豬流行性腹瀉病毒N-E.coliOmpA融合基因構(gòu)建、表達及其免疫原性評價

沈?qū)W懷，汪潔茹，尹 磊，周學利，趙瑞宏，潘孝成，戴 銀，殷冬冬，張丹俊，胡曉苗，侯宏艷

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽省畜禽疫病研究中心，安徽 合肥 230031；2.畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）可感染不同日齡和品種的豬，引發(fā)以劇烈腹瀉、嘔吐和脫水為特征的腹瀉病，肥育豬和成年豬對該病毒有一定的抵抗力，常呈隱形感染，但仔豬尤其是哺乳期仔豬感染可引起大規(guī)模的死亡，嚴重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。PEDV是線性單股正鏈RNA病毒，分別編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（N、S、E和M蛋白）和2個非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF3和lab蛋白）[2]。PEDV N蛋白是一種磷酸化的核衣殼蛋白，在不同的PEDV毒株中N蛋白的基因序列高度保守，并且豬只在感染PEDV的早期，體內(nèi)就會產(chǎn)生高水平的N蛋白抗體[3]，因此可以作為PEDV的亞單位疫苗和診斷治療的靶蛋白。大腸桿菌外膜蛋白A（E.coli Omp A）是大腸桿菌菌體外膜的重要組成部分，包括4個由?折疊組成的外環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在不同血清型的大腸桿菌Omp A蛋白結(jié)構(gòu)保守，免疫原性好，因此也被作為大腸桿菌感染的亞單位疫苗的候選蛋白[4]。單一表達的純化蛋白由于分子量較小，結(jié)構(gòu)簡單，免疫原性往往較差。研究發(fā)現(xiàn)，多基因融合表達蛋白的免疫原性顯著高于單一蛋白[4-6]。本研究探索將PEDV N蛋白和E.coli Omp A蛋白基因進行融合表達，并對表達的復合蛋白進行免疫原性評價，以期為PEDV結(jié)構(gòu)蛋白研究和不同病原基因融合表達系統(tǒng)建立提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Nde I酶、Xba I酶、T4連接酶、DH5α感受態(tài)細胞、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、pCold I質(zhì)粒、DNA Marker、蛋白Marker、蛋白純化柱、ECL發(fā)光液、質(zhì)粒提取試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司。組蛋白抗體、羊抗兔和羊抗鼠HRP標記抗體為abcom產(chǎn)品；OmpA抗體和PEDV N抗體為安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存；PEDV重組N蛋白抗體ELISA檢測試劑盒由安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供；弗氏完全佐劑為碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品。本試驗實施期為2021年6—11月，試驗地點在安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.2 融合基因修飾和質(zhì)粒構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫選取PEDVN基因序列（JN601062.1）和大腸桿菌OmpA基因序列（CP041416.1），采用SignalP在線工具預測基因信號肽，去除序列的信號肽序列和終止密碼子，并在序列兩端添加酶切位點。將經(jīng)過修飾的OmpA的DNA序列和PEDV N的DNA序列通過柔性聯(lián)接序列（linker）進行聯(lián)接，構(gòu)成OmpA-linker-PEDV N的DNA序列，在聯(lián)接序列后引入一個酶切位點；OmpA-linker-PEDV N序列通過DNA序列全合成的方式構(gòu)建；并將構(gòu)建序列插入pCold I質(zhì)粒，構(gòu)建為pCold I-OmpA-linker-PEDV N質(zhì)粒。采用DNAStar軟件分析融合基因OmpA-linker-PEDV N編碼蛋白的抗原性與親水性；采用I-TASSER在線工具對融合蛋白OmpA-linker-PEDV N進行同源建模，預測編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.3 重組質(zhì)粒的原核表達

將pCold I-OmpA-linker-PEDV N質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞，通過在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和氯霉素篩選得到攜帶pCold I-OmpA-linker-PEDV N質(zhì)粒的陽性感受態(tài)細胞；加入終濃度為0.1 mM IPTG，并在15 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h以誘導融合蛋白表達。

1.4 SDS-PAGE檢測與Western blot鑒定

收集誘導表達后的菌液，超聲波破碎菌體，收集離心上清液和菌體沉淀保存?zhèn)溆?。分別取20 μL收集的樣品，加入5 μL上樣緩沖，煮沸10 min，進行SDS-PAGE電泳觀察融合蛋白表達。SDS-PAGE電泳凝膠通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上通過常規(guī)Western blot操作：膜封閉、一抗孵育（組蛋白標記抗體）、二抗孵育、顯色等過程鑒定融合蛋白的表達。

1.5 融合蛋白的純化

將融合蛋白樣品加入Ni-NTA親和層析柱，4 ℃過夜孵育。用低濃度的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，采用高濃度的咪唑緩沖液洗脫下目的蛋白。用透析袋透析去除高濃度的咪唑和鹽，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。

1.6 Western blot檢測融合蛋白體的免疫原性

分別采用OmpA蛋白多抗和PEDV N蛋白單抗對融合蛋白進行Western blot檢測。蛋白樣品經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，4 ℃過夜孵育PEDV N（1∶2 000稀釋）蛋白單抗和OmpA（1∶1 000稀釋）蛋白多抗，HRP標記山羊抗兔二抗（1∶5 000）和兔抗鼠二抗（1∶8 000）與PVDF膜在常溫孵育1～2h，顯色后拍照。

1.7 融合蛋白免疫原效果評價

將純化后的融合蛋白樣品和PEDV N蛋白經(jīng)濃度測定后，調(diào)整蛋白濃度均為1 mg/mL。將兩種蛋白溶液與弗氏完全佐劑按照1∶1的比例混合乳化，制備免疫抗原。采用ELISA方法從60日齡仔豬中挑選10頭PEDV血清抗體陰性仔豬進行試驗。將10頭仔豬分成兩組，每組5頭，預試期5 d，預試期過后分別頸部肌肉接種制備的融合蛋白和PEDV N蛋白的免疫抗原。免疫程序為：65日齡首免，1.5 mL；75日齡二免，2 mL；90日齡三免，2 mL。分別在85日齡和100日齡采血，ELISA測定血清PEDV N蛋白抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 融合基因修飾與質(zhì)粒構(gòu)建

SignalP軟件預測發(fā)現(xiàn)OmpA基因序列 5'端的63個核苷酸為信號肽；PEDV N基因無信號肽序列。將OmpA基因的5'端的信號肽序列去除，并加入“CAT” 3個核苷酸序列，和原有“ATG”序列合成5'端Nde I酶切位點（CATATG），經(jīng)過修飾的OmpA的DNA序列長度為981 bp。將PEDV N基因3'終止密碼子去除，插入一個Xba I酶切位點（TCTAGA），經(jīng)過修飾的PEDV N的DNA序列長度為1 329 bp。OmpA和PEDV N基因通過linker序列（3×GGTGGTGGTGGCAGC）進行連接，并在linker序列后插入Xho I酶切位點，通過基因全合成方式構(gòu)建了OmpA-linker-PEDV N融合基因；將融合基因插入pCold I表達質(zhì)粒，構(gòu)建了pCold I-OmpA-linker-PEDV N重組表達質(zhì)粒，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。重組表達質(zhì)粒大小為6 708 bp的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，采用Xho I和Hind III對雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示得到了完整的重組表達質(zhì)粒（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N結(jié)構(gòu)

圖2 重組質(zhì)粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N酶切鑒定

2.2 融合蛋白的表達與結(jié)構(gòu)分析

SDS-PAGE檢測融合基因的表達如圖3所示，與未誘導表達的細菌裂解上清液相比，在IPTG誘導條件下，細菌裂解上清液中出現(xiàn)了相對分子質(zhì)量約為88 ku的目的條帶，與重組融合蛋白大小相符。與細菌裂解上清液相比，細胞沉淀中的相應的蛋白含量較低，說明表達的復合蛋白為融合表達蛋白。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在BL21感受態(tài)細胞中成功表達出大小為88 ku的融合蛋白。融合基因OmpA-linker-PEDV N編碼蛋白的抗原性與親水性經(jīng)DNAStar軟件分析可見（圖4），融合基因編碼的蛋白包含787個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)、抗原性和親水性均未發(fā)生明顯變化，linker區(qū)域具有一定的親水性和抗原性。采用I-TASSER在線工具對融合蛋白OmpA-linker-PEDV N進行同源建模，預測了編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，融合蛋白可以折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)，說明融合基因的設計是合理的。

圖3 融合蛋白OmpA-linker-PEDV N表達鑒定

圖4 融合蛋白OmpA-linker-PEDV N的二級結(jié)構(gòu)、抗原性和親水性分析

2.3 融合蛋白的鑒定與純化

將未誘導表達以及誘導表達的裂解上清液和沉淀樣品采用組蛋白抗體進行Western blot鑒定，結(jié)果如圖5所示，誘導表達的裂解上清液和沉淀樣品在目標蛋白位置出現(xiàn)特異性發(fā)光條帶，而未誘導表達樣品則出現(xiàn)一些雜帶。通過Ni-NTA親和層析柱洗脫和透析得到純化較高的融合蛋白（圖6）。

圖5 Western blot鑒定融合蛋白OmpA-linker-PEDV N

圖6 融合蛋白OmpA-linker-PEDV N的純化

2.4 融合蛋白免疫原性檢測

采用Omp A蛋白多抗和PEDV N蛋白單克隆抗體檢測融合蛋白的免疫原性。結(jié)果如圖7所示，Western blot檢測顯示融合蛋白可以分別與Omp A蛋白抗體和PEDV N蛋白抗體產(chǎn)生特異性免疫反應，表明融合蛋白同時具有Omp A蛋白和PEDV N蛋白的免疫原性。

圖7 融合蛋白的OmpA和PEDV N免疫原性

2.5 融合蛋白免疫效果評價

將純化的融合蛋白與原核表達的PEDV N蛋白加入弗氏完全佐劑制備免疫抗原，免疫65日齡仔豬。ELISA檢測融合蛋白與PEDV N蛋白接種后的血清抗體水平，結(jié)果如圖8所示，接種前兩組血清PEDV N蛋白抗體水平均為陰性；在85日齡兩組血清PEDV N蛋白抗體水平均轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃?，其中融合蛋白接種組的血清抗體水平顯著高于單一PEDV N蛋白接種組（P＜0.05）；100日齡融合蛋白組的血清抗體水平顯著高于PEDV N蛋白接種組（P＜0.05），且兩組血清抗體水平均高于85日齡水平。結(jié)果表明，融合蛋白的免疫原性高于單一PEDV N蛋白。

圖8 ELISA檢測豬血清中PEDV N抗體水平

3 討論

PEDV感染是造成仔豬嚴重腹瀉甚至死亡的重要因素，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。PEDV N蛋白基因高度保守，并且在感染后會很快出現(xiàn)相應的血清抗體，是PEDV診斷的常用靶基因或靶蛋白[3]。國內(nèi)外均有報道以N蛋白為基礎研制的PEDV抗原或抗體檢測方法。最近的研究發(fā)現(xiàn)PEDV N蛋白具有促進PEDV在細胞內(nèi)增殖的作用[7]，研究人員進一步探索以N蛋白為基礎的亞單位疫苗[8]和以N蛋白為靶向蛋白的抗病毒藥物研發(fā)[9-10]。以上研究都證明了PEDV N蛋白在防控PEDV感染方面的應用價值。E.coli Omp A是與細菌黏附作用有關的重要蛋白，可通過Toll樣受體（Toll-like receptor）激活抗原提呈細胞并釋放免疫相關的活性因子以激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生非特異性和特異性免疫，同時能夠誘導淋巴細胞增殖，是一種天然的免疫佐劑[11]。

近幾年，多基因融合表達技術越來越受到科技人員的關注[12-13]，與單一表達的蛋白相比，多基因融合表達的復合蛋白具有兩個主要的優(yōu)勢：一是增加蛋白的免疫原性，提供更多的抗原表位，起到蛋白之間互為免疫佐劑的作用[5，14]；二是可以同時表達不同活性或用途的蛋白，使蛋白的生物學功能更加多元化[15-16]。金蕾等將甲型副傷寒沙門氏菌spa O和Omp A基因串聯(lián)后進行融合表達，得到spa O-Omp A融合蛋白對小鼠的攻毒保護率顯著高于單獨免疫spaO或Omp A蛋白[5]。針對牛源多殺性巴氏桿菌建立pm0979-Plp E的融合基因表達質(zhì)粒，其表達的融合蛋白發(fā)揮了協(xié)同增效作用，對不同血清型的多殺性巴氏桿菌提供了交叉保護作用，其保護率好于單獨蛋白免疫的效果[14]。馬德星等將雞堆形艾美球蟲子孢子表面抗原3-1E基因片段（Ea3-1E）與編碼雞白細胞介素15成熟蛋白基因片段（mChIL-15）進行串聯(lián)連接表達，在二次免疫后可提供明顯的抗球蟲免疫保護效果[17]。以上研究均表明，融合基因表達產(chǎn)物在蛋白功能研究、亞單位疫苗研制等方面具有獨特的優(yōu)勢。

本研究選取PEDV N蛋白和Omp A蛋白基因構(gòu)建融合基因，通過原核表達載體實現(xiàn)復合蛋白的融合表達。其中在兩個基因之間插入柔性連接，在保證兩個基因融合表達以及保持獨立構(gòu)像的重要因素[18]。甘氨酸（Gly，G）分子質(zhì)量小、柔性好，絲氨酸（Ser，S）親水性極強，因此這兩個氨基酸廣泛應用于融合蛋白的聯(lián)接結(jié)構(gòu)[19]。本研究采用3×GGGGS的柔性氨基酸序列作為連接結(jié)構(gòu)，從而保證了復合蛋白中PEDV N蛋白和Omp A蛋白保持了各自的空間構(gòu)像。融合蛋白的免疫原性檢測也表明，原核表達的融合蛋白具有PEDV N蛋白和Omp A蛋白的雙重免疫原性。目前，關于多基因融合表達研究多是采用將同一物種的多種抗原基因進行融合表達或者將抗原基因與免疫調(diào)節(jié)基因進行串聯(lián)表達的策略[5，14-17]。本研究探索將病毒抗原與細菌抗原進行基因融合表達，以此來增強表達蛋白的免疫原性。通過比較單一PEDV N蛋白和融合蛋白免疫后血清抗體水平，結(jié)果表明融合蛋白的免疫原性顯著高于單一蛋白。本研究得到的復合蛋白可以為PEDV N蛋白功能研究、特異性抗體制備以及PEDV亞單位疫苗的研制提供材料和研究基礎。