400 nm)，進(jìn)樣量:10 μL，樣品經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用HPLC 法測定。

2.2 對照品溶液及樣品溶液的制備

2.2.1 內(nèi)酯型Monacolin K 對照品

精密稱定Monacolin K(內(nèi)酯)標(biāo)準(zhǔn)品10.18 mg加入甲醇定容至100 mL，搖勻，作為內(nèi)酯型洛伐他汀對照品溶液。HPLC 檢測內(nèi)酯型洛伐他汀保留時(shí)間在15.862 min。

2.2.2 酸型Monacolin K 對照品

稱取Monacolin K(內(nèi)酯)標(biāo)準(zhǔn)品20.10 mg，用含20%甲醇pH=12 的氫氧化鈉溶液定容至100 mL，在50 ℃條件下超聲轉(zhuǎn)化1 h 自然冷卻至室溫。HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換后的酸型Monacolin K 只有一個(gè)峰，保留時(shí)間在8.673 min。

2.2.3 樣品溶液的制備

取青稞紅曲粉末(過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置100 mL 磨口錐形瓶，加20 mL 純甲醇，稱定重量，50 ℃超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用純甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍

精密吸取0.2010 mg/mL 酸型和0.1018 mg/mL內(nèi)酯型Monacolin K 對照品溶液2、5、10、15、20 μL，每個(gè)濃度進(jìn)樣3 次。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:內(nèi)酯型Monacolin K:Y=78.137X-26.171，相關(guān)系數(shù)r=0.9999;酸型Monacolin K:Y=25.484X+2.3171，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。表明酸型Monacolin K 在40～300 mg/L 和內(nèi)酯型Monacolin K 在10～200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 分離度實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.2 項(xiàng)樣品溶液和對照品溶液，按照2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，如圖2，在樣品中兩種Monacolin K 出峰時(shí)間和兩種Monacolin K 標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間吻合。在樣品中內(nèi)酯型Monacolin K 和酸型Monacolin K 分離度良好，且需要的色譜峰附近不存在干擾峰，兩種類型Monacolin K 分離情況如下圖2所示。

圖2 樣品中酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 的分離圖Fig.2 HPLC chromatogram of highland barley Monascus

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對照品溶液，按上述2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄酸型Monacolin K 和內(nèi)酯型Monacolin K 峰面積，結(jié)果酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 峰面積的RSD 分別為0.63%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.2.3 項(xiàng)重復(fù)制備6 份同一供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算，得酸型Monacolin K平均含量為0.26%，RSD 為0.53%，內(nèi)酯型Monacolin K 平均含量為0.15%，RSD 為1.26%。結(jié)果說明，該檢測條件重復(fù)性良好，滿足樣品檢測的需要。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在1、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，記錄酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 峰面積，結(jié)果酸型Monacolin K RSD 為0.83%，內(nèi)酯型Monacolin K RSD 為1.12%，表明在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量青稞紅曲樣品6 份，加入一定量酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行回收試驗(yàn)。酸型Monacolin K 的平均回收率為99.6%，RSD 為0.24%;內(nèi)酯型Monacolin K 的平均回收率為98.4%，RSD 為0.71%。

2.4 兩種Monacolin K 提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，先通過單因素實(shí)驗(yàn)選出對青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取得率具有顯著影響的因素，并確定其試驗(yàn)水平。本文稱取1.0 g青稞紅曲，考察不同濃度甲醇(45%、55%、65%、75%、85%、100%)，提取溫度(40、50、60、70、80℃)，提取時(shí)間(10、30、60、90、120 min)，液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取得率的影響。

2.5 兩種Monacolin K 提取響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取溫度(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)等對兩種Monacolin K 提取影響顯著的3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3 因素3 水平的響應(yīng)面分析方法。具體試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

采用Design-Expert 8.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程。多項(xiàng)式模型方程擬合可靠性R2越接近1，則多項(xiàng)式模型與實(shí)際擬合可靠性越高，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F 值檢驗(yàn)，F(xiàn) 值越大表明該變量對因變量的影響越顯著;因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P 值檢驗(yàn)，概率P 值越小，則相應(yīng)的顯著程度越高，P＜0.01 時(shí)影響為極顯著，P＜0.05 影響顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溶劑對青稞紅曲中兩種Monacolin K 得率的影響

設(shè)定提取溫度50 ℃，液固比20∶1 mL/g，超聲提取2 h，分別以45%、55%、65%、75%、85%、100%不同濃度甲醇作為提取溶劑，測定兩種Monacolin K 的峰面積。結(jié)果表明，甲醇濃度越高兩種Monacolin K 提取得率越高。使用純甲醇提取溶液所得的酸型Monacolin K 的平均得率為0.233%;內(nèi)酯型Monacolin K 平均得率為0.153%。采用純甲醇提取樣品，色素含量低，能保護(hù)柱子;不需要蒸干溶劑再定容，過濾容易;因不含水，酸型和內(nèi)酯型Monacolin K 穩(wěn)定性更好，含量更確定可靠。故采用純甲醇提取青稞紅曲種兩種Monacolin K。

3.1.2 提取溫度對青稞紅曲中兩種Monacolin K 的得率的影響

設(shè)定純甲醇為提取溶劑，液固比為20∶1 mL/g，超聲提取時(shí)間為2 h 條件下，在40、50、60、70、80℃溫度下，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結(jié)果表明在60 ℃左右時(shí)，兩種Monacolin K 的得率達(dá)到最值。因此選擇溫度為60 ℃左右為宜。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of Monacolin K

3.1.3 液固比對青稞紅曲中Monacolin K 的得率的影響

設(shè)定在60 ℃下，純甲醇為提取溶劑，超聲提取時(shí)間為2 h，以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)液固比，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結(jié)果表明液固比為20∶1 mL/g 附近時(shí)兩種Monacolin K的得率達(dá)到最值之后提取得率略有下降。因此液固比選擇在20∶1 mL/g 左右。

由于不帶蓄電池備電，所以在沒有市電的情況下，這種供電方式不能為信號源提供電能。綜上所述，直流輸入不帶備電的方案比較適合于信號源為直流輸入，對服務(wù)要求不高的場景。

圖4 液固比對得率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of Monacolin K

3.1.4 超聲提取時(shí)間對青稞紅曲中Monacolin K 的得率的影響

設(shè)定60 ℃下，以純甲醇為提取溶劑，液固比20∶1 mL/g，分別提取10、30、60、90、120 min，分別測定兩種Monacolin K 的峰面積，結(jié)果表明，兩種Monacolin K 得率隨時(shí)間的增長呈上升趨勢，60 min 附近達(dá)到最大之后趨于平緩，為減少能耗，節(jié)約時(shí)間，提取時(shí)間選擇在60～70 min 之間。

圖5 提取時(shí)間對得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on the extraction yield of Monacolin K

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取工藝

3.2.1 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

對兩種Monacolin K 提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design arrangement and the experimental results

采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，得到Monacolin K 得率Y 對提取溫度A、液固比B、提取時(shí)間C 的二次多項(xiàng)回歸模型:

酸型Monacolin K 得率:Y1=2.47-0.0025A+0.041B+0.069C-0.050AB-0.020AC+0.052BC-0.096 A2-0.11B2-0.22C2

內(nèi)酯型Monacolin K 得率:

各因素的方差分析見表3、4。

表3 酸型Monacolin K 提取的二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model of extracting acid form Monacolin K

表4 內(nèi)酯型Monacolin K 提取的二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model of extracting lactone form Monacolin K

從表3 可以看出，Y1模型P=0.0003＜0.01，此時(shí)Y1回歸模型極其顯著，表明該試驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)P=0.1015＞0.05，檢驗(yàn)為不顯著，說明Y1回歸模型與實(shí)測值能較好的擬合。Y1模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9656，表明可信度良好;=0.9213，說明92.13%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋。綜上，Y1模型可以對酸型Monacolin K 提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。從F 值可以看出，影響酸型Monacolin K 得率的各因素按影響大小排序依次為C(提取時(shí)間)、B(液固比)、A(提取溫度)，其中C 達(dá)到極顯著水平。

從表4 可以看出，Y2模型P=0.0001＜0.01，此時(shí)Y2回歸模型極其顯著，表明該試驗(yàn)方法可靠。失擬項(xiàng)P=0.1239＞0.05，檢驗(yàn)為不顯著，說明Y2回歸模型與實(shí)測值能較好的擬合。Y2模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9737，表明可信度良好;=0.9399，說明93.99%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋。綜上，Y2模型可以對內(nèi)酯型Monacolin K 提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。從F 值可以看出，影響內(nèi)酯型Monacolin K得率的各因素按影響大小排序依次為C(提取時(shí)間)、B(液固比)、A(提取溫度)，其中C 幾乎達(dá)到極顯著水平。

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，從中分析提取溫度、液固比和提取時(shí)間對Monacolin K 得率的影響，結(jié)果見圖6、7。

對于Y1模型:由圖6 和表3 可以觀察到，液固比和超聲提取時(shí)間對應(yīng)的酸型洛伐他汀Monacolin K 得率響應(yīng)曲面為開口向下的凸形曲面，隨著因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。且只有BC 的P=0.0491＜0.05，所以說明液固比和超聲提取時(shí)間之間有較強(qiáng)的交互作用，其余各因素間的交互作用不明顯。

圖6 提取溫度和液固比(A)、提取溫度和超聲提取時(shí)間(B)及液固比和超聲提取時(shí)間(C)對酸型Monacolin K 得率影響的等高線圖和響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of acid form Monacolin K

圖7 提取溫度和液固比(A)、提取溫度和超聲提取時(shí)間(B)及液固比和超聲提取時(shí)間(C)對內(nèi)酯型Monacolin K 得率影響的等高線圖和響應(yīng)面Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of lactone form Monacolin K

對于Y2模型:由圖7 和表4 可以觀察到，液固比和超聲提取時(shí)間對應(yīng)的內(nèi)酯型洛伐他汀Monacolin K 得率響應(yīng)曲面為開口向下的凸形曲面，隨著因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。且只有BC 的P=0.0255＜0.05，所以說明液固比和超聲提取時(shí)間之間有較強(qiáng)的交互作用，其余各因素間的交互作用不明顯。

3.2.2 青稞紅曲中兩種Monacolin K 提取工藝條件

通過軟件中Optimization 的Numerical 功能，優(yōu)化提取青稞紅曲中Monacolin K 的理論最佳工藝為:提取溫度為59.77 ℃，液固比為20.94∶1 mL/g，提取時(shí)間為64.70 min，酸式洛伐他汀Monacolin K 最大得率預(yù)測值為2.48134 mg/g，內(nèi)酯型洛伐他汀Monacolin K 最大得率預(yù)測值為1.66217 mg/g。為檢驗(yàn)RSA 法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行Monacolin K 提取試驗(yàn)。為操作便利，將最佳條件修正為提取溫度為60 ℃，液固比為20∶1 mL/g，提取時(shí)間為60 min，實(shí)際測得青稞紅曲中酸型Monacolin K得率2.51 mg/g，內(nèi)酯型Monacolin K 得率1.65 mg/g。結(jié)果證明，Monacolin K 得率與理論預(yù)測值相當(dāng)，故優(yōu)化方案得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

響應(yīng)面法克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值和不能給出直觀圖形，并無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷［6-9］。本文采用響應(yīng)面法研究青稞紅曲中Monacolin K 提取工藝參數(shù)，并通過響應(yīng)面圖直觀分析了各因素及因素之間對青稞紅曲中Monacolin K 得率的影響，優(yōu)化提取青稞紅曲中Monacolin K 的理論最佳工藝為:提取溫度為59.77 ℃，液固比為20.94∶1 mL/g，提取時(shí)間為64.70 min。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)對最佳工藝進(jìn)行修正確定最佳提取條件:以純甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間為1 h，液固比20∶1 mL/g，提取溫度60 ℃，得到青稞紅曲中酸型Monacolin K 得率為2.51 mg/g，內(nèi)酯型Monacolin K 得率為1.65 mg/g。此外，本文建立了HPLC 測定青稞紅曲中兩種Monacolin K 含量的方法，該方法克服了以往多數(shù)研究只測定紅曲中Monacolin K 總量或只檢測內(nèi)酯型Monacolin K 含量，從而忽視二者比例的缺陷，不能較好體現(xiàn)青稞紅曲的降脂價(jià)值［10-12］。通過本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了青稞紅曲中Monacolin K 提取工藝及含量測定方法，為青稞紅曲中Monacolin K 的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

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