基于整合藥理學探究當歸四逆湯抗寒凝心脈型心肌梗死的作用機制

劉志超， 高晟瑋， 陳金紅， 馬 莉， 王保和， 谷旭放*

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是危害人類健康的重大急性疾病，近年來隨著經濟的迅速發(fā)展、生活方式的轉變、人口老齡化的加劇，在我國其發(fā)病率和死亡率呈逐年增長趨勢，已成為疾病死因首位[1-2]。亞洲其他各國研究也表明，急性心肌梗死早期風險與使用藥物介入治療或直接介入治療有關[3-4]。盡管急性心肌梗死治療指南指出，本病治療以抗栓為主，但存在一定風險，包括出血事件、消化系統(tǒng)不良反應，故控制發(fā)病率、提高救治水平正成為心血管領域的重要研究課題。

急性心肌梗死根據其癥狀、證候表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”范疇，中醫(yī)藥對該病的治療積累了豐富的經驗。但現(xiàn)有證據顯示，在我國中醫(yī)院治療急性心肌梗死過程中，僅有32.5%的患者接受再灌注，而且相關方案隨意性大，缺乏規(guī)范性[5]，故在急性心肌梗死治療指南的基礎上規(guī)范中醫(yī)診療方案，明確中藥作用機制，提高中西醫(yī)結合治療水平是醫(yī)護人員面臨的重要問題。因此，本研究對當歸四逆湯抗寒凝心脈型急性心肌梗死的治療作用進行分子機制預測性挖掘，從微觀生物層面篩選關鍵活性成分及靶點。

1 方法

1.1 數(shù)據庫建立 利用整合藥理學平臺[6](http://www.tcmip.cn/)中的中藥活性成分數(shù)據庫，結合2020年版《中國藥典》規(guī)范藥材命名及成分名稱，建立分子數(shù)據資料庫。檢索“當歸”“細辛”“甘草”“白芍”“桂枝”“大棗”這些主要中藥，保留活性成分與靶點，完備數(shù)據庫。

1.2 藥物靶標預測 利用TCMIP提取“當歸”“細辛”“甘草”“白芍”“桂枝”“大棗”所含成分的化學分子指紋，并將其與Drug Bank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據庫中獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)批準的治療冠心病心肌梗死藥物指紋進行比對，利用Tanimoto系數(shù)對結果進行評分，選定大于0.8者作為當歸四逆湯方的潛在機制靶點[7]。

1.3 疾病、證候靶標確定 以“myocardial infarction”作為疾病關鍵詞，在GeneCard(https://www.genecards.org/)數(shù)據庫、TTD數(shù)據庫(http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、DrugBank數(shù)據庫(https://www.drugbank.ca/)、OMIM數(shù)據庫(https://omim.org/)檢索全疾病相關靶標，Uniprot數(shù)據庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)轉換蛋白名稱，獲取基因名稱，通過Excel軟件去重，建立疾病數(shù)據庫。再以“myocardial infarction”為疾病關鍵詞，錄入整合藥理學平臺疾病、證候靶標數(shù)據庫中進行檢索，關鍵詞為胸悶胸痛、手足厥冷、四肢麻木、乏力、短氣、苔薄白、脈浮緊等，提取相應證候靶點信息。

1.4 PPI網絡構建、分析與可視化 通過整合藥理學平臺的網絡分析模塊，對蛋白互相作用網絡進行拓撲分析，選取中藥靶點-疾病基因的關鍵節(jié)點(hubs)作為當歸四逆湯活性成分的潛在靶點，然后對關鍵靶標網絡進行通路富集分析，選取P值排名前20的通路,構建完整的“中藥-活性成分-核心靶標-關鍵通路”多層次關聯(lián)網絡,并進行可視化數(shù)據分析。通過David平臺(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對關鍵靶基因進行GO功能、KEGG富集分析，利用Jvenn[8](http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)在線繪圖獲取韋恩圖。

2 結果

2.1 當歸四逆湯成分靶標 當歸四逆湯共包含1 661種成分，潛在靶標2 728個。對潛在靶標進行基因功能分析和通路富集分析，發(fā)現(xiàn)其功能大多與調控上皮細胞向間質轉化、DNA結合轉錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的調控、NO生物合成過程的正調控、凋亡過程的正調控、細胞增殖的正向調節(jié)密切相關。

2.2 心肌梗死疾病靶標及相關基因 對全疾病相關潛在靶標合并去重后，共獲得1 062個，其中與當歸四逆湯密切相關的共同靶向基因共545個，主要在調控炎性因子、凝血因子-2(recombinant coagulation factor II，F(xiàn)2)[9]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG)[10]、eNOS[11]、血管內皮生長因子[12]、細胞凋亡蛋白酶[13]等方面共同調節(jié)發(fā)揮作用，見圖1。

圖1 心肌梗死疾病靶標及相關基因韋恩圖Fig.1 Veen diagram for myocardial infarction disease targets and related genes

2.3 當歸四逆湯抗心肌梗死候選基因的GO富集分析 表1顯示，當歸四逆湯候選靶標參與的通路主要涉及GTP酶正調控、中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負調控、磷脂酰肌醇生物合成過程等方面。

表1 當歸四逆湯抗心肌梗死候選基因的GO富集分析Tab.1 GO enrichment analysis of candidate genes of Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

2.4 當歸四逆湯抗心肌梗死核心靶標的KEGG富集分析 表2顯示，核心靶標主要涉及賴氨酸、孕激素介導的卵母細胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉錄失調等方面。

表2 當歸四逆湯抗心肌梗死核心靶標的KEGG富集分析Tab.2 KEGG enrichment analysis of core targets for Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

2.5 當歸四逆湯抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點-通路”多維網絡分析 圖2顯示，當歸四逆湯通過調控賴氨酸和孕激素介導的卵母細胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉錄失調等方面，對GTP酶正調控、中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負調控、磷脂酰肌醇生物合成過程等通路進行干預。

圖2 當歸四逆湯抗心肌梗死的“中藥-成分-靶點-通路”多維網絡Fig.2 Multi-dimensional network of “traditional Chinese medicines-components-targets-pathways” of Danggui Sini Decoction against myocardial infarction

3 討論

中藥的治療機制一直是中醫(yī)學者們探究的方向，其目的是為了更加精準地靶向治療，進行“精準醫(yī)療”，這與中醫(yī)理論中“辨證論治”體系不謀而合?！熬珳梳t(yī)療”是近年來在科學推動下新興的一種醫(yī)療模式[14]。精準醫(yī)療下的心血管研究的理想目標是解決非傳染性死亡的流行病，加強對人類健康和疾病的理解，促進科學發(fā)展并提高臨床研究效率[15]。而新興的高通量數(shù)據密集型生物醫(yī)學測定法的應用[16]，例如DNA測序[17]、蛋白質組學[18]和成像技術，揭示了疾病的機制在個體中存在較大差異，這引起了人們的關注，即個體之間的差異應在多大程度上影響有關治療、監(jiān)測或預防個體疾病最佳方法的決策。實際上，許多疾病發(fā)展過程的潛在異質性表明，必須針對個體的獨特生化、生理、適應癥，進行“個性化”治療[19]。對冠心病的早期臨床研究發(fā)現(xiàn)，溫陽復脈方對寒凝心脈型心肌梗死具有較好的臨床療效[20]，本研究通過整合藥理學對中藥成分、證候要素、疾病靶點進行多層次研究，并從藥物自身出發(fā)，分析中藥-證候要素-疾病-靶標-通路網絡，從分子角度解釋中醫(yī)療效內涵。

Wu等[21]通過代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，當歸四逆湯對寒凝心脈、瘀血阻絡的干預作用可能涉及調節(jié)花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、膽汁酸生物合成和丙酮酸代謝4個途徑；并且整體組方的協(xié)同作用要優(yōu)于單體藥物。本研究對組方候選靶標與疾病進行關聯(lián)并以網絡可視化形式展現(xiàn)，并預測其可能靶標和分子信號通路。結果表明，當歸四逆湯通過調控賴氨酸、孕激素介導的卵母細胞、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導、谷胱甘肽代謝、多種氨基酸和脂類代謝、逆轉錄失調等方面，對GTP酶的正調控、中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、神經肽信號通路、ERK1和ERK2級聯(lián)負調控、磷脂酰肌醇生物合成的過程等通路進行干預。此外，本課題組將繼續(xù)對關鍵該通路和靶標進行基礎實驗驗證，以期深入挖掘當歸四逆湯抗寒凝心脈型心肌梗死的作用機制。