HPLC測定燈芯炭煅制過程中二種菲類化合物的含量變化*

李 軍,孫云峰,劉 麗,袁 媛,范 穎,鄭大勇

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110032；2 華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063210)

燈心草藥材為燈心草科植物燈心草(JuncuseffususL.)的干燥莖髓，其體輕，質(zhì)軟，略有彈性，易拉斷，斷面白色。該藥氣微，味淡，微寒，歸心、肺、小腸經(jīng)，能清心火，利小便，用于心煩失眠，口舌生瘡，尿少澀痛[1]。2020 年版《中國藥典》收錄，燈心炭為燈心草的煅炭品，能涼血止血、清熱斂瘡，可外用治療口瘡、咽痹、乳蛾、陰疳等[1]。燈心炭常用的煅制方法有以下幾種，瓦罐煅法、扣鍋煅法、扣鍋雙面煅法、煅鍋煅法、鐵桶煅法、火燒煅法、青竹煅法[2]。此外，燈芯草所含主要化學(xué)成分為菲類和二氫菲類化合物，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該類成分具有多種生物活性，如抗菌、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗氧化等[3-7]。

燈心草的瓦罐煅法記載于清代劉若金的《本草述》一書中“燈心最難成炭，一燒即過，要能得炭，必緊扎作一把，令堅(jiān)實(shí)塞入罐內(nèi)，固濟(jì)煅之，罐紅為度，待冷取出，方有存性黑炭”[8]。本研究參考上述傳統(tǒng)瓦罐煅法炮制燈心炭，并利用現(xiàn)代加熱控溫儀器和成分分析儀來研究燈芯草煅炭工藝[9-11]。我們利用HPLC技術(shù)建立了同時(shí)測定燈心草中厄弗酚和去氫厄弗酚2種成分的分析方法，來檢測在煅炭過程中它們的含量變化，從而為燈心炭的炮制工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器、試劑與試藥

GW-300C箱式電阻爐，河北慧采科技有限公司；島津LC-20AT，LC solution色譜工作站，SPD-20A紫外檢測器，日本島津；TD-25型電子分析天平，丹佛儀器有限公司； SIMS50000 超純凈水器，美國MILLIPORE；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；KQ-100b型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海精宏。

燈芯草藥材購買于北京同仁堂沈陽大藥房有限公司(批號：20200517，產(chǎn)地：江西上饒)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院孫云峰實(shí)驗(yàn)師鑒定為燈心草植物燈心草JuncuseffususL.的干燥的莖髓；厄弗酚和去氫厄弗酚對照品購買于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(批號：191211和191225，HPLC 純度為99.0%，符合定量要求)；高效液相色譜用水為超純水機(jī)制備，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

1. 2 方 法

1.2.1 藥材的準(zhǔn)備

取燈芯草藥材置于恒溫干燥箱內(nèi)，80 ℃烘干至恒重，放涼，備用。

1.2.2 制備燈芯炭

精密量取2.0 g燈芯草，放入瓦罐中，加蓋后用石膏密封，再將瓦罐放入電阻爐內(nèi)，設(shè)定溫度為300 ℃，爐內(nèi)逐漸升溫至設(shè)定溫度后，開始計(jì)時(shí)，分別在5，10，15，30，60，90 min時(shí)從電阻爐內(nèi)取出瓦罐，自然冷卻至室溫，再將瓦罐內(nèi)的藥材取出，稱重。

1.2.3 HPLC檢測條件

(1)色譜條件。色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流速：1.0 mL/min；檢測波長：289 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸/水溶液(B)，梯度洗脫：0～8 min，40%→40%A；8～18 min，40%→55% A；18～50 min，55%→55% A。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

(2)混合對照品溶液的制備。分別精密稱取對照品厄弗酚(0.0205 g)和去氫厄弗酚(0.0317 g)，加甲醇溶解，并定容于50 mL容量瓶中，搖勻，即為對照品儲備液；再精密吸取上述儲備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，搖勻，即配成含量分別為厄弗酚41.0 μg/mL和去氫厄弗酚63.4 μg/mL的混合對照品溶液，冷藏(4 ℃)，備用。

(3)供試品溶液的制備。取燈芯草2.0 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶中，精密加入200 mL甲醇，稱定總重量并記錄后，超聲處理30 min (功率為250 W，頻率為40 kHz)，取出，放至室溫，稱重，用甲醇補(bǔ)充減失的重量，充分搖勻，吸取100 mL溶液至茄形瓶內(nèi)，然后在50 ℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，再用甲醇將殘?jiān)鼜?fù)溶并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶內(nèi)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液2 mL，即得供試品溶液，備用。

(4)線性關(guān)系考察。分別精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL進(jìn)樣，按照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得出厄弗酚的回歸方程：Y=406610X-97372 (r=0.9997)，其進(jìn)樣量在0.0410～1.025 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；去氫厄弗酚的回歸方程：Y=636224X+30805 (r=0.9992)，其進(jìn)樣量在0.0634～1.5850 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

(5)精密度試驗(yàn)。精密吸取“2.4”項(xiàng)下的混合對照品溶液20 μL，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定厄弗酚和去氫厄弗酚的峰面積值，計(jì)算兩者RSD值分別為0.91%和1.54%，表明儀器的精密度良好。

(6)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密取燈芯草藥材的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定厄弗酚和去氫厄弗酚的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.67%和1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(7)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取燈芯草藥材2.0 g，共6 份，分別按“2.5”項(xiàng)下方法平行操作，制備供試品溶液，以“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果厄弗酚和去氫厄弗酚的RSD 分別為0.96%、1.33%，表明本方法重復(fù)性良好。

(8)加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取燈芯草藥材2.0 g，共6 份，置于具塞三角燒瓶中，再分別精密加入厄弗酚和去氫厄弗酚對照品適量(與2.0 g燈芯草中各成分含量相當(dāng))，按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。分別測得厄弗酚和去氫厄弗酚的平均回收率(n=6)為100.30%和101.27%，RSD值為1.69%和0.91%。見表1。

(9)樣品測定。精密稱取燈芯草及其在各時(shí)間點(diǎn)煅制程度不同的燈芯炭，分別約2.0 g，按照“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.3” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，按“2.6”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算厄弗酚和去氫厄弗酚的含量，結(jié)果見表2、圖2。

表2 燈芯草藥材和其在300 ℃煅炭過程中不同時(shí)間點(diǎn)測得厄弗酚和去氫厄弗酚含量的測定結(jié)果(n=3)

圖2 在300 ℃下不同煅制時(shí)間燈芯草中2種成分變化趨勢圖

2 結(jié)果與討論

2.1 對照品的選擇

厄弗酚和去氫厄弗酚在燈芯草藥材中的含量較高，并且它們在甲醇溶劑中的溶解度也很高；在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，兩者在色譜圖內(nèi)可以得到較好的分離度，所以很適合作為燈芯草藥材的指標(biāo)性成分。

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察多種流動(dòng)相系統(tǒng)，包括甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸/水、甲醇-0.1%醋酸/水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸/水的梯度洗脫系統(tǒng)，測試結(jié)果顯示甲醇-0.1%甲酸/水梯度洗脫可使2種菲類成分均能與雜質(zhì)達(dá)到較好的分離效果。

3 結(jié) 論

中藥的化學(xué)成分較為復(fù)雜，性質(zhì)也不同，在高溫炮制過程中多數(shù)成分都會受熱分解或轉(zhuǎn)化，所含水分及揮發(fā)性成分也逐漸揮散失去。本研究采用HPLC同時(shí)測定燈芯草和在其煅炭過程中二種菲類成分的含量，發(fā)現(xiàn)燈芯草在300 ℃煅炭過程中這兩種成分的含量都發(fā)生降低，厄弗酚和去氫厄弗酚的含量分別在30 min和60 min時(shí)就低于檢出限，而且，通過顏色判斷燈芯草在60 min后便已基本炭化完全。因此，結(jié)合燈芯草中菲類成分的生物活性、藥效差異及其臨床應(yīng)用等因素，需要后續(xù)更深入地研究為燈芯炭的炮制工藝提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。