黃芪三七合劑對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的影響

雷小琴， 魏何燕， 譚睿陟， 王 麗*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心,四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒一科，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指某種原因引起的腎功能突然下降，伴有或不伴有少尿或無尿的癥狀，全球每年約有1 330萬人發(fā)病，在我國(guó)其發(fā)病率占同期住院患者的0.3%～3.0%，死亡率14%～42%[1-2]，而且是慢性腎臟疾病和慢性腎功能衰竭的重要誘因，但目前尚無特效治療藥物，尤其是有效的分子治療靶點(diǎn)。因此，尋找急性腎損傷的治療靶點(diǎn)尤為重要。

前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA9884位于小鼠5號(hào)染色體(chr5 52973035-52992344)上，全長(zhǎng)508個(gè)核苷酸，覆蓋了lncRNA轉(zhuǎn)錄本5033403h07rik的全基因組序列，對(duì)腎臟炎癥具有促進(jìn)作用[3]。Yes相關(guān)蛋白(YAP)不僅是Hippo通路的核心組成部分，而且還是Hippo通路通過MST1和LATS激酶磷酸化的關(guān)鍵下游效應(yīng)子[4-6]，它在炎癥中具有促進(jìn)和拮抗作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的YAP在糖尿病腎病小鼠模型和腎小球疾病患者腎組織中高表達(dá)，而NF-κB信號(hào)的抑制可以改善腎功能和炎癥[8-9]。

黃芪三七合劑為本課題組在臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用于治療腎病的復(fù)方制劑，主要由君藥黃芪和三七、臣藥當(dāng)歸和昆布、使藥懷牛膝組成，不但能改善患者營(yíng)養(yǎng)狀況，還能抑制急性腎損傷炎癥發(fā)展[10-11]，但該方抑制腎臟炎癥的具體機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)考察黃芪三七合劑對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的影響，研究該方改善炎癥作用是否與長(zhǎng)鏈非編碼RNA有關(guān)，并進(jìn)一步探討它與lncRNA9884/YAP/NF-κB信號(hào)軸的關(guān)系，以期為相關(guān)臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 18只無特定病原的C57BL/6雄性小鼠購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量(20±2)g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川) 2015-030，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(川) 2018-065。研究經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)201903-148)。

1.2 細(xì)胞 使用含10%血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)mTEC細(xì)胞，20 μg/mL LPS刺激以建立模型組，轉(zhuǎn)染lncRNA9884質(zhì)粒以建立lncRNA9884過表達(dá)組，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 藥物 黃芪三七合劑由黃芪3 g、三七1 g、懷牛膝3 g、當(dāng)歸3 g、昆布3 g組成，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)藥物劑量根據(jù)成人服用藥物劑量(3 943 mg/kg)進(jìn)行換算，小鼠體質(zhì)量22 g，則其每天灌胃劑量為每只86.746 mg；體外實(shí)驗(yàn)藥物劑量是用PBS稀釋至125 μg/mL，并以250 μg/mL加入培養(yǎng)基。

1.4 試劑 順鉑注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20040813，江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。LPS(貨號(hào)L2630，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；尿素氮檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C013-2-1)、HE染色試劑盒(貨號(hào)C0105)、肌酐檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C011-2-1)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PAS染色試劑盒(貨號(hào)G1285)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β(貨號(hào)M200108-001a)、IL-6(貨號(hào)M2001108-004a)、TNF-α(貨號(hào)M200716-102a)ELISA試劑盒均購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒(貨號(hào)DP419)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Go Script TM Reverse Transcription System(貨號(hào)A5001)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；IL-1β抗體(貨號(hào)SC-52012)、p-p65抗體(貨號(hào)SC-136548)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；IL-6抗體(貨號(hào)ab9324) 購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TNF-α抗體(貨號(hào)6945S)、MCP-1抗體(貨號(hào)2027S)、Kim-1抗體(貨號(hào)14971S)、p-YAP抗體(貨號(hào)13008S)、YAP抗體(貨號(hào)14074S)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；LipoD293TM(貨號(hào)11310)均購(gòu)自美國(guó)SignaGen公司。

1.5 儀器 LightCycler?480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組、造模與標(biāo)本制備 將18只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、給藥組，每組6只，模型組小鼠腹腔注射順鉑注射液(20 mg/kg)造模。造模后1 h，給藥組小鼠每天灌胃給予黃芪三七合劑(每只86.746 mg)，其余2組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)3 d。1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，于心尖部采血，置于4 ℃下過夜；采集腎臟，剝?nèi)グず笥?%多聚甲醛固定一部分組織，石蠟包埋，剩余部分提取RNA和蛋白。

2.2 mTEC細(xì)胞模型與過表達(dá)lncRNA9884構(gòu)建 在12孔板中加入3×105個(gè)mTEC細(xì)胞，每孔加入1 mL含10%血清的F12培養(yǎng)基，20 μg/mL LPS刺激mTEC細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型。在25 μL無血清培養(yǎng)基中加入1 μg lncRNA9884質(zhì)粒、3 μL LipoD293，混勻后加到mTEC細(xì)胞中，建立正常組、模型組、給藥組、過表達(dá)組、過表達(dá)給藥組，建模1 h后，給藥組加入250 μg/mL黃芪三七合劑，24 h后收集上清，提取細(xì)胞RNA。

2.3 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 取4 ℃過夜的小鼠血液，3 000 r/min離心15 min，取血清，根據(jù)試劑盒說明書操作檢測(cè)血尿素氮、血肌酐水平。

2.4 病理染色 在65 ℃烤箱中烘烤石蠟切片1.5 h，依次進(jìn)行二甲苯和乙醇脫蠟、復(fù)水，按照試劑盒說明書進(jìn)行HE、PAS染色。免疫組化染色檢測(cè)腎臟中IL-1β、IL-6、MCP-1表達(dá)，在脫蠟復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)，過氧化氫溶液阻斷，5% BSA封閉，加一抗(1∶200)4 ℃過夜，洗片，二抗孵育1 h，洗片后DAB顯色45 s，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

2.5 Western blot檢測(cè)腎臟組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 將裂解液加到30 mg腎組織中，在冰上碾碎并繼續(xù)裂解30 min，離心后取上清即得蛋白樣本，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，加入5×Loading Buffer，混勻后在100 ℃下煮沸10 min，在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中依次加樣，80 V恒壓電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，選定目的條帶后用5% BSA封閉，洗膜3次，每次5 min，加入1∶1 000比例稀釋的一抗p-YAP、YAP、p-NF-κB p65、Kim-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、GAPDH(1∶5 000)，在4 ℃搖床中過夜，加入二抗過氧化物酶結(jié)合山羊抗鼠IgG(貨號(hào)ZB-2305，1∶10 000)或山羊抗兔IgG(貨號(hào)ZB-2301，1∶10 000)，常溫下孵育1 h，凝膠成像分析儀成像，分析目的條帶灰度值。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)腎臟組織中相關(guān)基因的表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒說明書，在冰上提取30 mg小鼠腎臟組織RNA，加入40 μL RNase-free ddH2O，輕輕吹打混勻后使用分光分度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)lncRNA9884、MCP-1、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子水平 取小鼠血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟，檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

3 結(jié)果

3.1 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠腎功能和腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響 與模型組比較，給藥組小鼠尿素氮、血肌酐水平、腎小管損傷評(píng)分均降低(P<0.01)，見圖1A～1C。HE染色顯示，模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮壞死，腎小管間隙增寬，腎臟結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞；給藥組小鼠腎小管上皮細(xì)胞壞死減少，小管間隙變窄，腎臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)，見圖1D。PAS染色顯示，模型組小鼠腎臟可見有紫紅色糖原相關(guān)復(fù)合物沉積；給藥組小鼠腎臟紫紅色糖原相關(guān)復(fù)合物沉積有所減少，見圖1E。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠腎功能及腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of Huangqi Sanqi Mixture on renal function and pathological structure in AKI

3.2 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠炎癥因子mRNA表達(dá)和分泌水平的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組三者mRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2A～2C。ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組三者分泌水平均降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2D～2F。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠炎癥因子mRNA表達(dá)和分泌水平的影響Fig.2 Effects of Huangqi Sanqi Mixture on mRNA expressions and secretion levels of inflammatory factors in AKI

3.3 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠炎癥因子蛋白表達(dá)的影響 Western blot顯示，與正常組比較，模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組三者蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)，見圖3A。免疫組化結(jié)果與Western blot一致，見圖3B。

3.4 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠lncRNA9884和YAP/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響 RT-qPCR顯示，與正常組比較，模型組小鼠lncRNA9884表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組lncRNA9884表達(dá)降低(P<0.01)，見圖4A。Western blot顯示，與正常組比較，模型組小鼠磷酸化YAP、NF-κB p65、Kim-1表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組三者表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，見圖4B～4E。

3.5 黃芪三七合劑對(duì)mTEC細(xì)胞模型中l(wèi)ncRNA9884表達(dá)及炎癥因子mRNA表達(dá)和分泌水平的影響 與正常組比較，模型組lncRNA9884表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)；給藥組、過表達(dá)給藥組上述指標(biāo)均降低(P<0.05，P<0.01)，以給藥組更明顯(P<0.05)，見圖5A～5D。與模型組比較，給藥組、過表達(dá)給藥組IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平均降低(P<0.05)，以給藥組更明顯(P<0.05)，見圖5E～5G。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠炎癥因子蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Huangqi Sanqi Mixture on protein expressions of inflammatory factors in AKI

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 黃芪三七合劑對(duì)AKI小鼠lncRNA9884和YAP/NF-κB通路表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Huangqi Sanqi Mixture on expressions of lncRNA9884 and YAP/NF-κB signaling pathway in AKI

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與給藥組比較，△P<0.05。圖5 黃芪三七合劑對(duì)mTEC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA9884表達(dá)及炎癥因子mRNA表達(dá)和分泌水平的影響Fig.5 Effects of Huangqi Sanqi Mixture on lncRNA9884 expression and mRNA expressions and secretion levels of inflammatory factors in mTEC cells

4 討論

急性腎損傷(AKI)是一種發(fā)生率和死亡率較高的疾病。以往研究表明，順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷與ROS的惡化有關(guān)[12]，而ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可激活NF-κB通路[13]。本實(shí)驗(yàn)在順鉑誘導(dǎo)建立AKI小鼠模型的基礎(chǔ)上探討黃芪三七合劑改善AKI小鼠腎臟炎癥的作用和機(jī)制。黃芪三七合劑具有引經(jīng)報(bào)使，引血下行，引藥入腎的作用[14]。本研究體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了黃芪三七合劑具有改善腎臟功能和病理結(jié)構(gòu)，減輕病理改變和抑制腎臟炎癥的作用。該結(jié)果與在前期研究一致，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

相關(guān)研究顯示，YAP對(duì)炎癥具有促進(jìn)，且在糖尿病腎病小鼠模型和腎小球疾病患者腎組織中高表達(dá)，而NF-κB信號(hào)的抑制可以改善腎功能和炎癥[7-9]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，在急性腎損傷模型組中YAP磷酸化水平升高，同時(shí)NF-κB p65及相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)也升高；經(jīng)黃芪三七合劑治療后，p-YAP、NF-κB p65、炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均降低。因此，黃芪三七合劑治療小鼠急性腎損傷可能與YAP/NF-κB信號(hào)軸有關(guān)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程中發(fā)揮作用，還在多種疾病中具有促進(jìn)作用[15-16]。如lncRNA通過促進(jìn)磷酸化YAP激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[17-18]。本研究體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的模型組中l(wèi)ncRNA9884表達(dá)均升高；經(jīng)黃芪三七合劑治療后表達(dá)下降。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA9884，其炎癥因子的表達(dá)和分泌水平均高于正常組；過表達(dá)給藥組的治療效果也低于模型組，說明lncRNA9884在腎臟炎癥中具有促進(jìn)作用，抑制lncRNA9884的表達(dá)對(duì)腎臟有保護(hù)作用。

綜上所述，黃芪三七合劑在體內(nèi)、體外均有抑制炎癥的作用，其機(jī)制可能是黃芪三七合劑抑制lncRNA9884的表達(dá)，減弱YAP和NF-κB信號(hào)通路活性，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果可能是黃芪三七合劑改善急性腎損傷炎癥的一種新機(jī)制，但還需進(jìn)一步深入探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為復(fù)方制劑黃芪三七合劑在臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，并為lncRNA9884作為急性腎損傷治療的新靶點(diǎn)提供研究思路。