基于兩面針新棒狀花椒酰胺含量的動態(tài)累積研究

黃光偉 黃 靜 梁雪松 李月菲

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545006)

兩面針是廣西的優(yōu)勢道地藥材之一。兩面針具有解毒消腫、氣止痛、活血化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)等作用，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)處方、中成藥及日化產(chǎn)品中，它的提取物是兩面針中藥牙膏的主要功效物質(zhì)，藥用部位為蕓香科植物兩面針Zanthoaylum nitidum(Roxb．)DC．的干燥根[1]。兩面針?biāo)幉募捌湎嚓P(guān)產(chǎn)品已成為振興廣西經(jīng)濟的特色產(chǎn)業(yè)之一。

長期以來，國內(nèi)外學(xué)者對兩面針的本草考證、生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用等方面進行了較全面的研究[2]。研究表明，兩面針?biāo)幉闹械幕瘜W(xué)成分較復(fù)雜，其莖皮、根和根皮中含有生物堿類、木脂素類、黃酮類、甾醇類等多種化合物，其中生物堿是兩面針主要的化學(xué)成分之一。2005年，劉紹華博士進行了“兩面針鎮(zhèn)痛、抗炎和止血活性成分的研究和應(yīng)用”的研究，研究發(fā)現(xiàn)，在兩面針?biāo)幉闹?，除了生物堿類具有生物學(xué)活性外，其中的新棒狀花椒酰胺也具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎和止血生物學(xué)活性[3]。

對于兩面針不同生長期和不同部位的活性成分含量，已有文獻報道[4-6]，但絕大多數(shù)是以氯化兩面針堿作為評價指標(biāo)成分，且沒有足夠的時間跨度進行系統(tǒng)研究。本研究利用我公司擁有兩面針GAP種植研究基地種植的藥材在時間跨度上超過10年以上的便利條件，對不同年份、同年而不同月份的兩面針?biāo)幉?，采用高效液相色譜法檢測其用藥部位根部中新棒狀酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，考察該指標(biāo)成分在不同生長期內(nèi)的動態(tài)累積變化，探討兩面針?biāo)幉闹性撝笜?biāo)成分的變化規(guī)律，為合理采收及使用兩面針?biāo)幉奶峁┛煽恳罁?jù)。

1 材料

1.1 藥材

采自位于南寧市良慶區(qū)錦亮村兩面針GAP種植研究基地，由研究基地的技術(shù)人員進行鑒定并采集。

1.2 儀器和試劑

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(配有色譜工作站和DAD檢測器)，美國Agilent公司；AND HM-200電子天平，日本AND公司；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；As3120 超聲清洗儀，Automatic科學(xué)儀器公司；中藥切片機(青州三陽包裝設(shè)備有限公司)；250 mL索氏提取器；植物粉碎機(型號FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司)。乙腈，色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher公司；超純水，電阻率18 MΩ·cm。新棒狀花椒酰胺對照品，由柳州兩面針股份有限公司功效研究組人員制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱(4.6×250mm，5μm)，C18保護柱，檢測波長為275 nm，柱溫為40 ℃，流動相為乙腈∶水=60∶40，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL，采用外標(biāo)法定量。對照品的液相色譜圖見圖1。兩面針?biāo)幉闹行掳魻罨ń孵０返囊合嗌V圖見圖2。

圖1 對照品的液相色譜圖(1-新棒狀花椒酰胺)

圖2 供試品的液相色譜圖(1-新棒狀花椒酰胺)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取0.001g新棒狀花椒酰胺對照品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻，作為對照品溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

選取生長期為2、3、5、7、10、13年生的兩面針?biāo)幉?，選取已有5年生長期的兩面針?biāo)幉模扛魞蓚€月取同株根部的根須，分別用切片機切成片狀，再用粉碎機碎成3mm左右的細(xì)粉。精密稱取各試驗樣品細(xì)粉5.00g，置于索式提取器中，加90mL甲醇，加熱至微沸，冷凝回流提取至提取液無色后停止，提取液移出，用甲醇定容至100mL，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程

準(zhǔn)確量取對照品溶液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得對照品溶液。取各濃度對照品溶液20μL，按上述色譜條件進樣測定，每個濃度進樣3次，以平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的濃度(X)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，得回歸方程：

Y=9160399.52X+0.3038515

r=0.9999

結(jié)果表明，在0.50～8.00μg/mL范圍內(nèi)新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD為0．95%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h測定新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算結(jié)果RSD為1.23%。該結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一藥材共5份，每份約1.0g，精密稱定，分別制備供試品溶液并測定新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果RSD為1.53%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

稱取已知新棒狀花椒酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥材約1.0g，共6份，按2.3方法制備供試品溶液，分別精密加入適量對照品溶液并測定各供試品新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果平均回收率為99．07%，RSD為1．61%。

2.9 樣品測定

分別取上述不同生長期的兩面針?biāo)幉募s1.0g，精密稱定，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定各供試品溶液中新棒狀花椒酰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個樣品測定3次，取平均值，各測定結(jié)果見表1、表2。

表1 不同生長年份兩面針?biāo)幉男掳魻罨ń孵０返臏y定結(jié)果(n=3)

表2 5年生不同月份兩面針?biāo)幉男掳魻罨ń孵０返臏y定結(jié)果(n=3)

3 討論

藥材的生長受當(dāng)?shù)氐暮０?、水土、氣候等環(huán)境因素影響很大，不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量存在較大偏差。本實驗所用的兩面針?biāo)幉木勺晕挥谀蠈幜紤c區(qū)錦亮村的兩面針GAP種植研究基地，該基地的藥材生長環(huán)境相同，并種植有不同年份的藥材，可供研究需要選擇適宜的藥材，樣品具有代表性。檢測結(jié)果表明，3年生長年期的兩面針?biāo)幉男掳魻罨ń孵０焚|(zhì)量分?jǐn)?shù)已達到較高值，5生長年期的兩面針?biāo)幉男掳魻罨ń孵０焚|(zhì)量分?jǐn)?shù)達到峰值，之后呈現(xiàn)一個平穩(wěn)的狀態(tài)，生長期超過10年的兩面針?biāo)幉男掳魻罨ń孵０焚|(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢；對于同一年的藥材，在每年的前半年，兩面針新棒狀花椒酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈小幅下降趨勢，而下半年則呈上升趨勢，12月達到高峰。

兩面針?biāo)幉闹行掳魻罨ń孵０泛吐然瘍擅驷槈A都是主要生物活性物質(zhì)，兩者都是衡量和控制兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，不同生長期和不同季節(jié)的兩面針?biāo)幉?，其新棒狀花椒酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一個動態(tài)累積變化的過程，3年生長期的兩面針即可采收，有5年生長期的最佳；而對于同期的藥材，10～12月份新棒狀花椒酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最高，而這個季節(jié)也正是氣候比較干燥的時期，有利于藥材的晾曬和保存。