斷乳期人源菌群對小鼠生長發(fā)育的影響

史玉東，劉夢瑤，宋 晨，李勇枝，盧衛(wèi)紅*

（1 哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150001 2 哈爾濱工業(yè)大學(xué)極端環(huán)境營養(yǎng)與防護研究所 哈爾濱 150001 3 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司研發(fā)中心 呼和浩特 011500 4 中國航天員科研訓(xùn)練中心 北京 100094）

營養(yǎng)是影響嬰幼兒成長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一，生命早期1 000 d 營養(yǎng)狀態(tài)影響一生的健康[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦0～6月嬰兒純母乳喂養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒發(fā)育水平也成為WHO建議的孩子發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。斷乳期是從完全母乳喂養(yǎng)到充分利用家庭食物的過渡時期，也是嬰幼兒成長發(fā)育的關(guān)鍵時期[5]。對于繼續(xù)母乳喂養(yǎng)的7～12月齡嬰兒，其所需要的部分能量，以及99%的鐵、75%的鋅、80%的維生素B6、50%的維生素C等必須從添加的輔食中獲得[6-7]。腸道菌群與人的生長發(fā)育、健康情況息息相關(guān)，斷乳期是腸道菌群構(gòu)建的關(guān)鍵時期。最初，嬰兒腸道菌群多樣性差，輔食的添加會引起腸道菌群發(fā)生巨大改變并逐漸趨于穩(wěn)定，接近成人[8]。研究營養(yǎng)干預(yù)對了解斷乳期嬰幼兒生長發(fā)育影響十分重要。

鑒于嬰幼兒的脆弱敏感性以及調(diào)查的（倫理學(xué)）難度，幾乎沒有對健康嬰幼兒的營養(yǎng)干預(yù)性研究。對于嬰幼兒營養(yǎng)攝入的了解主要依賴于一些觀察性研究，如不同喂養(yǎng)方式下的嬰幼兒生長發(fā)育研究。無菌動物（Germ free animal，GF 動物）作為微生物背景最清晰的動物，可有效進行菌群、基因及其它環(huán)境因素的控制，是研究腸道菌群對人類疾病及健康影響的最有效的動物模型[9]。利用無菌動物構(gòu)建攜帶斷乳期嬰兒腸道菌群的人源菌群動物（Human floral-associated animal，HFA 動物），可為飲食干預(yù)對腸道菌群的影響提供一個有效的模型。本文搭建了斷乳期人源菌群小鼠模型，并驗證人源菌群對小鼠大腦、腸道發(fā)育及免疫等相關(guān)指標(biāo)的影響，為后續(xù)針對斷乳期嬰幼兒營養(yǎng)干預(yù)性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 實驗動物 昆明GF 小鼠，10～15 g，18 只，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（鄂）2015-0084。

1.1.2 菌群來源 糞便樣本來源于順產(chǎn)母乳喂養(yǎng)且未接受過抗生素治療及服用益生菌類產(chǎn)品的6月齡健康女嬰，糞樣以每管200 mg 裝入無菌EP管中，裝若干管，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.1.3 試劑 E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 抽提試劑盒，美國Omega Bio-Tek 公司；小鼠胰島素樣生長因子-1 （Insulin-like growth factor-1，IGF-1）ELISA 試劑盒，中國聯(lián)科生物公司；小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3（In-sulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）ELISA 試劑盒，美國RD 公司；C10∶0 脂肪酸 （Fatty acid，F(xiàn)A）、C16∶0 FA、C17∶0 FA、C18∶0 FA、C18∶1 FA 標(biāo)品，美國Sigma 公司；甲醇、二氯甲烷、乙酰氯、正己烷、乙腈、正庚烷（色譜純級），天津市康科德公司；無水硫酸鈉、碳酸鉀、丁羥甲苯（分析純級），阿拉丁試劑（上海）有限公司；MRS 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

無菌隔離器，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；CP21GⅡ高速冷凍離心機，日立公司；超凈工作臺，新加坡ESCO公司；超低溫冰箱、HM325 石蠟切片機，美國Thermo 公司；PPTHK-21B 攤片烤片機、PPDB-21C電腦程控組織包埋機，襄樊徠克生物電子儀器廠；ECLIPSE 顯微鏡，美國尼康公司；K3 酶標(biāo)儀，上海歐穎實驗設(shè)備有限公司；MX-S 可調(diào)式混勻儀，美國SCILOGEX 公司；I-Class 高效液相色譜，美國Waters 公司；TARGA C18 色譜柱 （20 mm×2.1 mm，5.0 μm），美國Higgins Analytical 公司；SCIEX QTRAP 4500 液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀，美國AB SCIEX 公司；電子秤，梅特勒公司；ABI GeneAmpR9700 型PCR 儀，美國ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗方案 將1 周齡無菌仔鼠 （體質(zhì)量10～15 g）及對應(yīng)母鼠隨機置于2 臺隔離器中（每臺隔離器9 只仔鼠），分別用于建立人源腸道菌群模型（HMC）和無菌小鼠模型（GFC）。實驗周期為7周，仔鼠3 周齡斷乳后與母鼠分離，實驗期間小鼠在無菌隔離器中隨意進食（基礎(chǔ)日糧）和飲水，控制溫度在（23±2）℃，保持相對濕度在（55±5）%之間，12 h 明暗交替周期，如圖1所示。本研究的動物實驗方案獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn) （批準(zhǔn)編號：HZAUMO-2020-0054），并且嚴(yán)格按照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會的管理要求進行實驗操作。

圖1 實驗方案圖Fig.1 Schematic of experimental design

菌群移植步驟如下：取1 管200 mg 斷乳期嬰兒糞便樣本，于37 ℃水浴快速復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)入無菌小鼠隔離器內(nèi)，加2 mL 無菌生理鹽水搖勻至無明顯大顆粒，靜置5 min 取上清液灌胃；每只母鼠（產(chǎn)后1 周的母鼠）灌胃0.2 mL；灌胃后，將剩余菌液上清均勻涂抹至母鼠腹部乳頭及1 周齡仔鼠全身；每天按上述操作步驟進行一次灌胃與涂抹，連續(xù)1 周，將小鼠糞便進行革蘭氏染色，并使用MRS 培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，根據(jù)檢測結(jié)果評價模型構(gòu)建是否成功。

建模成功后，每隔2 周測量小鼠體質(zhì)量1 次。收集產(chǎn)后2 周母鼠及3 周齡仔鼠糞便樣本，-80℃保存。8 周齡時，小鼠禁食12 h，稱取動物體質(zhì)量后，采用眼球取血法采集每只小鼠血液1.5 mL，頸椎脫臼法處死小鼠。將所得血液室溫放置40 min以上，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清于新的EP 管中，-80 ℃保存。

按以下步驟取小鼠組織樣本：解剖小鼠，取完整腦組織，手術(shù)刀分為兩半，一半最佳切削溫度（Optimal cutting temperature，OCT） 包埋，-80 ℃保存；另一半福爾馬林固定，室溫保存。取肝臟，放入凍存管，立即液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。取結(jié)腸，PBS 清洗，福爾馬林固定，室溫保存。

1.3.2 糞便中菌群組成的測定

1.3.2.1 DNA 抽提和PCR 擴增 根據(jù)說明書進行微生物群落總DNA 抽提；使用338F （（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 對16S rRNA基因V3-V4 可變區(qū)進行PCR 擴增。

1.3.2.2 Illumina Miseq 測序 利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3.2.3 數(shù)據(jù)處理 使用fastp （version 0.20.0）[10]軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH（version 1.2.7）[11]軟件進行拼接。使用UPARSE（version 7.1）[12]軟件，根據(jù)97%[12-13]的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（version 2.2）[14]對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（version 138），設(shè)置比對閾值為70%。

1.3.3 海馬組織和結(jié)腸組織HE 染色病理檢測

1.3.3.1 組織包埋 將用福爾馬林固定好的組織放入包埋盒，浸入70%酒精，過夜；按照80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇+二甲苯（1∶1）、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石 蠟Ⅰ（54～56 ℃）、石 蠟Ⅱ（56～58 ℃）、石 蠟Ⅲ（58～60 ℃）順序?qū)M織進行處理。

1.3.3.2 組織切片 將組織進行連續(xù)切片（3 μm），64 ℃烤片30 min，于室溫保存。

1.3.3.3 HE 染色 將組織切片進行脫蠟水化；隨后用蘇木精染色15 min，自來水洗，鹽酸酒精分化2 s，自來水返藍(lán)15 min，鏡下觀察反藍(lán)程度；伊紅染色3 min；放入100%酒精Ⅰ5 min，100%酒精Ⅱ5 min，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min；最后使用中性樹膠進行封片（封片過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）；顯微鏡下觀察，并進行拍照。

1.3.4 血清、肝臟IGF-1 與IGFBP-3 含量測定 采用夾心ELISA 方法檢測。將包被抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，加待測樣品，樣品與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；然后加酶標(biāo)記抗體，固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標(biāo)抗體結(jié)合。加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。加入終止液終止顯色反應(yīng)并于波長450 nm 處讀取OD 值。

1.3.5 大腦脂肪酸含量的測定

1.3.5.1 腦樣本制備 將大腦樣品制備成勻漿液，質(zhì)量濃度為100 mg/mL。取100 μL 勻漿液置于1.5 mL EP 管中；加入400 μL 正己烷，渦旋1 min，10 000×g 離心10 min。取上清液250 μL 旋干，加1 mL 甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，取上清800 μL 于液相小瓶中用于LC-ESI MS 檢測FA。

1.3.5.2 色譜條件 TARGA C18 色譜柱（20 mm×2.1 mm，5.0 μm），流動相為A（水，含5 mmol/L 乙酸銨）和B（乙腈），等度洗脫（0～10 min，30%A）。流速為0.2 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為5 μL，樣品盤溫度為4 ℃。

1.3.5.3 質(zhì)譜條件 離子源為ESI 源，檢測模式為負(fù)離子檢測模式，氣簾氣（CUR）172 kPa，碰撞氣（CAD）中等，離子源氣1（GS1）310 kPa，離子源氣2（GS2）345 kPa，電噴霧電壓-4 500 V，加熱器溫度350 ℃，碰撞電壓 （CE）-5 V，滯留時間35 ms。

小鼠大腦不同脂肪酸的LC-Qtrap MS 檢測條件見表1。

表1 FA 的LC-Qtrap MS 檢測條件Table 1 LC-Qtrap MS detection conditions for FA

1.3.5.4 FA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取FA標(biāo)準(zhǔn)品（C17∶0 FA）適量溶于甲醇溶液，配成濃度為10 mmol/L 的母液。取適量FA 母液混合，甲醇逐級稀釋為50，25，10，2，0.4，0.08 μmol/L 和0.016 μmol/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上面的液質(zhì)檢測條件進行質(zhì)譜檢測。以FA 標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，為樣品中FA 的定量檢測建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 在本研究中，所有試驗均獨立重復(fù)至少3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示結(jié)果。各組數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），顯著性分析有Duncan's 檢驗得到。P<0.05 表明結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠模型菌群定值效果評估

2.1.1 3 周齡小鼠糞便初步評估 將3 周齡小鼠糞便進行革蘭氏染色鏡檢，如圖2所示。

從圖2可以看出，GFC 組小鼠糞便鏡檢為無菌，HMC 組小鼠糞便鏡檢顯示為陽性。表明無菌小鼠模型（GFC）腸道中無活體微生物。

圖2 3 周齡小鼠糞便革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of feces of mice aged 3 weeks

HMC 小鼠糞便經(jīng)MRS 培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h后，結(jié)果如圖3所示。

圖3 HMC 組3 周齡小鼠糞便中雙歧桿菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.3 Culture results of Bifidobacteria in feces of 3-weeks-old mice in HMC group

從圖3可以看出，HMC 組小鼠糞便中存在雙歧桿菌。雙歧桿菌作為嬰兒腸道菌群的代表菌株之一，該結(jié)果初步表明斷乳期人源小鼠模型搭建成功。

2.1.2 菌群組成分析 從圖4可以看出，母乳喂養(yǎng)的6月齡嬰兒腸道菌群以雙歧桿菌為優(yōu)勢菌，同時發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、瘤胃球菌、腸球菌、韋榮球菌等。而菌群移植1 周后母鼠及9 只3 周齡斷乳模型小鼠腸道菌群中以大腸桿菌、亨蓋特拉菌、瘤胃球菌為主體，伴有雙歧桿菌、腸球菌、韋榮球菌等。對比發(fā)現(xiàn)斷乳期嬰兒、菌群移植1 周后母鼠及9只3 周齡斷乳模型鼠腸道菌群組成在屬水平有一定的相似度，特別是雙歧桿菌作為嬰兒腸道菌群的代表微生物在小鼠腸道的定植，說明人源菌群移植成功，斷乳期人源菌群小鼠搭建成功，能夠部分模擬斷乳期嬰兒腸道菌群。

圖4 斷乳期嬰兒、母鼠和斷乳模型鼠屬水平菌群組成Fig.4 The microbial composition of weaning infants，mother mice and weaned model mice at the genus level

2.2 小鼠體質(zhì)量

從表2可以看出，2 個小鼠模型體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間延長逐漸升高。采用SPSS 17.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均數(shù)比較采用t 檢驗。結(jié)果顯示，不同模型小鼠在不同飼養(yǎng)時期，組間無顯著差異，說明腸道菌群的移植不影響小鼠體質(zhì)量增長。實驗期間，各模型小鼠健康狀況良好，無腹瀉、增肥等不良現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒或自然死亡。

表2 小鼠體質(zhì)量變化（n=9）Table 2 The change of body weight in mice （n=9）

2.3 小鼠大腦發(fā)育

2.3.1 小鼠海馬CA1 區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu) 從圖5可以看出，小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。HMC 組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞內(nèi)核體著色深且很清楚；而在GFC 組中，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞大，核體小，著色不清晰，這說明HMC組較GFC 組小鼠腦細(xì)胞生長旺盛，更有活力。此外，神經(jīng)元突觸間隙也有明顯差異。在圖5中，HMC 組箭頭所指神經(jīng)元突觸間隙在單位空間內(nèi)的數(shù)量明顯多于GFC 組箭頭所指的數(shù)量，且HMC組的突觸發(fā)育良好，突觸長度和密度都有明顯優(yōu)于GFC 組的趨勢，這也表明HMC 組小鼠大腦海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞比GFC 組神經(jīng)元細(xì)胞具有活力、年輕、延緩衰老的特征。以上均說明腸道菌群對小鼠海馬CA1 區(qū)發(fā)育影響顯著。

圖5 小鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色Fig.5 HE staining of hippocampal CA1 region in mice

2.3.2 小鼠大腦脂肪酸含量 從圖6可以看出，兩模型小鼠大腦中的脂肪酸含量存在區(qū)別。其中HMC 組的單不飽和脂肪酸C16∶1（P<0.001）、C18∶1（P < 0.01）和多不飽和脂肪酸C18∶3（P < 0.05）、C20∶3（P<0.01）、C20∶4（P<0.001）、C22∶5（P<0.05）、C22∶6（P<0.01）含量較GFC 組顯著降低。飽和脂肪酸、部分不飽和脂肪酸 （C14∶1、C15∶1、C18∶2、C20∶5、C22∶1）含量組間差異均不顯著。DHA（C22∶6）和AA（C20∶4）是大腦中主要的長鏈多不飽和脂肪酸，DHA、AA 和EPA（C20∶5）及其衍生物參與腦細(xì)胞的形成和發(fā)育，促進神經(jīng)蛋白合成及神經(jīng)細(xì)胞生長，對神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸和新突觸的形成有重要作用，并參與大腦思維和記憶形成過程[15]。由上文可知，在營養(yǎng)攝入相同的情況下，植入嬰兒腸道菌群的HMC 組小鼠大腦發(fā)育效果明顯高于GFC 組，而HMC 組小鼠大腦中多鏈不飽和酸含量明顯低于GFC 組，可能是由于小鼠大腦發(fā)育過程中消耗大量多鏈不飽和脂肪酸導(dǎo)致的。

圖6 小鼠大腦脂肪酸含量（n=6）Fig.6 Brain fatty acid content in mice （n=6）

2.4 小鼠結(jié)腸發(fā)育

小腸的腸絨毛高度是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。從圖7可以看出，兩個小鼠模型結(jié)腸組織的黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整清晰，腺體排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤，其中HMC 小鼠腸內(nèi)絨毛發(fā)育水平和高度要優(yōu)于GFC 組?？赡苁怯捎跀嗄虘?yīng)激對小鼠腸黏膜形態(tài)有很大的影響，包括絨毛萎縮、高度下降、隱窩加深，腸絨毛上皮成熟細(xì)胞數(shù)量減少，分泌細(xì)胞（杯狀細(xì)胞）增多，吸收能力下降[16]。移植人源菌群中的雙歧桿菌等益生菌能夠促進受損腸黏膜細(xì)胞的修復(fù)，使得腸絨毛高度增加，隱窩變淺。

圖7 小鼠結(jié)腸組織HE 染色Fig.7 HE staining of colon tissue sections in mice

2.5 小鼠免疫性能

小鼠肝臟IGF-1、IGFBP3 含量檢測結(jié)果，如圖8所示。

圖8 肝臟中IGF-1、IGFBP3 含量檢測結(jié)果Fig.8 The determination results of liver IGF-1 and IGFBP3 content

由圖8可以看出，HMC 組肝臟中的IGF-1 含量顯著高于GFC 組（P<0.05），表明菌群移植能夠明顯提高小鼠肝臟中的IGF-1 含量。HMC 組肝臟中的IGFBP3 含量與GFC 組差異不顯著。

小鼠血清IGF-1、IGFBP3 檢測結(jié)果，如圖9和10所示。

由圖9和10 可以看出，HMC 組血清中的IGF-1 含量顯著高于GFC 組（P<0.05），表明菌群移植能夠明顯提高小鼠血清中的IGF-1 含量。HMC 組血清中的IGFBP3 含量與GFC 組差異不顯著。

圖9 血清中IGF-1 含量檢測結(jié)果Fig.9 The determination results of serum IGF-1 content

圖10 血清中IGFBP3 含量檢測結(jié)果Fig.10 The determination results of serum IGFBP3 content

IGF-1 具有促進淋巴組織增生、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞生長、分化和效應(yīng)完成、控制胸腺素功能等免疫調(diào)節(jié)作用，上述結(jié)果表明腸道菌群可以顯著影響宿主的免疫能力[17]。

3 結(jié)論

將斷乳期嬰兒腸道菌群移植至無菌昆明小鼠建立斷乳期人源菌群小鼠模型，與無菌小鼠模型進行對比，評價人源菌群移植對小鼠大腦、腸道發(fā)育及免疫等相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示：斷乳期人源菌群小鼠健康狀況良好，能夠部分模擬斷乳期嬰兒腸道菌群；腸道菌群對小鼠大腦、結(jié)腸發(fā)育及免疫性能等相關(guān)指標(biāo)有顯著影響。斷乳期人源菌群模型的建立，為斷乳期嬰兒腸道菌群對宿主生理功能的影響、代謝性疾病發(fā)生、藥物代謝等研究領(lǐng)域提供了有效的動物模型。