發(fā)酵雞蛋醬制曲菌種、原料配方及工藝參數(shù)優(yōu)化

王澤琳，仝其根，呂 瑩，王宗義，郭慧園

（1 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京 102206 2 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京 102206 3 蛋品安全生產(chǎn)與加工北京市工程研究中心 北京 102206 4 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102206 5 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

我國(guó)禽蛋的消費(fèi)以鮮蛋為主，傳統(tǒng)加工蛋制品有皮蛋[1]、咸蛋[2]、鹵蛋[3]、醉蛋[4-5]、包咸蛋[6]等。近年來(lái)專(zhuān)用蛋粉、專(zhuān)用液蛋[7]作為食品原輔料產(chǎn)量快速增加，而新型蛋制品如蛋品飲料[8-9]、雞蛋腐乳[10]、臭蛋[11-13]還處于研發(fā)階段。

醬類(lèi)是我國(guó)人民日常調(diào)味食品，豆醬是主要的醬類(lèi)之一。它是將黃豆、黑豆等材料經(jīng)蒸煮等處理，使得原料中的部分蛋白質(zhì)變性，然后利用多種微生物發(fā)酵分解其中的蛋白質(zhì)和糖類(lèi)，經(jīng)一系列生物的、化學(xué)的變化而釀造出的半固體狀調(diào)味品[14]。我國(guó)制醬的常用菌種可分為霉菌[15]、細(xì)菌[16]、酵母菌[17]及乳酸菌[18]4 大類(lèi)。霉菌、細(xì)菌是在制曲階段產(chǎn)生多種酶系，如淀粉酶[19]、蛋白酶[20-21]等，后期將原材料中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)、淀粉等分解成小分子物質(zhì)；酵母菌、乳酸菌則是將這些小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇、酸、酯等，從而形成醬類(lèi)特有風(fēng)味[22]。

本文以全蛋液、面粉、黑豆等為主要原料，仿效黃豆醬的加工技術(shù)，經(jīng)制坯、接種、制曲、發(fā)酵等工藝研發(fā)一種新型半固體狀的發(fā)酵蛋制品——雞蛋醬。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋，北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；黑豆，北京昌平區(qū)永旺超市；面粉，益海（石家莊）糧油工業(yè)有限公司；大豆分離蛋白，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、生香酵母（Aroma-producing yeast）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），康源生物科技有限公司；腐乳曲（Fermented bean curd piece），安琪酵母股份有限公司；藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、五通橋毛霉（Mucor wutungkiao）、米根霉 （Rhizopus oryzae）、魯氏酵母（Saccharomyces rouxii），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；雙歧桿菌（Bifidobacterium），北京川秀科技有限公司。

甲醛溶液（37%），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市華東試劑產(chǎn)；葡萄糖、酚酞，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，北京東方博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；氯化鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、麥芽汁瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯 （不含糖）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、麥芽浸粉肉湯（MEB），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；丙三醇，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sh10A 水分快速測(cè)定儀，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；VD-650-U 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LHS-50CL 恒溫恒濕箱，上海一恒學(xué)儀器有限公司；BPX-82 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；LDZM-80KCS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋醬制作工藝及要點(diǎn) 參照黃豆醬、東北大醬[23]等醬制品的工藝流程和制作技術(shù)，具體方法如下：蛋液→攪拌→過(guò)濾→加“黑豆粉”或“熟面粉”→裝?！糁蟆鋮s→接菌→制曲→加鹽、水拌勻→保溫發(fā)酵→后熟→滅菌→成品。

1）過(guò)濾 將雞蛋去殼，攪拌均勻，用30 目的濾網(wǎng)過(guò)濾，以濾去蛋殼碎片、雞蛋系帶、蛋殼膜、蛋黃膜及其它雜質(zhì)。

2）加“黑豆粉”或“熟面粉” “黑豆粉”是將清洗干凈的黑豆用6～7 倍體積的純凈水浸泡8 h，121 ℃、0.1 MPa 蒸煮20 min，再用大火翻炒30 min，打碎即可?！笆烀娣邸奔唇?jīng)蒸煮或翻炒后的小麥粉。用大火翻炒面粉，直至面粉變色，并有麥香味產(chǎn)生。蛋液中加入“黑豆粉”或“熟面粉”，拌勻，70 ℃水浴加熱，直至該混合液呈黏稠狀。

3）裝模、蒸煮 將料液盛放于4 cm×3 cm×1 cm 的模具中，95 ℃蒸煮30～60 min。

4）冷卻 冷卻至25 ℃左右，無(wú)菌條件下將蛋坯切成1 cm3的小方塊。

5）接菌 將菌曲均勻地噴灑在蛋坯表面。接菌量為0.05%，霉菌或細(xì)菌與酵母菌或乳酸菌的質(zhì)量比為1∶1。

6）制曲 在溫度為28～30 ℃、空氣濕度為85%～90%的條件下制曲24～72 h。

7）加鹽、水 將成曲打碎，按配比加入一定量的鹽和水，充分?jǐn)嚢?。最終產(chǎn)品中鹽的含量為12%，水的含量為40%。

8）保溫發(fā)酵 加入鹽、水后裝罐，壓實(shí)，于40 ℃的環(huán)境中通風(fēng)發(fā)酵20～25 d，且每隔24 h 攪拌一次醬坯。

9）后熟 將發(fā)酵罐密封，室溫放置3～5 d。

10）殺菌 于80～85 ℃的環(huán)境中殺菌30 min即可。

1.3.2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 選擇10 位食品相關(guān)專(zhuān)業(yè)的同學(xué)組成感官評(píng)價(jià)小組，其中男女比例為1∶1，且均經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)技能培訓(xùn)。對(duì)發(fā)酵后醬曲的氣味（詳見(jiàn)表1）、菌絲、孢子或菌落的生長(zhǎng)狀況（詳見(jiàn)表2和3）及雞蛋醬成品的組織狀態(tài)、香氣、口感、滋味進(jìn)行評(píng)分（詳見(jiàn)表4），結(jié)果取平均值。

表1 醬曲氣味評(píng)分表Table 1 Taste score of sauce koji

表2 菌絲生長(zhǎng)狀況評(píng)分表（毛霉、米根霉）Table 2 Score table of mycelium growth （Mucor，Rhizopus oryzae）

表3 孢子或菌落的生長(zhǎng)狀況評(píng)分表（米曲霉、藤黃微球菌）Table 3 Rating scale for the growth of spores or colonies （Aspergillus oryzae，Micrococcus luteus）

表4 雞蛋醬感官評(píng)分表Table 4 Sensory score of egg paste

1.3.3 水分的測(cè)定 水分的測(cè)定采用GB 5009.3-2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》的直接干燥法[24]。

1.3.4 蛋白酶活力的測(cè)定 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》中的甲醛法[25]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理及圖表制作分別使用了Design-Expert.V8.0.6.1、Microsoft Excel 2016、IBM SPSS Statistics 25 及Origin 2018 64Bit。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲菌種的選擇與初步確定

2.1.1 制曲菌種的選擇 黃豆醬、東北大醬制曲的菌類(lèi)主要有霉菌、細(xì)菌、酵母菌、乳酸菌等，常用霉菌主要有米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉等，不同菌種的生長(zhǎng)特性、適應(yīng)性及代謝產(chǎn)物均有一定差異。米曲霉能產(chǎn)生多種酶系，分泌糖化酶活力高，分解蛋白質(zhì)及淀粉的能力較強(qiáng)，同時(shí)還具有生長(zhǎng)迅速，次級(jí)代謝產(chǎn)物少等特點(diǎn)；毛霉分泌的蛋白酶活力較高，對(duì)蛋白質(zhì)的水解度較大；根霉適應(yīng)力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，且菌絲健壯，在高溫季節(jié)能減輕雜菌的污染[15]。

細(xì)菌以藤黃微球菌為主，該菌種易培養(yǎng)，酶活力高，成熟期短，不易退化，且成品質(zhì)地細(xì)膩[15]。乳酸菌有利于產(chǎn)品中的有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，使得酯類(lèi)物質(zhì)增多[26]；加入一定量的酵母菌有利于醬類(lèi)特殊風(fēng)味的形成[26-28]。

選擇全蛋液為制曲原料，當(dāng)蒸坯條件為95℃，40 min 時(shí)，按1.3.1 節(jié)的方法制曲，所用菌種見(jiàn)表5，制曲48 h 后的感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖1。

表5 制曲菌種一覽表Table 5 List of starter making strains

由圖1可知，霉菌或細(xì)菌相同，分別與酵母菌或乳酸菌復(fù)配制曲時(shí)，醬曲的感官評(píng)分由高到低依次為：釀酒酵母≈魯氏酵母>生香酵母>雙歧桿菌≈空白對(duì)照試驗(yàn)組；酵母菌或乳酸菌相同，分別與霉菌或細(xì)菌復(fù)配制曲時(shí),米曲霉>腐乳曲>米根霉>五通橋毛霉>藤黃微球菌。結(jié)果顯示，米曲霉分別與釀酒酵母、魯氏酵母復(fù)配制曲時(shí)，醬曲的感官評(píng)價(jià)評(píng)分最高，其次是腐乳曲與釀酒酵母、魯氏酵母復(fù)配。

圖1 不同菌種制曲后的感官評(píng)分結(jié)果Fig.1 Sensory evaluation results of different strains after koji making

2.1.2 制曲菌種的初步確定 醬曲的好壞是醬產(chǎn)品品質(zhì)重要的影響之一。良好的醬曲是否可以釀制出可以接受的蛋醬，還需要將曲料進(jìn)一步發(fā)酵進(jìn)行驗(yàn)證，以此確定最優(yōu)的菌種或組合。

將2.1.1 節(jié)中感官評(píng)分較高的4 種醬曲打碎，按1.3.1 節(jié)中的工藝流程制成雞蛋醬并進(jìn)行感官評(píng)分，驗(yàn)證上述結(jié)論，其結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

由圖2可知，雞蛋醬的感官評(píng)分由高到低依次為：米曲霉+釀酒酵母≈米曲霉+魯氏酵母>腐乳曲+釀酒酵母≈腐乳曲+魯氏酵母。該結(jié)果與醬曲感官評(píng)定的結(jié)果一致，故選擇米曲霉+釀酒酵母、米曲霉+魯氏酵母兩個(gè)組合菌種進(jìn)行下一步的研究。

圖2 不同醬曲制醬后的感官評(píng)分結(jié)果Fig.2 Sensory evaluation results of different soy sauce koji after sauce making

2.2 蛋坯原料配方的研究與初步確定

2.2.1 蛋坯原料配方的研究 大豆分離蛋白的主要成分是蛋白質(zhì)，熟面粉的主要成分是淀粉，黑豆粉的主要成分是蛋白質(zhì)及淀粉，制曲時(shí)大豆分離蛋白、熟面粉及黑豆粉的加入可改變蛋坯中的碳源和氮源種類(lèi)，可為霉菌、細(xì)菌、酵母菌及乳酸菌的生長(zhǎng)代謝提供充足的氮源及碳源，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖；同時(shí)該物質(zhì)也可在多種微生物及酶的作用下，降解成小分子物質(zhì)，生成醇、醛、酯等，形成醬特有的色澤與風(fēng)味[29]。

以雞蛋液、大豆分離蛋白、熟面粉、饅頭干粉、黑豆粉為原料制成不同種類(lèi)的蛋坯后分別接

2.1.2 節(jié)中選出的兩個(gè)組合的菌種，制曲原料試驗(yàn)設(shè)計(jì)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果詳見(jiàn)表6。

由表6可知，蛋坯原料相同，米曲霉分別與釀酒酵母、魯氏酵母復(fù)配制曲時(shí)，醬曲的感官評(píng)分幾乎相同。制曲菌種相同，蛋坯原料相同，處理方式不同時(shí)，A1的感官評(píng)分明顯高于B1，可能是因?yàn)榻?jīng)翻炒后的蛋坯顆粒較小，堆放制曲時(shí)原料間隙小，不利于空氣流通，導(dǎo)致曲料溫度過(guò)高，感染高溫菌，出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象[30-31]；蛋坯原料為A1時(shí)醬曲的感官評(píng)分與C1、D1相近，且低于E1、F1，可能是因?yàn)楹诙狗奂梆z頭干粉中的大分子物質(zhì)的變性度大于熟面粉及大豆分離蛋白中大分子物質(zhì)的變性度，更易被微生物利用，進(jìn)而影響菌種的生長(zhǎng)狀況；蛋坯原料為G1時(shí)醬曲的感官評(píng)分高于F1，可能是因?yàn)楹诙狗鄣奶砑佑绊懥说芭髦械乃趾?，進(jìn)而影響曲料的疏松度及制曲溫度，影響了醬曲的質(zhì)量[30-31]。結(jié)果顯示，米曲霉分別與釀酒酵母、魯氏酵母協(xié)同制曲時(shí)，制曲原料為G1時(shí)醬曲感官評(píng)分最高，具有橄欖菜味及淡淡的咸蛋黃味，F(xiàn)1次之。

表6 不同種類(lèi)的蛋坯及菌種制曲后的感官評(píng)分結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of different kinds of egg and strain after koji making

2.2.2 蛋坯原料配方的初步確定 蛋坯原料配方的改變影響了制曲菌種的生長(zhǎng)及酶的產(chǎn)生，進(jìn)而影響成曲品質(zhì)，影響發(fā)酵風(fēng)味，良好的醬曲能否釀制出風(fēng)味較好的蛋醬，仍需將醬曲進(jìn)一步發(fā)酵進(jìn)行驗(yàn)證，以此確定最佳原料配方。

將2.2.1 節(jié)中感官評(píng)分較高的4 種醬曲打碎，按1.3.1 節(jié)中的工藝流程制成雞蛋醬并進(jìn)行感官評(píng)分，以驗(yàn)證上述結(jié)論，其結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

由圖3得，制曲原料配方的改變對(duì)雞蛋醬的感官品質(zhì)影響顯著。米曲霉和釀酒酵母或魯氏酵母協(xié)同制曲，蛋坯原料為80%的全蛋液加20%的黑豆粉的雞蛋醬的感官評(píng)分明顯高于蛋坯原料為90%的全蛋液加10%的黑豆粉的雞蛋醬。該結(jié)果與2.2.1 節(jié)中醬曲的感官評(píng)定結(jié)果一致，故初步確定當(dāng)制曲菌種為米曲霉與釀酒酵母或魯氏酵母、蛋坯原料為80%的全蛋液加20%的黑豆粉時(shí)，醬曲的風(fēng)味最好。

圖3 不同醬曲制醬后的感官評(píng)分結(jié)果Fig.3 Sensory evaluation results of different soy sauce koji after sauce making

綜上所述，蛋坯原料一定，米曲霉分別與釀酒酵母、魯氏酵母復(fù)配制曲時(shí)醬曲的感官評(píng)分相近，醬曲打碎后制醬的感官評(píng)分也相近，說(shuō)明兩種酵母菌對(duì)醬曲及雞蛋醬成品風(fēng)味的影響效果幾乎相同。因接種魯氏酵母時(shí)需先對(duì)該菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)，耗時(shí)較長(zhǎng)，故后續(xù)試驗(yàn)選用釀酒酵母與米曲霉協(xié)同制曲。

當(dāng)制曲菌種為米曲霉與釀酒酵母、蛋坯原料為80%的全蛋液加20%的黑豆粉時(shí)，醬曲的風(fēng)味最好，具有橄欖菜味及淡淡的咸蛋黃味。

2.3 制曲工藝參數(shù)優(yōu)化

制曲是雞蛋醬生產(chǎn)的一道重要工序，醬曲的質(zhì)量直接關(guān)系到產(chǎn)品品質(zhì)及原料的利用率，而醬曲質(zhì)量的好壞，可通過(guò)蛋白酶活力來(lái)衡量。

相關(guān)資料表明制曲菌種為米曲霉和釀酒酵母時(shí)，制曲溫度為30 ℃，空氣濕度為85%。上述研究表明最適制曲原料為全蛋液、黑豆粉。

醬曲中的蛋白酶活力還受制曲時(shí)間、制曲原料中的水分含量及變性度的影響，而制曲原料的變性程度又隨蒸坯條件的變化而變化。故選擇這3 個(gè)影響因素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，以得到最佳醬曲。

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 蒸坯時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 蛋坯原料的蒸煮條件與酶的作用密切相關(guān)，雞蛋及黑豆粉在制曲前經(jīng)高溫蒸煮處理，可使得其中的大分子物質(zhì)——蛋白質(zhì)變性。在后期制曲發(fā)酵過(guò)程中，變性后的蛋白質(zhì)更易被微生物所產(chǎn)生的多種酶系分解，提高原料的利用，降低成本，提高成品風(fēng)味，改善成品品質(zhì)。蒸煮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋白質(zhì)變性過(guò)度，蛋坯色澤加深，結(jié)實(shí)且無(wú)彈性，不易被米曲霉所分解的蛋白酶作用，不利于制曲；蒸煮時(shí)間過(guò)短，蛋白質(zhì)變性不完全，原料利用率降低。

選擇蛋坯原料為80%的全蛋液加20%的黑豆粉，研究蒸坯時(shí)間（20，30，40，50，60 min）對(duì)醬曲中蛋白酶活力的影響，制曲48 h 后醬曲中的蛋白酶活力結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著蒸坯時(shí)間的延長(zhǎng)，醬曲中的蛋白酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，蒸坯時(shí)間為40 min 時(shí)蛋白酶的活力最大，此時(shí)原料中的蛋白質(zhì)變性適度，提高了酶作用的程度。

圖4 蒸坯時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.4 Effects of steaming time on protease activity

2.3.1.2 蛋坯中的水分含量對(duì)蛋白酶活力的影響 水分含量是制曲的重要參數(shù)之一，曲料中水分含量太低，曲料偏干，不易于曲料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)自由水?dāng)U散到基質(zhì)表面，從而抑制菌體的生長(zhǎng)；曲料中水分含量太高，不利于維持曲料中細(xì)小微粒間的空隙和疏松度，從而影響空氣流通，影響制曲過(guò)程中溫度的控制[30-31]。

本試驗(yàn)通過(guò)改變黑豆粉的添加量改變蛋坯中的水分含量。選擇蒸坯時(shí)間為40 min，研究蛋坯中的水分含量（55%，60%，65%，70%，75%）對(duì)醬曲中蛋白酶活力的影響，制曲48 h 后醬曲中的蛋白酶活力結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5得，蛋坯中的水分含量對(duì)醬曲中的蛋白酶活力影響顯著。隨著水分含量的增加，醬曲中的蛋白酶活力在水分含量為55%～65%時(shí)呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)水分含量為65%時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最大，為5 522 U/g；水分含量為65%～70%時(shí)，醬曲中的蛋白酶活力急劇下降。綜上，制曲時(shí)蛋坯中的水分含量為65%時(shí)為宜。

圖5 蛋坯中的水分含量對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.5 Effects of water content in egg blank on protease activity

2.3.1.3 制曲時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 在蛋坯中的水分含量為65%，蒸坯時(shí)間為40 min 的條件下，考察制曲時(shí)間（24，36，48，60，72 h）對(duì)醬曲中蛋白酶活力的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 制曲時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effects of koji making time on protease activity

微生物的生長(zhǎng)可以分為4 個(gè)時(shí)期，分別為：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。霉菌在對(duì)數(shù)期時(shí)其生長(zhǎng)速率的常數(shù)最大，酶系活躍，代謝旺盛，即圖6中制曲時(shí)間為24～48 h 時(shí)，并在48 h 時(shí)酶活呈最大值。之后隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，醬曲中的蛋白酶活力急劇下降，其可能是因?yàn)橹魄?8 h 后霉菌開(kāi)始衰老，產(chǎn)酶速率下降，且部分蛋白酶活力下降；也可能是因?yàn)槲⑸镞^(guò)度繁殖，加劇了對(duì)氧氣以及醬曲中營(yíng)養(yǎng)成分的競(jìng)爭(zhēng)。制曲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的孢子污染環(huán)境，成品的苦味也會(huì)加重，故本試驗(yàn)的最佳制曲時(shí)間為48 h。

2.3.2 制曲條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 為了全方面分析及優(yōu)化制曲工藝參數(shù)，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken 中心組和設(shè)計(jì)原理[32-33]，選擇蒸坯時(shí)間（A）、蛋坯中的水分含量（B）、制曲時(shí)間（C）3 個(gè)因素為自變量，以蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究雞蛋醬的制曲工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平詳見(jiàn)表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果詳見(jiàn)表8。

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 7 Test design factor level table for Box-Behnken

2.3.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 對(duì)表8中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件分析，建立蛋白酶活力對(duì)蒸坯時(shí)間（A）、蛋坯中的水分含量（B）、制曲時(shí)間（C）的二元多項(xiàng)回歸方程：

表8 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Box-Behnken experimental design and results

蛋白酶活力=5545.00+255.63A+265.50B+200.88C+17.75AB+63.50AC－46.25BC－1146.25A2－593.00B2－604.25C2?；貧w方程方差分析見(jiàn)表9。

由表9可知，蛋白酶活力評(píng)價(jià)模型中P＜0.0001，表明二次回歸方程模型極顯著（P＜0.01），故該方程能夠很好的描述各影響因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系；失擬項(xiàng)不顯著（P失擬=0.1405＞0.05），則無(wú)失擬因素存在；模型的決定系數(shù)R2=0.9927，說(shuō)明該響應(yīng)面的二次回歸方程的可靠性較高，且試驗(yàn)所得結(jié)果與數(shù)學(xué)模型的擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9833。綜上所述，對(duì)制曲工藝條件的研究可使用該模型。其中，蒸坯時(shí)間（A）、蛋坯中的水分含量（B）、蒸坯時(shí)間的二次項(xiàng)（A2）、蛋坯中的水分含量的二次項(xiàng)（B2）、制曲時(shí)間的二次項(xiàng)（C2）的P 值均小于0.001，表明對(duì)醬曲中的蛋白酶活力影響極顯著；制曲時(shí)間（C）的P 值小于0.01，表明對(duì)醬曲中蛋白酶活力影響高度顯著。又由F 值的大小可知，影響蛋白酶活力的因素由大到小依次為B>A>C，即蛋坯中的水分含量>蒸坯時(shí)間>制曲時(shí)間。

表9 回歸方程方差分析表Table 9 Variance analysis of regression model

2.3.2.3 回歸模型等高線(xiàn)及響應(yīng)面分析 利用響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖來(lái)反應(yīng)各影響因素兩兩交互后對(duì)醬曲中蛋白酶活力的影響，其影響結(jié)果詳見(jiàn)圖7。

圖7 響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface and contour chromatograms

由上述3D 響應(yīng)曲面圖可得制曲過(guò)程中各影響因素對(duì)蛋白酶活力的影響，響應(yīng)面曲面的陡峭程度反映了該響應(yīng)條件的改變對(duì)響應(yīng)值影響的大小，響應(yīng)曲面越陡峭，響應(yīng)值越靈敏。

2.3.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析得最佳制曲工藝條件為：蒸坯時(shí)間41.17 min，蛋坯中的水分含量為66.1%，制曲時(shí)間為49.96 h，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，各工藝條件可調(diào)整為：蒸坯時(shí)間41 min，蛋坯中的水分含量為66.1%，制曲時(shí)間為50 h，重復(fù)3 次試驗(yàn)取平均值，得醬曲中的蛋白酶活力為（5 797±90.64）U/g，與模型預(yù)測(cè)值接近，表明該模型得到的最佳制曲工藝條件準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

良好風(fēng)味的制曲菌種為：米曲霉和釀酒酵母。當(dāng)制曲菌種為米曲霉與釀酒酵母、蛋坯原料為80%的全蛋液加20%的黑豆粉時(shí)，醬曲的風(fēng)味最好，具有橄欖菜味及淡淡的咸蛋黃味。雞蛋醬最佳制曲工藝條件為：蒸坯時(shí)間41 min，蛋坯中的水分含量為66.1%，制曲時(shí)間為50 h。