蘋果銹果類病毒內(nèi)蒙古金紅分離物的基因組序列分析

袁彧偉，付崇毅，孫平平，馬 強(qiáng)，張 斌，李正男，張 磊

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031；3 內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022)

蘋果銹果類病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae)蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid)成員[1]。ASSVd基因組為單鏈環(huán)狀RNA，全長(zhǎng)329～334 nt，具有棒狀或擬桿狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可分為左末端區(qū)(left terminal domain，TL)、致病區(qū)(pathogenicity domian，P)、中央保守區(qū)(central domain，C)、可變區(qū)(variable domain，V)和右末端區(qū)(right terminal domain，TR)5個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中可變區(qū)(V)與ASSVd在不同植物寄主上引起的癥狀差異有關(guān)[2]。ASSVd具有自我復(fù)制功能，但不編碼蛋白，而是依賴寄主的蛋白來(lái)完成轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制和致病等功能。早在20世紀(jì)30年代，Ohtsuka等在中國(guó)種植的國(guó)光蘋果上發(fā)現(xiàn)了蘋果銹果病[3]。1985年，陳煒等[4]從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院鄭州果樹(shù)所、北戴河海濱園藝場(chǎng)和西山園藝場(chǎng)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所等地采集的表現(xiàn)為銹果、裂果的國(guó)光、雞冠和白龍等蘋果樣品中檢測(cè)到了環(huán)狀RNA分子，這是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)ASSVd的RNA。1987年，Hashimoto等[5]首次報(bào)道了全長(zhǎng)為329 nt的ASSVd日本分離物完整基因組序列。越來(lái)越多的研究證明，ASSVd在世界范圍內(nèi)廣泛分布。20世紀(jì)50年代曾在美國(guó)蘋果園出現(xiàn)的“蘋果斑紋病”，后又陸續(xù)出現(xiàn)的中國(guó)梨樹(shù)“梨銹皮病”、“梨皺果病”，以及給日本造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的“日本梨凹果病”等，均與ASSVd有關(guān)[6-8]。

ASSVd侵染蘋果可引起蘋果銹果病和蘋果花臉病，癥狀主要表現(xiàn)在果實(shí)上，包括果皮表面著色不均勻、出現(xiàn)斑紋或鐵銹狀斑，果實(shí)畸形、開(kāi)裂等，不僅影響蘋果產(chǎn)量，而且還影響蘋果品質(zhì)，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除此之外，ASSVd還可危害梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)、杏(Prunusarmeniaca)、野櫻桃(Prunuscerasoides)等果樹(shù)，導(dǎo)致其果實(shí)表面出現(xiàn)瘢痕、斑紋，失去商品價(jià)值，具體癥狀與果樹(shù)品種有關(guān)[9-12]。Walia等[13]通過(guò)構(gòu)建ASSVd的侵染性克隆，證明ASSVd還可以侵染黃瓜(Cucumissativus)、番茄(Solanumlycopersicum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、豌豆(Pisumsativum)、茄子(Solanummelongena)、本氏煙(Nicotianabenthamiana)、心葉煙(Nicotianaglutinosa)、普通煙(Nicotianatabacum)、昆諾黎(Chenopodiumquinoa)等草本寄主，其中侵染黃瓜后可導(dǎo)致黃瓜植株輕度發(fā)育不良和葉片褪綠，侵染菜豆后導(dǎo)致菜豆植株葉片脈間褪綠等癥狀，但其他草本寄主均未表現(xiàn)癥狀。ASSVd主要通過(guò)嫁接和機(jī)械摩擦傳播，但在蘋果和梨上發(fā)現(xiàn)種子可以帶毒[14]，已有研究發(fā)現(xiàn)溫室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)可將ASSVd裸露的RNA傳播給黃瓜、番茄、菜豆等草本植物[15]。

一直以來(lái)，ASSVd都是阻礙我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要病原物之一。樹(shù)體一旦感染ASSVd將終身帶毒，即使根除感病果樹(shù)，果園中仍會(huì)再次出現(xiàn)果樹(shù)發(fā)病的現(xiàn)象，這一問(wèn)題在遼寧[16]、山東[17]、河北[18]、新疆[19]、陜西[20]等地均有報(bào)道。內(nèi)蒙古自治區(qū)屬于我國(guó)東北冷寒蘋果產(chǎn)區(qū)，主要栽培蘋果有雞心果、黃太平、金紅等小蘋果，在赤峰等地還有寒富和富士等大蘋果，近年來(lái)已經(jīng)有ASSVd在內(nèi)蒙古地區(qū)雞心果上發(fā)生的報(bào)道[18]，但在金紅和黃太平蘋果品種上尚無(wú)ASSVd發(fā)生的報(bào)道。本研究在內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)表現(xiàn)花臉癥狀的金紅蘋果上檢測(cè)到ASSVd的發(fā)生，克隆測(cè)序了其全長(zhǎng)基因組，并對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行分析，以期為蘋果銹果類病毒的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020年8月，在內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)的8株金紅蘋果樹(shù)中，發(fā)現(xiàn)有3株果實(shí)表現(xiàn)出花臉癥狀(圖1)，采集3株有花臉癥狀和2株果面正常的金紅蘋果葉片，用錫箔紙包裹，液氮速凍后立刻帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱備用。

SpectrumTMPlant Total RNA Kit，購(gòu)自Sigma公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EscherichiacoliJM109 Competent Cells等，購(gòu)自TaKaRa公司；零背景pTOPO-TA 克隆試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；2×M5 Hiper超光速mix，購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit，購(gòu)自O(shè)mega公司；其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自天根生物有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用SpectrumTMPlant Total RNA Kit從采集的花臉癥狀和正常金紅蘋果葉片樣品中提取植物總RNA，提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)?？俁NA經(jīng)Nano-300微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)測(cè)定濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后保存于-80 ℃冰箱中備用。以獲得的總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄體系：以1 μg植物總RNA為模板，Ramdom 6 primer(50 μmol/L)為引物,加入1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，用RNase free dH2O補(bǔ)足至10 μL，65 ℃ 5 min，冰置2 min。變性后在反應(yīng)液內(nèi)再加入4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/μL)、1 μL PrimeScript Ⅱ RTase(200 U/μL)，用RNase free H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后將獲得的cDNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)及全長(zhǎng)基因組擴(kuò)增 根據(jù)NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中211條ASSVd基因組信息，設(shè)計(jì)1對(duì)用于檢測(cè)和擴(kuò)增ASSVd基因組的引物，上游引物ASSf：GGTAAACACCGTGCGGTCCC，下游引物ASSr：GGGAAACACCTATTGTGTTT，退火溫度52 ℃，目標(biāo)片段長(zhǎng)330 bp。

用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行ASSVd的RT-PCR檢測(cè)，以ASSf、ASSr為引物，反應(yīng)體系：2×M5 Hiper超光速mix 10 μL，上游引物ASSf 1 μL，下游引物ASSr 1 μL，cDNA模板2 μL，用RNase free H2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，在紫外燈下切取目標(biāo)片段，用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit試劑盒回收純化目的片段。利用TA克隆試劑盒將目的片段連接到pTOPO-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化EscherichiacoliJM109 Competent Cells，經(jīng)菌液PCR鑒定后挑選陽(yáng)性克隆送至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析 將得到的ASSVd全長(zhǎng)序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastn程序進(jìn)行同源性搜索，再?gòu)腉enBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載具有代表性的ASSVd分離物序列，用于后續(xù)一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析?；谌L(zhǎng)基因組核苷酸序列，用MEGA 6.0軟件對(duì)本試驗(yàn)獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物以及從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的來(lái)自不同地區(qū)和不同寄主的15個(gè)ASSVd分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以蘋果凹果類病毒(apple dimple fruit viroid，ADFVd)意大利坎帕尼亞蘋果分離物作為外群，自展值設(shè)為1 000。用于分析的ASSVd及ADFVd分離物基因組序列信息如表1所示。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析與核酸一致性分析的ASSVd和ADFVd分離物基因組序列Table 1 Sequences of ASSVd and ADFVd genome used for phylogenetic and identity analyses

1.2.4 多重對(duì)比分析 研究表明，ASSVd基因組中的核苷酸位點(diǎn)插入、缺失、替換等變異主要集中在致病區(qū)，且各位點(diǎn)是否發(fā)生變異與寄主的種類有關(guān)[21]。因此利用DNAMAN軟件，對(duì)獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與不同地區(qū)、不同寄主種類的ASSVd分離物進(jìn)行序列多重對(duì)比分析。

1.2.5 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) ASSVd基因組為閉合環(huán)狀RNA，容易形成棒狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)線上分析工具RNA Folding Form對(duì)ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物的基因組二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物的RT-PCR檢測(cè)

ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

從表現(xiàn)花臉癥狀的金紅蘋果葉片樣品中提取植物總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增到長(zhǎng)約330 bp的條帶，與目標(biāo)片段大小一致，2株果面健康的蘋果葉片樣品中沒(méi)有獲得任何PCR產(chǎn)物(圖2)。

2.2 ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物的測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析

將3個(gè)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品分別送3個(gè)陽(yáng)性克隆至華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，9個(gè)陽(yáng)性克隆之間的一致性為100%，所以選擇其中1條序列進(jìn)行后續(xù)分析。將序列提交至NCBI，獲得GenBank登錄號(hào)為MZ476527。將獲得序列通過(guò)Blastn程序進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與ASSVd新疆梨分離物(JX861258)的一致性最高，為97.9%，表明花臉癥狀的金紅蘋果確實(shí)感染了ASSVd。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載具有代表性，且分布不同地區(qū)和不同寄主種類的ASSVd分離物全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3顯示，所有ASSVd分離物分成2個(gè)組群，外群蘋果凹果類病毒為一個(gè)獨(dú)立的組群，ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與新疆梨分離物(JX861258)、內(nèi)蒙古塞外紅蘋果分離物(MN598205)、北京蘋果分離物(HQ840722)、山東蘋果分離物(KY963660)、新疆庫(kù)爾勒蘋果分離物(KC110859)、內(nèi)蒙古塞外紅蘋果分離物(MN598204)和加拿大蘋果分離物(X71599)聚集在一個(gè)組群內(nèi)，其中ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與新疆梨分離物(JX861258)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，與內(nèi)蒙古塞外紅蘋果分離物(MN598205)次之。ASSVd分離物的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，其系統(tǒng)發(fā)育與地理來(lái)源和寄主種類的相關(guān)性不大。

2.3 ASSVd序列一致性和多重對(duì)比分析

本研究獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的其他15個(gè)ASSVd分離物的基因組核苷酸序列一致性為87.5%～97.9%，其中ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與新疆梨分離物(JX861258)的核苷酸一致性最高，為97.9%，與內(nèi)蒙古塞外紅蘋果分離物(MN598204)的核苷酸一致性最低，為87.5%。選擇部分具有代表性的ASSVd分離物，利用DNAMAN軟件與本研究獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物進(jìn)行序列多重對(duì)比分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，ASSVd各分離物之間的核苷酸一致性較高，左末端區(qū)和中央保守區(qū)的保守區(qū)域同源性都很高。第39～53位核苷酸和第244～263位核苷酸是變異較大的2個(gè)區(qū)域，且均集中在基因組的致病區(qū)及與其相鄰區(qū)域的連接處，具體為左末端區(qū)、致病區(qū)和中央保守區(qū)。

參照劉娟[21]、劉洪玉等[22]、陳冉冉等[23]的研究，以Puchta等[24]1990年在中國(guó)蘋果上獲得的ASSVd分離物全長(zhǎng)序列(NC001340)為標(biāo)準(zhǔn)序列，將ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物序列(MZ476527)與其進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2個(gè)分離物序列之間的一致性為91.1%，共有38個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變異(圖5)。由圖5可知，獲得序列中有33個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生替換，2個(gè)核苷酸位點(diǎn)缺失(G115,C254)，3個(gè)核苷酸位點(diǎn)插入(A124,T177,C210)，且主要集中在中央保守區(qū)、可變區(qū)和右末端區(qū)。但是這種對(duì)比方法適用于劉娟[21]在獲得多條ASSVd全長(zhǎng)序列或多個(gè)ASSVd分離物時(shí)進(jìn)行分析，所以本試驗(yàn)只就多重對(duì)比分析結(jié)果進(jìn)行討論。

2.4 ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)工具RNA Folding Form，導(dǎo)入本試驗(yàn)獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物全基因組序列，選擇環(huán)狀RNA，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，預(yù)測(cè)結(jié)果(圖6)表明，自由能為-499.49 kJ/mol。ASSVd的基因組為環(huán)狀單鏈RNA,容易形成穩(wěn)定的桿狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，且其中有許多“環(huán)”。

3 討 論

與其他馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科的類病毒相比，ASSVd缺少中央保守區(qū)域的GAAAC序列，并且與他們的序列同源性也很低[5]。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和ASSVd同屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科，是馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬(Pospiviroid)的代表種。PSTVd與ASSVd在部分區(qū)域存在同源序列，研究證明其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上的“環(huán)”對(duì)于PSTVd的復(fù)制和轉(zhuǎn)運(yùn)極其重要，并且5個(gè)結(jié)構(gòu)域都與癥狀的表達(dá)有關(guān)[25]。有研究者認(rèn)為,ASSVd的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能也有同樣的作用[17]，但還需要更深入的研究來(lái)證明[17]。PSTVd的中央保守區(qū)形成穩(wěn)定的雙相結(jié)構(gòu)，可以折疊成一個(gè)具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的PSTVd分子，認(rèn)為其是類病毒復(fù)制中間體加工的關(guān)鍵，在PSTVd及其他類病毒的復(fù)制和加工中發(fā)揮著重要作用，但在ASSVd上的類似功能仍然不確定，還需要對(duì)ASSVd的二級(jí)結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步研究。

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與新疆梨分離物(JX861258)的親緣關(guān)系最近，核苷酸序列一致性也最高，為97.9%；其次是內(nèi)蒙古塞外紅蘋果分離物(MN598205)，二者序列一致性為97.0%。本試驗(yàn)所采集的感病金紅樣品來(lái)自呼和浩特市，而感病塞外紅蘋果來(lái)自通遼市，兩者的砧木同為山定子(MalusbaccataBorkh.)，但本試驗(yàn)所用金紅已有18年樹(shù)齡，獲得的ASSVd分離物是否是由感病植物材料的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸導(dǎo)致的，目前還不能確定。將本試驗(yàn)獲得的ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與來(lái)自不同地區(qū)和不同寄主種類的ASSVd分離物進(jìn)行多重對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，變異位點(diǎn)主要集中在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的左末端區(qū)、致病區(qū)和中央保守區(qū)，這與劉洪玉等[22]對(duì)ASSVd山東舞美蘋果分離物、張富軍等[17]對(duì)ASSVd山東火焰海棠蘋果分離物、趙玲玲等[26]對(duì)ASSVd煙臺(tái)富士蘋果分離物的研究結(jié)果一致,但與Yazarlou等[27]“ASSVd變異位點(diǎn)集中在左端區(qū)、致病區(qū)和右端區(qū)”的研究結(jié)果稍有出入。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與序列對(duì)比結(jié)果一致，ASSVd內(nèi)蒙古金紅分離物與山東蘋果分離物(KY963660)在同一個(gè)組群中，而伊朗蘋果分離物(HQ326090)在另一個(gè)組群。印度學(xué)者Walia等[13]用構(gòu)建的ASSVd侵染性克隆成功侵染黃瓜并表現(xiàn)癥狀后，通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，從被侵染黃瓜中獲得的類病毒子代中存在4種類型的序列變異，形成了V1、V2、V3、V4 4個(gè)變種。其中V1和V3屬于優(yōu)勢(shì)變種，在草本寄主黃瓜上的侵染力和癥狀表達(dá)存在差異；V1與野生型ASSVd的同源性為96%，兩者間的差異主要體現(xiàn)在二級(jí)結(jié)構(gòu)致病區(qū)的10個(gè)核苷酸位點(diǎn)，并且這些核苷酸位點(diǎn)的變化導(dǎo)致了V1二級(jí)結(jié)構(gòu)左端區(qū)第9個(gè)“環(huán)”發(fā)生了改變。查富蓉[28]通過(guò)對(duì)山東、山西、遼寧等地不同蘋果品種的ASSVd分離物序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)10個(gè)特異性的變異位點(diǎn)，并且部分中國(guó)分離物會(huì)聚成一個(gè)獨(dú)特的組群。ASSVd某些核苷酸位點(diǎn)的變異會(huì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這可能與抵抗寄主的防御機(jī)制或增強(qiáng)對(duì)新寄主的適應(yīng)能力有關(guān)，也可能與不同分離物的系統(tǒng)發(fā)育分支結(jié)果有關(guān)。本試驗(yàn)所獲得的分離物序列樣本較少，要進(jìn)行深入研究還需要更多的序列對(duì)比結(jié)果。

內(nèi)蒙古屬于我國(guó)東北冷寒蘋果產(chǎn)區(qū)，主栽蘋果品種具有較強(qiáng)耐寒性、抗旱性，其中小蘋果是極具地方特色，深受消費(fèi)者喜愛(ài)的一類蘋果，因其果形小、果質(zhì)量小而稱為小蘋果。2013年郝璐等[29]在北京蘋果園首次發(fā)現(xiàn)小蘋果被ASSVd侵染，后續(xù)Li等[18]在內(nèi)蒙古、河北、遼寧等地種植的小蘋果塞外紅上也檢測(cè)到ASSVd。本研究在內(nèi)蒙古表現(xiàn)花臉的金紅蘋果上也檢測(cè)到ASSVd。ASSVd主要靠嫁接傳播，侵染果樹(shù)后有一定的潛伏期，感病果樹(shù)可能不會(huì)立即顯癥，因此需要通過(guò)嚴(yán)把植物材料轉(zhuǎn)運(yùn)檢疫關(guān)，嫁接時(shí)注意工具的消毒，以及利用植物病毒檢測(cè)技術(shù)加強(qiáng)對(duì)蘋果產(chǎn)區(qū)各果園內(nèi)ASSVd的監(jiān)測(cè)等手段來(lái)進(jìn)行防控。