玉米ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表達及抗體制備

張帥磊，趙天永

(西北農林科技大學 生命科學學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

玉米是世界上主要的谷類作物。由于干旱、高溫等非生物脅迫會嚴重影響玉米種子的萌發(fā)和后期產量[1]，因此研究相關基因在不同組織、不同細胞以及不同逆境脅迫條件下的表達水平，鑒定抗逆基因的功能對通過生物技術育種提高玉米產量非常重要[2]。但確定相關基因的表達水平需要選擇合適的內參基因，對目標基因的表達水平進行校正和標準化處理[3-4]。在糖酵解途徑中發(fā)揮重要作用的三磷酸甘油醛(GAPDH)和構成微絲骨架的肌動蛋白(ACTIN)被廣泛用于衡量目標基因的表達[5-8]。在植物中，GAPDH涉及花粉發(fā)育[9]、根系生長[10]、脂質代謝[11]和種子內油料的積累[12]，能夠在一些組織和器官中穩(wěn)定表達，這使其成為重要的內參基因之一。ACTIN廣泛存在于真核生物中，其形成的微絲骨架是細胞生命的基礎。高等植物中ACTINmRNA的表達高度穩(wěn)定[13]，這為其作為內參基因奠定了基礎。Schmidt等[14]利用實時定量PCR檢測了煙草不同組織中8種潛在內參基因的表達，其中L25和EF-1α的表達穩(wěn)定性最高。Huang等[15]對紫外線照射、激素刺激等條件下馬藍中10個候選內參基因的mRNA水平進行了評估，證明18S rRNA最為穩(wěn)定。對歐洲油菜的8個候選內參基因進行鑒定表達發(fā)現(xiàn)，ACT7 mRNA在成熟胚胎中的變化相對穩(wěn)定[16]。Cao等[17]發(fā)現(xiàn)，球藻在不同光強、不同溫度處理下的最佳內參基因不同，其中ACT2在所有測試樣本中的表達相對穩(wěn)定。Zemp等[18]從白色剪秋蘿的RNA-seq數(shù)據(jù)中選擇了傳統(tǒng)和新鑒定的共15個內參基因，利用實時定量PCR分析了生殖和營養(yǎng)組織中各個內參基因的表達差異，結果表明SL_ACTIN和SL_GAPDH在花蕾中的表達最為穩(wěn)定，而在葉中SL_UBCE的表達最穩(wěn)定。在進行基因表達研究時，需要有一個普遍表達的內部標準或管家基因作為參考，以準確衡量靶基因的表達程度[19]。近年來，實時定量PCR已被應用于分析內參基因的轉錄水平[20]，然而內參蛋白的表達分析一直被忽視。因此，本研究克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN，在原核細胞中表達相應的蛋白，制備其多克隆抗體，利用RT-PCR和Western blot分析了ZmGAPDH和ZmACTIN在熱激下的轉錄和翻譯水平，以期為進一步選擇玉米中的內參基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料、菌株和載體 玉米B73自交系、大腸桿菌BL21(DE3)和RG2菌株、原核表達載體pET-28a，均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 高保真DNA聚合酶、同源重組酶，購自Vazyme公司；限制性內切酶、植物總RNA提取Trizol試劑盒，購自Takara公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自Omega Bio-Tek公司；反轉錄試劑盒，購自Roche公司；弗氏完全佐劑和不完全弗氏佐劑，購自Sigma公司；PVDF膜，購自Millipore公司；HRP標記的羊抗兔抗體IgG，購自北京康為世紀生物科技公司；蛋白免疫印跡化學發(fā)光試劑盒，購自Zeta life公司；其他試劑均為進口或國產分析純試劑。超聲波細胞破碎儀(JY92-ⅡDN)購自寧波Scientz公司；核酸蛋白檢測儀(Nanodrop 1000)，購自基因有限公司。

1.2 試驗處理

試驗于2020年11月至2021年3月在陜西楊凌西北農林科技大學進行。將玉米B73種子在蒸餾水中浸泡12 h，然后放在發(fā)芽紙上避光萌發(fā)3 d，隨后在12 h光(28 ℃、(900±54) μmol/(m2·s))/12 h暗(25 ℃)條件下水培14 d至三葉期。將三葉期幼苗轉入12 h光(42 ℃、(900±54) μmol/(m2·s))/12 h暗(42 ℃)的培養(yǎng)箱中進行熱激，分別在熱激后0，2，4和8 h采集地上葉片。

1.3 方 法

1.3.1 ZmGAPDH和ZmACTIN與其他植物中同源蛋白的氨基酸序列比對 玉米及其他植物GAPDH和ACTIN的氨基酸序列通過phytozome 網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)搜索得到，并使用DNAMAN 7軟件進行氨基酸序列比對。

1.3.2 總RNA的提取、目的基因片段的克隆和RT-PCR擴增 使用Trizol試劑盒從三葉期玉米B73葉片中提取總RNA[21]。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 1000分光光度計確定RNA的完整性、濃度和純度。使用反轉錄試劑盒獲得cDNA，然后用DEPC-水稀釋50倍，用作基因克隆和RT-PCR的模板。利用 Primer 5.0軟件設計用于克隆和RT-PCR的引物。ZmGAPDH-F(5′-ATGGGT-CGCGGATCCATGGGCAAGATTAAGATCGGA-ATC-3′)和ZmGAPDH-R(5′-TGCGGCCGCAAG-CTTCTGGGTCTTGAACATGTGGCG-3′)用于擴增ZmGAPDH的CDS序列，ZmACTIN-F1(5′-ATGGGTCGCGGATCCATGGCTGACGAGGAT-ATCCAGC-3′)和ZmACTIN-R1(5′-TGCGGCCGCAAGCTTGAAGCACTTCATGTGGACAATGC-3′)用于擴增ZmACTIN的CDS序列。為便于連接載體，引物中包含了限制性內切酶位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。ZmGAPDH-RTF(5′-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3′)和ZmGAPDH-RTR(5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3′)用于ZmGAPDH的RT-PCR,ZmACTIN-RTF(5′-CTATCCAGGCTGTTCTTTCGTT-3′)和ZmACTIN-RTR(5′-TCAGGCATCTCGTAGCTCTTCT-3′)用于Zm-ACTIN的RT-PCR,ZmRAFS-RTF(5′-CGTGGGACGCCTTCTACCT-3′)和ZmRAFS-RTR(5′-CCCTGCTTGTACTCCCTGAAC-3′)用于對照玉米棉子糖合成酶基因(ZmRAFS)的RT-PCR。

1.3.3 目的基因原核表達載體的構建 將原核表達載體pET-28a用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，割膠回收,同時將擴增成功的ZmGAPDH和ZmACTIN目的片段割膠回收，使用同源重組的方法連接目的片段與載體。使用熱激方法將pET-28a-ZmGAPDH重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，將pET-28a-ZmACTIN重組質粒轉化大腸桿菌RG2，將pET-28a空載體轉化大腸桿菌BL21和RG2作為對照。通過菌落PCR和酶切鑒定陽性克隆,將陽性單菌落測序驗證。

1.3.4 重組蛋白的誘導表達及透析純化 分別挑取測序成功的陽性單菌落和對照于含50 μg/mL卡那霉素的30 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、165 r/min 培養(yǎng)至OD600為1.0，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)14 h。分別收集1 mL誘導前和誘導后菌液，4 ℃、12 000g離心1 min，棄上清，加入40 μL 1×PBS懸浮菌體、10 μL 5×loading buffer(1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)、質量分數(shù)10%十二烷基磺酸鈉、質量分數(shù)0.5%溴酚藍和體積分數(shù)50%甘油沸水浴15 min，取5 μL用8% SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的誘導表達情況。

小規(guī)模表達成功后，將菌株按1∶100的體積比轉接到150 mL含50 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，按照原條件進行目的蛋白的大規(guī)模誘導表達。常溫下8 000g離心10 min收集菌體，去上清，用10 mL 1×PBS懸浮菌體，再用超聲波細胞破碎儀破菌30 min，功率180 W，間隔4 min,破菌3 min。用2 mL EP管收集菌體，4 ℃、12 000g離心10 min，去上清，每管菌體用80 μL 1×PBS懸浮，加入20 μL 5×loading buffer沸水浴15 min。用SDS-PAGE蛋白凝膠對懸浮菌體中的蛋白粗提物進行分離，利用0.25 mol/L KCl對整個蛋白膠進行負染，割取目的條帶置于含Tris-glycine緩沖液(25 mmol/L Tris(pH 12.5)、250 mmol/L甘氨酸、0.5%(質量分數(shù))十二烷基磺酸鈉)的透析袋中進行電泳，純化回收蛋白。取40 μL純化蛋白，加入10 μL 5×loading buffer沸水浴15 min，取5 μL用8% SDS-PAGE電泳檢測透析純化后的重組蛋白，并進行考馬斯亮藍(CBB)染色。

1.3.5 抗體血清制備及驗證 用蛋白免疫家兔產生ZmGAPDH和ZmACTIN的多克隆抗體。每隔14 d對家兔接種1次，共接種4次。初次免疫采用純化的蛋白(200 μg)與500 μL弗氏完全佐劑混合液;之后3次免疫用純化的蛋白(100 μg)與500 μL弗氏不完全佐劑混合液。在第4次免疫后7 d抽取家兔心臟血采集血清。

分別取40，4，0.4，0.04 ng的ZmGAPDH蛋白和ZmACTIN蛋白進行8% SDS-PAGE電泳。以制備的多抗血清(1∶5 000稀釋)為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG(1∶20 000稀釋)為二抗，進行Western blot檢測。

1.3.6 提取植物總蛋白和多克隆抗體特異性檢測 取熱激后的玉米B73三葉期葉片0.2 g，放入液氮中研磨至粉末后裝入1.5 mL EP管中，分別加入250 μL蛋白萃取液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L乙二胺四乙酸(pH 8.0)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、2%(體積分數(shù))β-巰基乙醇)，4 ℃、16 000g離心15 min，使用Bradford’s assay方法測定上清中的蛋白濃度[22]。Western blot鑒定ZmGAPDH蛋白和ZmACTIN蛋白的表達水平[23]。以制備的多抗血清(1∶5 000稀釋)為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG(1∶20 000稀釋)為二抗。檢測ZmRAFS、ZmACTIN和ZmGAPDH時的Western blot 總蛋白上樣量分別為60，6，6 μg，用30 μg總蛋白進行CBB染色。

2 結果與分析

2.1 ZmGAPDH和ZmACTIN與其他植物的氨基酸序列比對

ZmGAPDH與其他植物同源蛋白的氨基酸序列相似度為84.00%～97.63%，其中與水稻、擬南芥、大豆、高粱、棉花、谷子和小麥中GAPDH的氨基酸序列相似度分別為92.28%，84.00%，85.00%，97.63%，87.24%，94.66%和94.36%(圖1-A)。ZmACTIN與其他植物同源蛋白的氨基酸序列相似度為91.76%～99.20%(圖1-B)。

這一結果表明，GAPDH和ACTIN在植物中都極為保守，推測利用玉米的GAPDH和ACTIN序列制備的抗體可能也適用于檢測其他植物中GAPDH和ACTIN蛋白的表達。

2.2 pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN原核表達載體的構建

以玉米B73的cDNA為模板，利用1.3.2中設計的特異性引物，擴增得到1 014 bp 的ZmGAPDH目的片段和1 131 bp的ZmACTIN目的片段(圖2)。

將目的片段連接至表達載體pET-28a后，挑取陽性克隆提取質粒，經BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切驗證得到5 300 kb的質粒骨架和1 014 bp的Zm-GAPDH預期片段。因為在ZmACTIN編碼區(qū)序列中有1個Hind Ⅲ限制性內切酶位點，所以雙酶切pET-28a-ZmACTIN重組質粒得到長647 bp和484 bp 2條條帶(圖3)。經測序結果正確，說明成功地將ZmGAPDH和ZmACTIN的完整編碼區(qū)克隆到了原核表達載體pET-28a中。

2.3 重組蛋白ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表達及透析純化

ZmGAPDH和ZmACTIN重組蛋白的誘導表達結果見圖4。

通過SDS-PAGE檢測轉化菌株的溶菌產物(圖4-A)，CBB染色發(fā)現(xiàn)轉化空載體的菌液中無目的蛋白；與誘導前相比，在誘導后含重組載體的菌液中發(fā)現(xiàn)目的蛋白。其中ZmGAPDH蛋白分子質量約為41 ku,ZmACTIN蛋白分子質量約為46 ku，均與預測相符。由于目的蛋白條帶清晰可見，表達量高，可以通過透析純化的方法收集蛋白。CBB染色表明純化的蛋白濃度較高，條帶單一(圖4-B)。

2.4 ZmGAPDH和ZmACTIN多克隆抗體免疫印跡檢測

將多克隆抗體血清按照1∶5 000稀釋，ZmGAPDH和ZmACTIN重組蛋白互為對照,結果(圖5)顯示，40 ng無關蛋白只能檢測到微弱信號，但目的蛋白低至4 ng時檢測信號仍非常強烈，這表明抗體的特異性很好。

2.5 多克隆抗體對植物內源性蛋白的特異性檢測

為了驗證ZmGAPDH和ZmACTIN作為內參基因的有效性，以玉米棉子糖合成酶基因ZmRAFS為對照，檢測了熱激條件下三葉期玉米B73葉片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)ZmGAPDH和ZmACTINmRNA的豐度在葉片中較穩(wěn)定(圖6-A)，并且熱激也未誘導ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白的積累(圖6-B)。通過1%的瓊脂糖凝膠發(fā)現(xiàn)提取的總RNA完整且無降解現(xiàn)象；CBB染色表明每個泳道總蛋白的上樣量一致。說明ZmGAPDH和ZmACTIN可以用作內參基因研究熱激條件下目標基因的表達水平。

3 討 論

原核表達系統(tǒng)通常用于制備抗體，其中pET質粒是最常用的載體。然而目標蛋白的表達水平有時會很低，這除與誘導條件如溫度、OD值、IPTG濃度有關外，還可能與目標蛋白本身的性質有關[24]，這就需要融合標簽進行親和純化。在本研究中，目的蛋白表達水平高，可能是目的基因在植物體中本身為組成型表達所致。因此，本研究使用更為簡單的透析純化技術來獲取蛋白。

大多數(shù)通路的合成酶基因(如ZmRAFS)是通過蛋白來發(fā)揮功能[25]，僅使用實時定量PCR歸一化基因的表達會顯得有失偏頗。本研究制備了ZmGAPDH和ZmACTIN抗體，并檢測熱激脅迫下玉米B73葉片中ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)目標蛋白在不同處理條件下表達水平一致，說明其均不響應熱激。ZmGAPDH和ZmACTIN可以作為內參基因用于熱激條件下玉米相關基因表達水平的檢測，這為植物中內參蛋白的表達分析提供了參考。但ZmACTIN抗體檢測到的ZmACTIN蛋白主帶只存在微弱帶條，就此結果而言，ZmGAPDH抗體的檢測效果較 ZmACTIN抗體好。