高效陰離子交換-積分脈沖法檢測(cè)氨基寡糖素農(nóng)藥中游離氨基葡萄糖

陳煒瑤, 吳國權(quán), 李 彬, 高凡欽

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000；2. 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543000；3. 賽默飛世爾科技 (中國)有限公司，上海 200135)

氨基寡糖素又稱殼寡糖，是指D-氨基葡萄糖(GIcN) 以β-1,4 糖苷鍵連接的低聚糖，是一種低毒殺菌劑，可對(duì)多種病原菌的生長產(chǎn)生抑制作用，如影響真菌孢子萌發(fā)、誘發(fā)菌絲形態(tài)發(fā)生變異、使菌絲細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)發(fā)生改變等。此外，氨基寡糖素還能激發(fā)植物體內(nèi)的基因表達(dá)，產(chǎn)生具有抗病作用的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、植保素及PR 蛋白等，并具有細(xì)胞活化作用，有助于受害植株的恢復(fù)，促根壯苗，增強(qiáng)作物的抗逆性，促進(jìn)植物生長發(fā)育[1-2]。

氨基寡糖素同時(shí)具有殺菌及營養(yǎng)功能，使用過程中具有高效、低成本、無公害等特點(diǎn)，對(duì)中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義，因此農(nóng)業(yè)部2016年下發(fā)了關(guān)于氨基寡糖素母藥 (NY/T 2889.1—2016) 及水劑 (NY/T 2889.2—2016) 質(zhì)量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)游離的氨基葡萄糖的限量作了明確規(guī)定。目前，國內(nèi)外對(duì)氨基寡糖素中游離氨基葡萄糖的定量方法研究報(bào)道相對(duì)較少。李娟等[5]采用CarboPacPA10 分離了氨基寡糖素與氨基葡萄糖，但氨基葡萄糖易受到殼四糖與殼三糖的干擾，分離度達(dá)不到要求，定量容易受到干擾，尤其是在游離氨基葡萄糖含量較低時(shí)；劉艷霞[6]采用分光光度法檢測(cè)了氨基寡糖素水劑中有效成分氨基寡糖素的含量，邵波等[7]采用離子色譜法快速檢測(cè)了氨基寡糖素的含量，但并未對(duì)游離氨基葡萄糖進(jìn)行定量研究。為解決氨基寡糖素與氨基葡萄糖之間分離度低的問題，本研究采用高效陰離子交換-積分脈沖法，在分析柱DionexCarboPac PA100 前添加一個(gè)氨基保護(hù)柱，利用氨基寡糖素與氨基葡萄糖分子中所帶的氨基數(shù)量不同導(dǎo)致在氨基捕獲柱上保留行為差異的特點(diǎn)，嘗試將氨基葡萄糖與氨基寡糖素進(jìn)行分離，并對(duì)其中的游離氨基葡萄糖進(jìn)行了定量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo ScientificTMDionexTMICS-6000 離子色譜系統(tǒng)，包括：ICS-6000 四元梯度泵模塊、ICS-6000 DC 模塊 (含安培檢測(cè)器) 、工作電極Au、參比電極Ag/AgCl；Thermo ScientificTMDionexTMAS-AP 自動(dòng)進(jìn)樣器；Thermo Scientific? Dionex?Chromeleon? 色譜工作站。

氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (純度≥98%，BOC Sciences) ；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鈉溶液 (美國Fisher 公司) ；氨基寡糖素母藥 (純度≥85%，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司) 。

1.2 色譜條件

保護(hù)柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×50 mm；分析柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×250 mm；氨基捕獲柱：DionexAminoTrap Column，4 mm × 50 mm。柱溫30 ℃；檢測(cè)器箱控溫30 ℃；定量環(huán)25 μL；安培檢測(cè)器；工作電極：Au；參比電極：Ag/AgCl；波形：標(biāo)準(zhǔn)四電位波形。淋洗液及梯度條件見表1。

表1 淋洗液梯度程序Table 1 Eluent gradient program

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基捕獲柱對(duì)主成分及目標(biāo)物保留行為的影響

由于氨基葡萄糖與氨基寡糖素均帶有羥基及氨基，在以陰離子的形式分離以上目標(biāo)物時(shí)，受氨基基團(tuán)的影響，氨基葡萄糖與氨基寡糖素之間的分離度較差 (見圖1，加氨基捕獲柱前) 。由于普通樣品中游離氨基葡萄糖含量相對(duì)較低，因此，采用該方法測(cè)定會(huì)影響對(duì)游離氨基葡萄糖定量的準(zhǔn)確性。利用氨基寡糖素及游離氨基葡萄糖所攜帶的氨基數(shù)量不同的特點(diǎn)，在分析系統(tǒng)中增加一個(gè)氨基捕獲柱，可以增強(qiáng)攜帶氨基基團(tuán)較多的氨基寡糖素在氨基捕獲柱上的保留，而氨基葡萄糖只含有一個(gè)氨基，在捕獲柱上保留相對(duì)較弱，可快速地從保護(hù)柱上洗脫出，從而實(shí)現(xiàn)氨基葡萄糖與氨基寡糖素之間的分離 (見圖1，加氨基捕獲柱后) ，故采用此方法可消除氨基寡糖素對(duì)氨基葡萄糖的干擾，提高氨基葡萄糖定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 分析系統(tǒng)中增加氨基捕獲柱前(A)后(B)對(duì)比圖Fig. 1 The comparison diagram before(A) and after(B)adding an amino trap column in the analysis system

2.2 柱溫的優(yōu)化

柱溫對(duì)目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離也會(huì)產(chǎn)生影響。本方法比較了分別在25、30、35、40 和45 ℃柱溫條件下氨基葡萄糖與雜質(zhì)的分離效果，結(jié)果 (圖2)表明，氨基葡萄糖會(huì)受到雜質(zhì)1 及雜質(zhì)2 的干擾。隨著柱溫的升高，目標(biāo)物游離氨基葡萄糖的保留時(shí)間縮短。在柱溫25 ℃時(shí)樣品中雜質(zhì)1 與目標(biāo)物無法完全分離；柱溫為30 ℃時(shí)，雜質(zhì)1 的保留弱于目標(biāo)物；隨著柱溫升高，雜質(zhì)1 與氨基葡萄糖分離度變大，但樣品中雜質(zhì)2 會(huì)干擾目標(biāo)物。綜合考慮，最終選擇30 ℃作為分析時(shí)的柱溫。

圖2 不同柱溫下氨基葡萄糖與雜質(zhì)離子分離圖譜Fig. 2 Separation spectrum of glucosamine and impurity ions at different column temperatures

2.3 洗脫程序的優(yōu)化

本方法是采用前段先等度洗脫，待目標(biāo)物游離氨基葡萄糖被洗脫后，再加大淋洗液氫氧化鈉溶液的濃度，將氨基寡糖素沖出色譜柱。圖3 是對(duì)比前段不同濃度氫氧化鈉溶液對(duì)目標(biāo)物及雜質(zhì)分離的影響。可見：隨著氫氧化鈉濃度的增加，氨基葡萄糖與雜質(zhì)2 的分離度變大，但與雜質(zhì)1 的分離度變小。當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度為22 mmol/L時(shí)，雜質(zhì)1 基本上全被包裹到目標(biāo)峰內(nèi)。綜合考慮最佳分離度，確定前段等度洗脫的氫氧化鈉的濃度在15～20 mmol/L 之間，故本方法采用濃度為17 mmol/L 的氫氧化鈉溶液作為洗脫游離氨基葡萄糖的淋洗液。

圖3 不同淋洗液(氫氧化鈉溶液)濃度下氨基葡萄糖與雜質(zhì)分離圖譜Fig. 3 The separation of glucosamine and impurities with different eluent (sodium hydroxide solution) concentrations

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

在選定的色譜條件下依次分析系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各離子的色譜峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：氨基葡萄糖在0.02～10 mg/L 范圍內(nèi)，色譜峰面積與藥劑濃度間具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 4.2267x?0.0392，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。定量限(LOQ)為0.02 mg/L；以信噪比 (S/N) 為3計(jì)算得到檢出限(LOD)為0.01 mg/L。

2.5 方法應(yīng)用

在選定的色譜條件下，對(duì)市售氨基寡糖素農(nóng)藥母藥及水劑樣品進(jìn)行平行分析，結(jié)果見表2。母藥及水劑平行測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.9%，證明該方法在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)具有較高的穩(wěn)定性。

表2 氨基寡糖素母藥及水劑樣品分析結(jié)果Table 2 Analysis results of the amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution samples

依次向氨基寡糖素母藥及水劑樣品中加入低、中、高3 個(gè)水平的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。每個(gè)水平平行測(cè)定3 次。結(jié)果 (表3) 顯示，氨基葡萄糖的平均添加回收率在90%～99%之間，RSD 在0.75%～1.9%之間，證明該方法在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。

表3 氨基寡糖素母藥及水劑樣品添加回收結(jié)果Table 3 The spiked recoveries for amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution

3 結(jié)論

本研究建立了高效陰離子交換-積分脈沖檢測(cè)氨基寡糖素母藥及水劑中游離氨基葡萄糖的方法，在保護(hù)柱DionexCarboPac PA100 前加裝氨基捕獲柱，利用氨基葡萄糖與氨基寡糖素所帶氨基數(shù)量不同，導(dǎo)致在氨基捕獲柱上的保留行為差異，可以使氨基葡萄糖與氨基寡糖素完全分離，使氨基寡糖素母藥及水劑中的游離氨基葡萄糖檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，從而更加準(zhǔn)確地判斷氨基寡糖素的含量。該方法具有操作步驟簡(jiǎn)單、分離效果好、通用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，更適用于氨基寡糖素母藥及水劑中游離氨基葡萄糖的快速定性和定量檢測(cè)，也可為游離氨基葡萄糖在其他種類樣品中的定性和定量檢測(cè)提供參考。