液質(zhì)聯(lián)用法篩查藥食同源中藥中多種真菌毒素

劉瑜*，于麗，姜玲玲，耿慶華，肖珊珊，姚佳

1.沈陽海關技術中心（沈陽 110016）；2.大連海關技術中心（沈陽 116000）；3.錦州海關技術中心（沈陽 121000）

肉豆蔻、金銀花、枸杞子等藥食同源性中藥材日常多用于保健、藥用。近年來藥食同源性中藥材在重視療效的同時，其安全性也受到廣泛關注。由于中藥材在種植、采收、加工、運輸和儲藏等過程中，都有可能污染產(chǎn)毒真菌而導致真菌毒素殘留，進而影響中藥及其產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性，嚴重威脅消費者的身體健康和生命安全。真菌毒素的毒性包括肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒和震顫毒等，某些真菌毒素具有強致癌性，嚴重威脅人類的身體健康，甚至生命安全。中藥材種類繁多，霉變情況各異，真菌毒素的污染和殘留水平及對藥材質(zhì)量的影響也差異較大[1-2]。

隨著對真菌毒素風險認識的不斷深入，許多國家都對真菌毒素的殘留量進行強制性規(guī)定。GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中規(guī)定多種真菌毒素的限量要求。真菌毒素污染引起的中藥材霉變是影響中藥材及其制品使用安全及質(zhì)量的主要問題之一。真菌毒素檢測方法的建立及污染的研究多在谷類、農(nóng)產(chǎn)品等食品領域[3-7]，在中藥材中研究較少，國家、行業(yè)標準也都是針對糧谷、飼料等基質(zhì)，僅2020年版中國藥典中對部分真菌毒素如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素、伏馬毒素等每種毒素采用單獨的檢測方法進行測定。試驗通過建立多種真菌毒素的篩查、檢測方法，從而使食同源性中藥材中真菌毒素得到有效控制。

真菌毒素的定量檢測方法主要是高效液相色譜法（HPLC）[8-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[12-16]等。這些傳統(tǒng)檢測方法普遍存在定性干擾大，定量靈敏度不足，且只能1次實現(xiàn)1種或1類真菌毒素的定性和定量分析，無法滿足實際樣品中多種痕量真菌毒素污染物同時檢測的需求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與高效液相色譜法相比，定性更加準確，但兩者都是針對目標化合物的檢測，需要同時與標準溶液進行對照，并且仍然會出現(xiàn)假陽性樣品的檢出，無法實現(xiàn)化合物的確證和未知峰的篩查。試驗利用三重四極桿-串聯(lián)線性離子肼質(zhì)譜的譜庫檢索功能，建立藥食同源性中藥材中13種真菌毒素的篩查、檢測方法，可實現(xiàn)一次進樣分析篩查、確證、定量同時完成，對于新方法開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸（優(yōu)級純，美國Dikma公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Merk公司）；無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠（美國迪馬公司）；HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL，上海安譜公司）。

標準品：伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、柄曲霉素、霉酚酸、黃綠青霉素、青霉震顫素A（均為100 μg/mL，天津阿爾塔）。

肉豆蔻、金銀花、枸杞子、山楂、菊花等中藥材（均購自藥房）。

1.2 儀器與設備

LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB Sciex QTrap 6500四極桿串聯(lián)離子阱質(zhì)譜儀（美國AB公司）；BSA220電子分析天平（感量0.01 g，德國賽多利斯公司）；SR-1強力振蕩器（日本Taitec公司）；EVA50樣品濃縮儀（普利泰科公司）；Z323K高速離心機（HERMLE公司）；XW-80A混勻器（上海滬西分析儀器有限公司）；Millipore純水機（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取2 g（精確到0.01 g）樣品，置于10 mL離心管中，加入10 mL冷凍后的乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液，振蕩提取10 min，加入3.0 g無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1，W/W），振蕩器上振蕩3 min，按8 000 r/min離心10 min，取上清液至預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺150 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠150 mg）中，渦旋混勻，振蕩5 min，按8 000 r/min離心5 min，精確取5 mL上清液氮吹濃縮至近干，加入乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液定容至1.0 mL，樣液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序：0 min，40% A；1 min，40% A；8 min，0% A；10 min，0% A；10.1 min，40% A；12 min，40% A。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源ESI+，電噴霧電壓（IS）5 500 V；霧化氣壓力（GS1）50 psi；氣簾氣壓力（CUR）25 psi；輔助加熱氣壓力（GS2）60 psi；離子源溫度（TEM）550 ℃；入口電壓（EP）10 V；碰撞室出口電壓（CXP）15 V；檢測模式MRM-IDA-EPI。所測定的13種真菌毒素的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表1，13種真菌毒素的總離子流圖見圖1。

表1 13種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 13種真菌毒素的色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

比較乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-甲醇-水溶液3種溶劑的提取效率，結(jié)果表明絕大多數(shù)化合物在乙腈中比在甲醇中提取回收率高，只有T-2毒素在甲醇中響應值高，因此選擇乙腈-甲醇-水溶液作為提取溶劑，在提取溶劑中加入1%甲酸，增加大多數(shù)化合物的提取效率，故最終選定的提取溶劑為乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）。不同提取溶劑各化合物回收率見表2。

2.1.2 凈化方式的選擇

比較QuEChERS、HLB固相萃取柱、不凈化直接提取法3種不同方式凈化效果，通過對13種真菌毒素回收率的測定來確定樣品凈化的最佳條件。結(jié)果表明，凈化后檢測本底低，黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、青霉震顫素A回收率均有顯著提高，QuEChERS和HLB固相萃取柱相比，HLB固相萃取柱凈化后檢測本底更低，但經(jīng)QuEChERS凈化后各化合物回收率均高于經(jīng)HLB固相萃取柱凈化。因此最終選擇QuEChERS的凈化方式。不同凈化方式各化合物回收率見表2。

表2 各化合物不同前處理方法回收率 單位：%

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別采用乙腈-水、甲醇-水的流動相體系，考察各化合物的色譜行為，發(fā)現(xiàn)乙腈-水作流動相各化合物響應值都大于甲醇-水作流動相，因此選擇乙腈-水作為流動相，在流動相中加入0.1%甲酸，可以增加各化合物的離子化效率，提高檢測靈敏度，故確定流動相體系組成為乙腈-0.1%甲酸水溶液。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將0.5 μg/mL的標準溶液通過針泵進樣方式，找到各化合物的母離子、子離子，優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù)，建立MRM方法；切換到EPI模式，在不同碰撞能量下，采集各化合物的二極全掃描質(zhì)譜圖；添加IDA，建立MRM-IDA-EPI方法。

2.3 方法的線性范圍及檢出限

采用基質(zhì)匹配標準曲線的定量方法，以消除基質(zhì)效應的影響。用空白基質(zhì)溶液配制濃度分別為0.05，0.2，0.5，2.0，5.0和20 ng/mL的13種真菌毒素混合標準溶液，以峰面積比為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，13種真菌毒素在0.05～20 ng/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關系，相關系數(shù)（r）均大于0.993，見表3。依據(jù)信噪比S/N=3計算方法的檢出限，13種真菌毒素的檢出限為0.1～10 μg/kg，見表3。

2.4 回收率及精密度試驗

向金銀花空白樣品中分別添加13種真菌毒素的混合標準溶液，制成模擬加標樣品，添加濃度水平分別為1.0，2.0和10 μg/kg。每個濃度水平平行測定6次，按照上述方法測定，計算各物質(zhì)的平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果表明，金銀花樣品中13種真菌毒素平均回收率為66.3%～91.8%，相對標準偏差為2.8%～7.7%，見表3。

表3 方法學驗證數(shù)據(jù)

2.5 實際樣品檢測

應用上述試驗方法，對市售的肉豆蔻、金銀花、枸杞子、山楂、菊花等20余批次樣品進行檢測，其中在1批肉豆蔻中檢測黃曲霉毒素B1。

3 結(jié)論

采用乙腈-甲醇-甲酸-水（60∶20∶1∶19，V/V）溶液提取，QuEChERS凈化，LC-MS/MS檢測方法建立藥食同源性中藥材中13種真菌毒素的定性、定量分析方法。在四極桿質(zhì)譜MRM基礎上，結(jié)合離子阱質(zhì)譜特有的EPI掃描模式，得到化合物的二極全掃描質(zhì)譜圖，對于色譜圖中的未知可疑峰可直接關聯(lián)到質(zhì)譜譜庫檢索、比對功能，通過比對二極質(zhì)譜圖，實現(xiàn)對色譜圖中未知峰的篩查及可疑峰的確證。該方法應用于實驗室日常檢測，可極大提高檢測結(jié)果的準確性和檢測效率，對于發(fā)現(xiàn)樣品中未知組分提供新思路。