苦蕎全基因組SSR位點挖掘及遺傳多樣性分析

左茜茜 ， 宋英杰 ， 馬心妍 ， 楊云卉 ， 王軼菲 ，郭澤光， 朱雄智， 劉越*

（1.中央民族大學(xué)民族地區(qū)生態(tài)環(huán)境國家民委重點實驗室，北京 100081；2.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

苦蕎（Fagopyrum tataricum L.Gaerth）又名韃靼蕎麥，屬雙子葉蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），是一種典型的藥食同源小宗作物[1-2]。我國苦蕎種植歷史悠久，種植面積和產(chǎn)量均位居世界前列，不僅是苦蕎的集中分布區(qū)，也是該物種的擴散源[3]?？嗍w因其生長快速、適應(yīng)性強、抗逆性優(yōu)異和活性成分豐富的優(yōu)點，成為我國云貴川高原、青藏高原、甘肅甘南、鄂湘武陵山區(qū)丘陵山地等地區(qū)的重要糧食作物之一[4-6]。研究證實，苦蕎含有大量對人體有益的物質(zhì)[7]，包括具有抗菌、保肝、抗癌等生物功能的蒽醌類[8-9]及對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有廣泛調(diào)節(jié)作用的黃酮類[10]和醌類等化合物。

分子標記是遺傳多樣性研究的主要方法。隨著苦蕎全基因組[11]及相關(guān)組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的公布，SSR（simple sequence repeat）標記[12]在苦蕎種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用非常廣泛。但相比于其他植物，苦蕎的分子標記技術(shù)起步較晚，所開發(fā)的SSR數(shù)量有限，無法滿足其資源鑒定、分子育種和功能基因發(fā)掘等方面的需要，且目前對苦蕎基因組染色體序列SSR位點挖掘有限[13]，主要是通過轉(zhuǎn)錄組序列獲得[14-18]。因此，本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫中苦蕎的8條染色體基因組序列對每條染色體特異性的SSR位點進行挖掘，并篩選SSR多態(tài)性高的引物對苦蕎樣品進行遺傳多樣性評價，以期為苦蕎種質(zhì)資源的鑒定分析以及苦蕎分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SSR引物開發(fā)序列來自苦蕎全基因組8條染色體（SAMN07780272）[11]。序列數(shù)據(jù)以.fasta文件形式從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/38383）獲取。第1到8號染色體長度分別為 68.03、61.24、57.71、56.66、53.88、52.29、51.55、49.98 Mb，GC含量在38%左右。

SSR多態(tài)性檢測和苦蕎遺傳多樣性分析材料共計42份，由本課題組于2019年8月野外調(diào)查時收集并保存，包括從四川涼山彝族自治州3個縣收集到的苦蕎地方品種32份，科研單位提供的苦蕎品種10份，其中中國西南野生生物種質(zhì)資源庫提供3份（四川攀枝花、西藏、河北野生苦蕎樣品各1份）、云南滇臺中心提供3份（山西、云南、重慶黑苦蕎各1份）、貴州師范大學(xué)提供4份（貴州黑苦蕎3份、湖南黑苦蕎1份），樣品編號詳見表1。

表1 42份樣品來源Table 1 Origin of 42 samples

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 2019年9月，42份材料恒溫種植于中央民族大學(xué)民族植物學(xué)實驗室培養(yǎng)箱（25℃，16 h光照，8 h黑暗）。每份材料在培養(yǎng)皿內(nèi)種植20粒，于苗期收集鮮嫩葉片3～5片，利用剪刀剪碎，采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，利用Nano Drop 2000檢測DNA質(zhì)量，置于-20℃保存。

1.2.2 SSR開發(fā) 利用Perl語言環(huán)境下的MISA軟件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索苦蕎8條染色體序列基因組的SSR位點，設(shè)置SSR檢索標準：檢索重復(fù)單元為2、3、4、5、6 bp，重復(fù)長度≥12 bp；二核苷酸最小重復(fù)次數(shù)≥6次（總長度不少于12個堿基），三至六核苷酸最小重復(fù)次數(shù)≥5次（總長度不少于15、20、25和30 bp）。利用Excel對二至六核苷酸重復(fù)基元SSR進行相關(guān)統(tǒng)計和比較分析。

1.2.3 SSR引物設(shè)計與篩選 采用Primer 3.0引物批量設(shè)計程序?qū)Χ亮塑账嶂貜?fù)類型以及復(fù)合的SSR位點兩端序列設(shè)計特異性引物，目的產(chǎn)物大小在100～300 bp之間，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。選取12份苦蕎樣品DNA混合建池用于篩選多態(tài)性引物。PCR反應(yīng)體系20μL：DNA模板2μL，Taq0.2μL，正反引物各0.3 μL（20 μmol·L-1），0.4 μL dNTPs，2 μL Buffer和14.8μL ddH2O。PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃（退火溫度在54℃上下波動）退火35 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 min。每對引物的擴增產(chǎn)物隨機抽取樣品，取3μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將甲酰胺與分子量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取15μL加入上樣板中，再加入1μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，使用3730 XL測序儀（ABI）進行毛細管電泳。利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與聚類分析 根據(jù)統(tǒng)計帶型數(shù)據(jù)分析各個位點等位基因頻率，利用PIC-CALC計算SSR位點的多態(tài)性信息含量PIC（polymorphism information content）。利用Popgene 3.2計算有效等位基因（Ne）、Nei’s指數(shù)（H）、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（I）和遺傳相似系數(shù)。利用軟件NTSYS-pc 2.10進行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎基因組SSR位點特征分析

2.1.1 SSR出現(xiàn)的頻率 苦蕎8條染色體序列總長度約為451.34 Mb，共檢出51 485個SSR，SSR位點平均發(fā)生率（檢出的SSR個數(shù)與染色體總長度的比值）為114.07 Mb-1；苦蕎基因組SSR種類較為豐富，二至六核苷酸重復(fù)類型均有，但各類型出現(xiàn)的頻率相差較大。檢出的苦蕎SSR種類主要集中在二和三核苷酸重復(fù)，占總數(shù)的95.96%，且二核苷酸重復(fù)遠大于三核苷酸重復(fù)，分別占78.20%和17.76%，四至六核苷酸重復(fù)所占比例較小，總計4.04%。各類型重復(fù)相對豐度（某類型重復(fù)SSR數(shù)量與染色體總長度比值）最大及最小者分別為二核苷酸（89.1 Mb-1）和六核苷酸（0.32 Mb-1）。逐條染色體分析可知，分布在每條染色體上SSR位點的數(shù)量和種類特征較為一致。1號染色體檢出SSR數(shù)量最多（7 659個），其次是2號染色體（7 033個），檢出數(shù)量較少的為7號（5 768個）和8號染色體（5 721個）；SSR位點平均發(fā)生率最小的為4號染色體（116.24 Mb-1），最大的為7號染色體（111.89 Mb-1）；二至四核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最多者均為1號染色體，五核苷酸、六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最多的為2號染色體；二核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最少的均為8號染色體，三核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最少者為7號染色體998個，四核苷酸重復(fù)基元數(shù)量最少者為5號染色體。除了四核苷酸重復(fù)，其余重復(fù)類型的SSR數(shù)量在每條染色體上的趨勢波動不大（圖1）。

圖1 8條染色體SSR各重復(fù)類型數(shù)量Fig.1 Number of SSR repeats on 8 chromosomes

2.1.2 SSR重復(fù)類型和比例 搜索到的苦蕎基因組SSR共包含361種重復(fù)類型：二核苷酸重復(fù)類型有6種，三至六核苷酸重復(fù)類型分別有30、75、129和121種，每種類型的分布并不平均。從出現(xiàn)頻率來看，二核苷酸重復(fù)類型中出現(xiàn)最多的為AT/TA，占SSR總數(shù)的69.60%，遠遠高于其他類型；其次，CT/GA的頻率較高為4.29%；AG/TC、AC/TG、CA/GT出現(xiàn)的頻率較低，所占比例較小。三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率排名前3的為AAT/TTA、AGA/TCT和 ATA/TAT，分別占了 2.49%、2.10%和2.04%；其次AAG/TTC、CTT/GAA、ATT/TAA分別占1.67%、1.52%、1.51%；其他類型出現(xiàn)頻率比較低。四核苷酸重復(fù)類型AAAT/TTTA（0.60%）和五核苷酸重復(fù)類型中AAAAT/TTTTA（0.06%）出現(xiàn)頻率較高，六核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率都極低（表2）。

表2 苦蕎基因組序列不同SSR的出現(xiàn)情況Table 2 Occurrence of different SSRs in tartary buckwheat genome sequence

逐條染色體分析可知，不同染色體上優(yōu)勢重復(fù)類型沒有顯著差異，數(shù)量上有一定變化。二核苷酸重復(fù)類型AT/TA在1號染色體數(shù)量最多（5 194個），在8號染色體數(shù)量最少（3 901個）；三核苷酸重復(fù)類型AAT/TTA數(shù)量最多及最少分別為3號染色體（183個）及4號、6號和8號染色體（同為144個）；四核苷酸重復(fù)類型AAAT/TTTA數(shù)量最多（60個）的為1號染色體，最少的為3號染色體（0個）；五核苷酸重復(fù)類型AAAAT/TTTTA數(shù)量最多（9個）的為2號染色體，數(shù)量最少（0個）的為4號染色體；六核苷酸重復(fù)類型分布較為均勻，在每條染色上的數(shù)量變動較小。

2.1.3 SSR特異種類分布 對每條染色體上的重復(fù)基元類型、特異基元類型（唯一性）進行統(tǒng)計。各條染色體的特異基元類型主要集中在四至六核苷酸重復(fù)上，在二、三核苷酸重復(fù)上無分布（表3）。4號染色體可作為探究四核苷酸重復(fù)特異類型的最佳序列，特異類型包括AGTG/TCAC、ATAC、ATCA、CCAG、GGAG、GTTG和TAGG 7種；2號染色體可作為探究五核苷酸重復(fù)特異類型的最佳序列，包括AGAAA、ACATA、CCCAC、GTCCG和TATCT等14種；1號和2號染色體均可作為探究六核苷酸重復(fù)特異類型的最佳序列，每條染色體都有17種特異類型，其中1號染色體包括AATCTC、AGTGTA、 CAATAG、 CTTTCT、 GAGACT 和GGTTCG等，2號染色體包括ACCGCC、AGCAGA、CCAATC、CTTAGT、GGACGT和TCTCCC等。

表3 苦蕎基因組SSR特異種類分布Table 3 Distribution of specific species of Tartary buckwheat genomic SSR

2.1.4 SSR重復(fù)次數(shù)和長度 隨著重復(fù)次數(shù)的增加，所有類型的SSR數(shù)量均呈現(xiàn)減少趨勢（圖2）。5～15次為較低重復(fù)次數(shù)，分布有36 634個SSR，占總數(shù)的71.15%，說明低重復(fù)次數(shù)是苦蕎基因組SSR的主要特點之一；大于15次為較高重復(fù)次數(shù)，分布有14 851個SSR，占總數(shù)的28.85%，其中14 388個為二核苷酸重復(fù)；最高重復(fù)次數(shù)是95次。

圖2 苦蕎基因組SSR重復(fù)次數(shù)分布Fig.2 Distribution of SSR motif repeat number in tartary buckwheat

苦蕎全基因組SSR基序長度分布情況見圖3。其SSR基序長度跨度較大，為12～228 bp；總的來說，基序長度在12～20 bp范圍內(nèi)的有29 827個，占57.93%；20～50 bp的SSR數(shù)量為11 715個，占22.75%，50～100 bp的SSR數(shù)量為9 033個，占17.54%，＞100 bp的SSR數(shù)量為910個，占1.78%。檢出的苦蕎SSR基序長度主要集中在12～100 bp范圍內(nèi)（98.42%）。SSR基序的長度在每條染色體上呈現(xiàn)的變化趨勢類似（數(shù)據(jù)未列出）。

圖3 苦蕎SSR基序長度分布范圍Fig.3 Distribution range of SSR motif length of tartary buckwheat

2.2 苦蕎基因組SSR引物的多態(tài)性檢測

2.2.1 不同SSR引物類型分析 按照SSR在基因組中分布的比例共合成了156對引物（表4），其中，二核苷酸重復(fù)SSR引物119個，占76.28%，基序長度范圍為12～128 bp，三核苷酸重復(fù)類型SSR引物26個，占16.67%，基序長度范圍為15～69 bp，還有3個復(fù)合SSR引物。

通過毛細管電泳和DNA瓊脂糖電泳對設(shè)計的156條特異性引物，從苦蕎樣品DNA分子材料中選取12份構(gòu)建混合池對引物進行篩選。經(jīng)檢測，有120對引物可擴增出目的條帶，有效比例為76.92%。保留擴增條帶比較清楚明亮的引物，去除非特異性擴增的條帶，共有17對引物具有較好的重復(fù)性和豐富的多態(tài)性（表4），多態(tài)性比率為10.90%。其中，二核苷酸重復(fù)SSR引物11個，占64.71%，基序長度范圍為14～66 bp；三核苷酸重復(fù)類型SSR引物4個，占23.53%，基序長度范圍為15、27、48和63 bp；還有2個復(fù)合SSR引物，基序長度為55和66 bp。

表4 不同SSR引物類型的統(tǒng)計Table 4 Statistics of different SSR primer types

2.2.2 引物多樣性分析 用篩選的17對引物評價分析42份樣品的遺傳多樣性，結(jié)果如表5所示。共產(chǎn)生114個等位基因，每個位點平均等位基因6.706個。引物P90等位基因數(shù)最高（14個），而引物P89最少，等位基因數(shù)為2個。所有擴增產(chǎn)物的片段在84 bp左右。每對引物的觀察等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）平均為6.706個（P90最高為14個，P89最低為2個）和2.718個（P91最高為5.188個，P89最低為1.214個）。各引物的Shannon多樣性指數(shù)在0.397至2.101之間，平均值為1.155。P1的PIC值最高（0.794），P89的PIC值最低（0.161），17對引物的平均PIC值為0.499。觀察雜合度（Ho）變化范圍為0.048至1.000之間，平均值為0.881。

表5 17對引物遺傳多樣性信息Table 5 Genetic diversity information of 17 pairs of primers

2.3 苦蕎遺傳多樣性分析

2.3.1 苦蕎樣品遺傳多樣性分析 根據(jù)42份樣品的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA進行聚類分析（圖4）。在遺傳相似系數(shù)為0.35時，可將42份樣品劃分為3類：第Ⅰ類只有1份樣品，為四川省攀枝花市的野生苦蕎（XNZY-1）；第Ⅱ類共4份樣品，包括2份野生苦蕎樣品（XNZY-2和XNZY-5，分別來自西藏和河北）、1份湖南樣品（GZSF-2）及1份山西樣品（DTZX-1)；在涼山彝族自治州收集的苦蕎地方品種（黑苦蕎、普通黃苦蕎）被聚為第Ⅲ類，共有37份樣品，分為2個亞類（Ⅲa和Ⅲb）。Ⅲa包括3份黃苦蕎樣品（EN-G-TU、CHU-GE、ENG-WA-ZI）、3份美姑縣黑苦蕎樣品、6份昭覺縣樣品和1份云南滇臺中心樣品（DTZX-2），共計13份樣品；Ⅲb包括5份美姑縣黑苦蕎樣品、5份昭覺縣黑苦蕎樣品、9份布托縣黑苦蕎樣品、3份貴州樣品（GZSF-1、GZSF-3和 GZSF-4）、1份 重慶樣 品（DTZX-5）和黃苦蕎（EN-G-JIE），共計24份樣品。

圖4 苦蕎資源遺傳相似性聚類Fig.4 Clustering of genetic similarity of tartary buckwheat resources

2.3.2 苦蕎樣品群體多樣性分析 根據(jù)苦蕎地方品種的來源可將42個樣品分為8個群體，主要包括3個涼山地區(qū)黑苦蕎群體（Z群體、M群體、B群體）、2個涼山地區(qū)黃苦蕎對照群體（E群體、C群體）和3個外地苦蕎群體（D群體、X群體、G群體）?？嗍w地方品種的群體遺傳多樣性如表6所示。觀察等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）的平均值分別為2.449個（Z群體昭覺縣最高為3.471個，C群體CHU-GE最低為1.063個）和1.956個（M群體美姑縣最高為2.406個，C群體CHU-GE最低為1.063個）。Shannon多樣性指數(shù)（I）的平均值為0.630，8個群體中，M群體美姑縣最高（0.899），C群體CHU-GE最低（0.043）。實際雜合度（Ho）、預(yù)期雜合度（He）和Nei指數(shù)分別為0.885、0.115和0.367。

表6 不同群體遺傳分析統(tǒng)計Table 6 Statistics of genetic analysis of different populations

基于8個群體黑苦蕎及苦蕎地方品種的遺傳距離（表7）進行UPGMA聚類分析（圖5）。在遺傳距離0.48處可將8個群體劃分為3類，其中第Ⅰ類和第Ⅱ類都包含一個類群，分別為西南種子庫野生苦蕎和刺苦蕎（CHU-GE）；黑苦蕎主要被聚為第Ⅲ類，該類包含了來自美姑、昭覺和布拖縣的黑苦蕎和黃苦蕎。

表7 8個群體遺傳距離Table 7 Genetic distance of 8 populations

圖5 基于遺傳相似性苦蕎群體的聚類Fig.5 Clustering of tartary buckwheat populations based on genetic similarity

3 討論

3.1 苦蕎基因組SSR位點特征分析

常用多態(tài)性作為判定分子標記可用性的參考指標之一，SSR重復(fù)基元的長度對于其多態(tài)性具有重要影響[19]。通常重復(fù)基元長度在12 bp以下時SSR的多態(tài)性較低，長度在12～20 bp之間時多態(tài)性中等，長度＞20 bp時具有高度多態(tài)性[20]。本研究從苦蕎8條染色體序列中獲得的SSR重復(fù)基元長度范圍是12～228 bp，其中12～20 bp范圍內(nèi)的SSR占57.93%，＞20 bp的SSR占42.07%。此外，一至三核苷酸重復(fù)屬于低級重復(fù)基元，且低級重復(fù)基元類型的SSR多態(tài)性普遍要比高級重復(fù)基元類型高[21]。本研究檢出的SSR重復(fù)基元類型以二、三核苷酸重復(fù)為主，占總數(shù)的95.96%。可以推斷本研究開發(fā)的SSR位點具有潛在的高多態(tài)性。共設(shè)計合成156對引物，其中120對能擴增出條帶，有效率約為77%，17對多態(tài)性較好的引物中不存在四堿基和五堿基重復(fù)基元，基序長度＞20 bp的約占72%，與上述結(jié)果一致。

根據(jù)基因組序列數(shù)據(jù)，共獲得51 485個SSR位點。SSR的分布頻率為114.07 Mb-1，即相鄰SSR位點的平均距離為8.76 kb。Hou等[22]預(yù)估苦蕎基因組SSR出現(xiàn)頻率為70.34 Mb-1；Fang等[23]挖掘苦蕎基因組SSR頻率為83.25 Mb-1；馬名川等[13]對苦蕎全基因組總長度為34.99 Mb的未組裝序列進行SSR檢測，平均每21.3 kb出現(xiàn)1個SSR位點。造成差異的原因為采用的基因組序列長度不同。此外，F(xiàn)ang等[23]同樣基于苦蕎8條染色體序列挖掘SSR，SSR分布頻率為83.25 Mb-1，檢索標準為一至六核苷酸重復(fù)次數(shù)最低為20、10、7、5、4、4，其結(jié)果差異可能與搜索標準有關(guān)[24]?？嗍w基因組SSR分布頻率低于同為雙子葉的擬南芥[25]、喜馬拉雅櫻花[26]、向日葵[27]，也低于單子葉植物益智[28]，可能源于不同物種的基因組差異。苦蕎基因組中SSR種類較為豐富，二至六核苷酸均有分布，但數(shù)量上有較大的差異，其主要類型為二核苷酸（78.20%）和三核苷酸（17.76%）重復(fù)，四至六核苷酸重復(fù)所占比例較小，總計4%左右，與光皮樹[29]、楊梅[30]、玉米[31]和蕎麥[32]的基因組序列開發(fā)SSR標記結(jié)果一致。同時以短重復(fù)基序為主要重復(fù)類型說明苦蕎處于相對較高的進化水平。但與基于轉(zhuǎn)錄組序列進行SSR開發(fā)的結(jié)果不同，轉(zhuǎn)錄組序列SSR開發(fā)結(jié)果以三核苷酸重復(fù)類型數(shù)量居多[14-15,17]。此差異可能與基因組與轉(zhuǎn)錄組序列的特異性等有關(guān)，如三核苷酸在表達序列標簽（expressed sequence tag,EST)里比較多，但其不會引起移碼突變而影響基因功能。從基元類型來看，在苦蕎基因組SSR中，二核苷酸基元以AT/TA為主，遠遠高于其他類型，堿基偏倚性明顯，占SSR總數(shù)的69.60%，這與苦蕎全基因組SSR[13]和普通蕎麥種子EST微衛(wèi)星標記[32]分析結(jié)果一致，也與枇杷[33]、絲瓜[34]基因組研究結(jié)果相同。三核苷酸重復(fù)基元種類較多，優(yōu)勢重復(fù)基元以AAT/TTA、AGA/TCT和ATA/TAT為主，與甘草[35]、燈盞花[36]、石榴[37]的全基因組SSR位點特征一致。但與苦蕎EST-SSR[17]、普通蕎麥EST-SSR[32]以AAG/TTC為主的研究結(jié)果有差異。不同物種重復(fù)基元優(yōu)勢類型的差異可能與物種基因組或序列的特異性等有關(guān)，也與其受到的選擇壓力不同有關(guān)。從重復(fù)次數(shù)來看，低重復(fù)次數(shù)是苦蕎基因組SSR的主要分布特點，5～15次重復(fù)的SSR數(shù)量約占總數(shù)的71%，且隨著重復(fù)次數(shù)的增加，每個重復(fù)類型SSR出現(xiàn)的頻率減少。

從染色體層面看，分布在每條染色體上SSR位點的數(shù)量和種類特征較為一致。1號染色體檢出SSR數(shù)量最多（7 659個，68.03 Mb），檢出數(shù)量較少的為8號染色體（5 721個，49.98 Mb），通過對比染色體長度及SSR檢出數(shù)量，發(fā)現(xiàn)SSR檢出數(shù)量在一定程度上與染色體長度呈正相關(guān)；二至六核苷酸重復(fù)基元在每條染色體上的相對豐度差異不大，4號染色體SSR相對豐度（116.24 Mb-1）最大，7號染色體最小（111.89 Mb-1）。Fang等[23]研究表明，在苦蕎基因組染色體中SSR在8號染色體上的相對豐度最高（81.19 Mb-1），其次是4號染色體（80.63 Mb-1）。1號染色體上的相對豐度最低（76.61 Mb-1），但1號染色體上的SSR標記數(shù)量最多（5 212個）。本研究結(jié)果與其有一定的一致性，但SSR的相對豐度在每條染色體上存在差異。僅四核苷酸重復(fù)基元在每條染色上的數(shù)量有較明顯波動趨勢，在對四核苷酸重復(fù)進行特異研究時可針對性地選擇染色體；各優(yōu)勢重復(fù)基元數(shù)量在染色體的分布與也與染色體長度存在一定正相關(guān)，1號和2號可作為優(yōu)勢重復(fù)基元篩選的最佳序列材料；對每條染色體上的特異重復(fù)類型數(shù)量進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，特性重復(fù)類型主要存在于高級重復(fù)基元（四至六核苷酸重復(fù)）。本文對苦蕎8條染色體序列上的特異性SSR進行分析，豐富了苦蕎基因組SSR位點的信息，為之后育種篩選奠定基礎(chǔ)。綜合來看，無論從SSR出現(xiàn)頻率、基元類型的豐度，還是重復(fù)次數(shù)及長度來說，1號、2號染色體可作為大量SSR開發(fā)的優(yōu)質(zhì)序列選擇；通過對不同染色體所檢出的SSR類型進行分析，發(fā)現(xiàn)不同染色體能檢出的SSR種類具有特異性，研究者可根據(jù)不同科研需求，選擇苦蕎的不同染色體獲得理想的SSR分子標記。

3.2 苦蕎遺傳多樣性分析

本研究利用Primer 3.0軟件設(shè)計了156對SSR引物，主要類型為二核苷酸重復(fù)。17對多態(tài)性較好平均等位基因為6.70個。比韓瑞霞[18]對不同地理來源的苦蕎核心種質(zhì)多樣性研究時獲得的平均3個等位基因數(shù)量高，也比Senthikumaran[38]對喜馬拉雅地區(qū)蕎麥多樣性研究的平均6.5個等位基因高，造成的原因可能源于苦蕎的來源地差異。PIC≥0.5時，該基因座位具有高度多態(tài)性；當0.25≤PIC＜0.5時，為中度多態(tài)性；PIC＜0.25時，為低度多態(tài)性[39]。17條多態(tài)性較好的引物擴增得到的PIC平均為0.499，具有較高的多態(tài)性。這一數(shù)據(jù)雖然較高帆等[40]獲得的苦蕎SSR標記的PIC平均值0.88低，但比杜偉等[14]獲得的苦蕎SSR標記的PIC平均值（0.4）高，為充分利用開發(fā)苦蕎資源和完善苦蕎遺傳背景分析提供了參考。所有供試材料Shannon多樣性指數(shù)為1.15，也表明在材料收集地苦蕎地方品種具有較高的多樣性。

利用17對引物對收集到的42份黑苦蕎及苦蕎樣品進行多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，個體間普遍親緣關(guān)系較近，且不止存在不同縣的樣品聚在一起的情況，同時其與云南、重慶、貴州的品種聚類也非?？拷?，能與山西、湖南、西藏、河北的樣品有明顯區(qū)分。與云貴川的苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性普遍高于其他區(qū)域苦蕎遺傳多樣性，且普遍親緣關(guān)系較近的結(jié)果一致[40-42]?；诓煌后w遺傳距離的聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同群體苦蕎種質(zhì)資源沒有明顯的地理來源地分化。8個群體的聚類能將栽培苦蕎與西南種質(zhì)資源庫提供的野生苦蕎種質(zhì)資源進行區(qū)分；美姑縣的黑苦蕎樣品多樣性最高，其次是昭覺縣，布拖縣的樣品主要聚為同一分支，多樣性顯著低于另外2個縣。結(jié)合課題組前期實地調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)[43]，美姑縣和昭覺縣種植的黑苦蕎多于布拖縣，而且在生活中，農(nóng)民維持著以傳統(tǒng)交換、購買等方式以獲取苦蕎種子，保持著頻繁的種子交換，使得涼山彝族自治區(qū)內(nèi)苦蕎種子得以流動遷移；另外，美姑縣提出了“四川美姑苦蕎栽培系統(tǒng)”，高度重視苦蕎栽培系統(tǒng)傳統(tǒng)知識的挖掘與保護有關(guān)，鼓勵當?shù)厝朔N植多種苦蕎傳統(tǒng)品種，一定程度上對苦蕎地方品種多樣性的維系具有良性作用。

本研究利用MISA軟件對苦蕎基因組8條染色體序列的二至六核苷酸重復(fù)的SSR位點進行挖掘并分析序列特征。挖掘的大量SSR特別是染色體特異性的SSR位點，對苦蕎種質(zhì)資源的鑒定分析以及苦蕎分子標記輔助育種有重要意義。同時根據(jù)不同類型SSR位點設(shè)計合成引物進行多態(tài)性檢測，獲得了17對多態(tài)性較高的引物。用這17對引物對課題組前期收集的苦蕎樣品進行遺傳多樣性分析，也顯示了SSR分子標記的可用性，以及黑苦蕎的遺傳多樣性水平，對苦蕎遺傳多樣性保護研究提供了新的途徑。