甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷大鼠的保護(hù)作用

王 靜，李鳳娟，張化朋，劉敬蘭，吳力克

（1.山東鳳凰生物科技股份有限公司，山東泰安 271000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染病?？漆t(yī)院，重慶 400038）

中醫(yī)學(xué)自古以來就有“藥食同源”理論，如許多中藥即是食物也是藥物，食物和藥物一樣均可防治疾病。中藥里面許多中藥都屬于藥食同源類中藥。衛(wèi)生部于2002年發(fā)布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào)），通知明確規(guī)定了藥食同源中藥的名稱，甘草和葛根均在此類中藥中。保健食品中，許多以甘草、葛根為原料，傳統(tǒng)食品中，也多用甘草、葛根煲湯、燉煮，用于保健。其中，甘草活性成分甘草酸苷、異甘草酸、甘草酸二銨在保肝護(hù)肝中已廣泛應(yīng)用于臨床[1-2]，在日常飲食中應(yīng)用廣泛：甘草及其提取物常被添加于零食、飲料、啤酒等食品中。葛根為藥食同源兩種中藥，其化學(xué)成分主要有黃酮、三萜、香豆素、皂苷等類化合物[3]，其中葛根素對(duì)化學(xué)性肝損傷、酒精/非酒精性肝損傷等多種肝損傷具有不同程度的治療作用[4-6]。葛根含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，屬于藥食同源中藥，也是常見的養(yǎng)生補(bǔ)品，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，在我國(guó)食用、藥用領(lǐng)域已有3000多年的應(yīng)用歷史。常見的葛根產(chǎn)品有葛根粉粥、葛根羹、葛根湯等。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，肝臟和腸道經(jīng)膽管、門靜脈和體循環(huán)進(jìn)行雙向交流。肝臟代謝產(chǎn)物影響著腸道菌群的組成與腸屏障的完整，腸道菌群的代謝產(chǎn)物經(jīng)門靜脈系統(tǒng)影響著肝臟功能及糖脂代謝等，肝臟與腸道之間相互聯(lián)系與影響，組成了“腸-肝”軸（Gut-Liver Axis）[7-8]。肝臟產(chǎn)物影響腸道菌群組成和屏障完整性，腸道因子調(diào)控肝臟的膽汁酸合成和糖脂代謝；肝臟和腸道中的促炎性變化介導(dǎo)肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)展，這些疾病有共同的發(fā)展途徑[9-10]；益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，有效地減輕各因素對(duì)肝臟的損傷，改善肝臟功能[11-12]。

發(fā)酵炮制法是中藥炮制的傳統(tǒng)方法之一，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史。中藥發(fā)酵炮制過程是應(yīng)用微生物代謝酶系等作用的生物轉(zhuǎn)化過程，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、副產(chǎn)物少、毒副作用小等特點(diǎn)[13-14]。對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵炮制法而言，發(fā)酵微生物菌種不明確，發(fā)酵過程以自然發(fā)酵為主，發(fā)酵終點(diǎn)以經(jīng)驗(yàn)為主。應(yīng)用菌種明確的一種或多種微生物，采用現(xiàn)代微生物工程技術(shù)，提升發(fā)酵類中藥產(chǎn)品的品質(zhì)與功效，是發(fā)酵炮制中藥技術(shù)發(fā)展創(chuàng)新的重要研究?jī)?nèi)容，也是中藥現(xiàn)代化的重要發(fā)展方向之一[15]。本研究基于腸-肝軸的最新研究進(jìn)展，以益生菌發(fā)酵這一新型炮制方式，對(duì)甘草、葛根進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵處理，以促進(jìn)中藥活性成分的釋放。發(fā)酵獲得的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物不僅含有較高的活性成分，同時(shí)含有后生元成分，通過中藥、益生菌“協(xié)同增效”的模式，提升了中藥性能，并建立了基于發(fā)酵物指紋圖譜與標(biāo)志性活性成分相結(jié)合的質(zhì)量控制體系。本文以益生菌發(fā)酵中藥技術(shù)制備的甘草葛根發(fā)酵物GCQ作為供試物，分析其對(duì)四氯化碳致慢性肝損傷大鼠的肝保護(hù)、降低內(nèi)毒素、降低炎癥、調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，初步闡明益生菌甘草葛根發(fā)酵物GCQ對(duì)慢性肝損傷大鼠的肝保護(hù)及與腸道菌群的相關(guān)影響及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草葛根發(fā)酵組合物（GCQ） 實(shí)驗(yàn)室自制；SPF級(jí)SD雌性和雄性大鼠（180±20）g（合格證：NO.1107 261911004282） 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；甘利欣甘草酸二銨膠囊（GLX） 正大天晴；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、總蛋白（TP）、內(nèi)毒素（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、脯氨酸肽酶（PLD）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β1）、透明質(zhì)酸（HA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒上海酶聯(lián)生物科技有限公司；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、EC腸球菌培養(yǎng)基、TPY瓊脂培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、EG瓊脂培養(yǎng)基、TSC瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽 Solarbio；綿羊血 青島海博生物；CCl4分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

F50酶標(biāo)儀 Infinite公司；CX21FS1電子生物顯微鏡 Olympus公司；JEM-1230透射電子顯微鏡

日本電子株式會(huì)社；ML204電子分析天平 Mettler Toledo公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司，CL5高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；THZC型恒溫振蕩器 蘇州培英實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；BCD-256WDGH型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草葛根發(fā)酵組合物的制備 甘草發(fā)酵物的制備：應(yīng)用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)，以甘草為發(fā)酵原料，經(jīng)真菌（茯苓5.28）發(fā)酵酶解，獲得甘草酶解產(chǎn)物；以甘草酶解產(chǎn)物為發(fā)酵原料，經(jīng)乳酸桿菌（植物乳桿菌）二次發(fā)酵處理，添加適當(dāng)比例的麥芽糊精凍干處理，獲得甘草發(fā)酵物（甘草酸：4.18%，甘草次酸：1.39 g/kg）。

葛根發(fā)酵物的制備：以葛根為發(fā)酵原料，經(jīng)乳酸桿菌（副干酪乳桿菌）發(fā)酵處理，添加適當(dāng)比例的麥芽糊精凍干處理，獲得葛根發(fā)酵物（葛根素：1.15%。）

甘草葛根發(fā)酵組合物：6.2 g發(fā)酵組合物：甘草發(fā)酵物3.59 g，葛根發(fā)酵物2.61 g成分含量：甘草酸150 mg、葛根素30 mg、甘草次酸5 mg。

1.2.2 分組及給藥 48只SD大鼠，雌雄分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室保持溫度23±2 ℃、濕度50%±15%、晝夜12 h交替條件，預(yù)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為生理鹽水處理對(duì)照組（NS組）、甘草酸二銨陽(yáng)性對(duì)照組（GLX組）、甘草葛根發(fā)酵組合物處理組（GCQ組）。其中，GLX陽(yáng)性對(duì)照組參照甘利欣（GLX）甘草酸二銨膠囊用量，甘草酸二銨灌胃劑量為15 mg/kg·d；GCQ樣品組甘草葛根發(fā)酵物灌胃劑量為650 mg/kg·d；以生理鹽水配制成適宜濃度給藥，每天2次，生理鹽水處理對(duì)照組灌胃同等劑量生理鹽水。NS組、GLX陽(yáng)性對(duì)照組、GCQ樣品組采用2% CCl4溶液（以市售橄欖油為溶劑稀釋）灌胃造模，造模劑量為0.2 mL/kg/次，每周兩次（造模期間間隔4 h繼續(xù)給藥灌胃）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)期間觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生活狀態(tài)變化，包括運(yùn)動(dòng)、神志、進(jìn)食、皮毛、小便、大便、體重等病態(tài)觀察，記錄慢性肝損傷造模開始后12周內(nèi)動(dòng)物的死亡和因病淘汰情況。

1.2.4 血清中ALT、AST、TBIL、TP、LPS、TNF-α、PLD、TGF-β1、HA、IL-6含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模給藥12周后，末次CCl4造模48 h后，禁食不禁水16 h，采用眼球靜脈取血，血漿置于37 ℃溫浴30 min，轉(zhuǎn)速3500 r/min離心10 min，移液槍取上層血清分裝于EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行肝功能指標(biāo)（ALT、AST、TBIL、TP）、內(nèi)毒素定量（LPS）、肝纖指標(biāo)（PLD、TGF-β1、HA）、炎癥因子（IL-6、TNF-α）相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.5 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 肉眼觀察肝臟形態(tài)及顏色改變（畸形、腫大、攣縮、缺血等）。取大鼠肝臟左葉用10%福爾馬林固定，從肝左葉中部做橫切面取材，常規(guī)病理制片（H.E.染色）[16]；光鏡下觀察肝組織細(xì)胞病理改變。取出肝臟，切成1 mm3的組織塊，進(jìn)行鋨酸染色[17]，制片后采用透射電鏡觀察細(xì)胞組織變化。

1.2.6 腸道菌群定量分析 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剖殺后，無(wú)菌條件下取盲腸糞便，精確稱取1 g置于100 mL帶玻璃珠無(wú)菌生理鹽水三角瓶中，密封，置于恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速160 r/min，混勻30 min，進(jìn)行不同梯度稀釋，采用平板計(jì)數(shù)法，選用適宜不同類型細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基:伊紅美藍(lán)瓊脂、EC腸球菌、TPY瓊脂、MRS瓊脂、EG瓊脂、TSC瓊脂培養(yǎng)基，分別進(jìn)行選擇性培養(yǎng)基配制及高壓滅菌，選擇合適的稀釋度分別接種在各培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后以菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定計(jì)數(shù)菌落，分別計(jì)算出每克濕便中大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、類桿菌和梭桿菌的活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即差異顯著，P＜0.01即極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷模型大鼠的機(jī)體狀態(tài)的影響

處理及觀察12周，生理鹽水組和GCQ組未見受試動(dòng)物死亡；GLX組在CCl4處理過程中發(fā)生重度感染，淘汰1只，期間未發(fā)生因病淘汰。與未給予GLX和GCQ進(jìn)行保護(hù)性治療的慢性肝損傷模型動(dòng)物相比，連續(xù)給藥6周后，給藥與未給藥模型動(dòng)物的生活狀態(tài)開始發(fā)生差異，主要表現(xiàn)為給藥動(dòng)物活力更強(qiáng)，精神、食欲和皮毛亮度、密度更好，體重增加明顯（見圖1），尿色淺，大便成形；12周時(shí)給藥與未給藥模型動(dòng)物上述差異更為明顯。

圖 1 不同處理組經(jīng)CCl4造模后的體重變化情況Fig.1 Changes in body weight of different treatment groups after CCl4 modeling

2.2 GCQ對(duì)慢性肝損傷模型大鼠血清中ALT、AST、TBIL、TP的影響

四氯化碳（CCl4）受到肝微粒體酶活化成為三氯甲烷自由基（CCl3·）與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致蛋白合成障礙、脂質(zhì)分解代謝紊亂，引起肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）蓄積，CCl3·也能迅速與O2結(jié)合轉(zhuǎn)化為過氧化三甲烷自由基（CCl3O2·）導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，從而引起細(xì)胞膜的變性損傷，產(chǎn)生酶滲漏及各種類型的細(xì)胞病變、炎癥反應(yīng)，甚至壞死[9]。由圖2可知，GLX和GCQ保護(hù)組慢性肝損傷模型動(dòng)物，肝損傷指標(biāo)ALT、AST造模后較造模前增高極顯著（P＜0.01），表明GLX和GCQ的肝臟保護(hù)作用不夠完全；但與生理鹽水處理組造模后相比，ALT和AST水平呈極顯著降低（P＜0.01）；生理鹽水處理組造模后TP水平呈極顯著降低（P＜0.01），GLX和GCQ保護(hù)組造模前后無(wú)明顯差異；生理鹽水處理組造模后TBIL水平呈極顯著增高（P＜0.01），GCQ保護(hù)組造模前后無(wú)明顯差異；表明GLX和GCQ有明顯保護(hù)作用。

研究顯示，NS組造模后ALT、AST水平顯著增高，說明肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞通透性增加，產(chǎn)生酶滲漏；TBIL水平顯著升高，說明肝細(xì)胞代謝功能水平降低。GCQ可以顯著降低四氯化碳（CCl4）致慢性肝損傷大鼠的ALT、AST和TBIL水平，說明GCQ可以對(duì)肝細(xì)胞膜產(chǎn)生保護(hù)作用，增強(qiáng)肝細(xì)胞的代謝功能，降低四氯化碳（CCl4）對(duì)肝臟的損傷程度，抑制肝損傷產(chǎn)生的代謝紊亂問題。

2.3 甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷模型大鼠肝纖維化指標(biāo)PLD、TGF-β1、HA的影響

任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程，是肝臟的一個(gè)病理生理過程，如果損傷因素長(zhǎng)期不能去除，纖維化的過程長(zhǎng)期持續(xù)就會(huì)發(fā)展成肝硬化。肝纖維化指標(biāo)PLD、TGF-β1、HA檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，GLX和GCQ保護(hù)組造模后PLD、TGF-β1、HA水平高于造模前，但GCQ保護(hù)組指標(biāo)HA顯著低于生理鹽水處理對(duì)照組造模后水平（P＜0.05），GLX保護(hù)組則與對(duì)照組無(wú)顯著差異；與生理鹽水處理對(duì)照組造模后水平比較，GCQ保護(hù)組PLD和TGF-β1水平極顯著降低（P＜0.01）；提示GCQ具有抗慢性肝損傷過程中發(fā)生的肝纖維化作用。

圖 2 CCl4造模前后不同處理組肝功能指標(biāo)Fig.2 Liver function indexes of different treatment groups before and after CCl4 modeling

圖 3 CCl4造模前后不同處理組肝纖維化指標(biāo)Fig.3 Liver fibrosis indexes of different treatment groups before and after CCl4 modeling

圖 4 CCl4造模前后不同處理組內(nèi)毒素、細(xì)胞因子指標(biāo)Fig.4 Liver endotoxin and cytokine indexes of different treatment groups before and after CCl4 modeling

血清中TGF-β1、PLD、HA是反映肝損害嚴(yán)重程度、診斷肝纖維化的重要指標(biāo)。研究顯示，慢性肝病患者PLD升高，可能與肝細(xì)胞內(nèi)PLD活性增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)膠原降解加速、脯氨酸含量升高，使細(xì)胞間膠原合成增加有關(guān)。透明質(zhì)酸是由肝內(nèi)皮細(xì)胞攝取分解，肝功能受損時(shí)，血清中HA升高，血清HA水平是判斷有無(wú)活動(dòng)性肝纖維化的定量指標(biāo)[18]。TGFβ1與肝膠原、纖維連結(jié)蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成明顯相關(guān)，是近年來發(fā)現(xiàn)的反映肝纖維化的重要指標(biāo)之一，是重要的促纖維化介質(zhì)，已成為纖維化疾病的中藥醫(yī)治靶標(biāo)，通過抑制TGF-β1的產(chǎn)生，阻斷其與受體結(jié)合和調(diào)控其信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)程，可以達(dá)到抗纖維化的目的[19]。GCQ可通過保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞代謝功能等作用方式，進(jìn)一步達(dá)到抑制TGF-β1的產(chǎn)生、促進(jìn)透明質(zhì)酸的分解、抑制細(xì)胞間膠原合成，抑制慢性肝損傷的纖維化作用。

2.4 甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷模型大鼠血清中IL-6、TNF-α、LPS的影響

IL-6和TNF-α是參與多種生理與免疫過程的重要細(xì)胞因子，與細(xì)菌感染性疾病的發(fā)病有關(guān)，是參與全身炎癥反應(yīng)綜合征的重要炎癥介質(zhì)，它們水平的高低反映了感染的嚴(yán)重程度。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種脂多糖，脂多糖進(jìn)入血液引起內(nèi)毒素血癥，腸道菌群會(huì)隨著肝損傷的發(fā)展而發(fā)生變化，進(jìn)而引起內(nèi)毒素產(chǎn)生菌的增加[20]。由圖4結(jié)果顯示，GLX和GCQ保護(hù)組造模前后血清IL-6水平變化不大，但生理鹽水處理對(duì)照組造模前后血清IL-6水平差異顯著（P＜0.05）；GLX和GCQ保護(hù)組造模前后血清TNF-α水平差異極顯著（P＜0.01），在阻止TNF-α升高方面，GCQ效果較GLX明顯，與生理鹽水處理對(duì)照組比較具有極顯著性差異（P＜0.01）；GCQ保護(hù)組造模前后LPS水平無(wú)顯著性差異，與生理鹽水處理對(duì)照組造模后比較具有極顯著性差異（P＜0.01）；說明GCQ在降低CCl4慢性肝損傷大鼠內(nèi)毒素、炎癥方面具有一定的保護(hù)作用。

IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，IL-6已成為某些細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征（CSS）的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。GCQ可有效降低機(jī)體內(nèi)的炎性因子，降低因炎性因子風(fēng)暴導(dǎo)致的肝損傷程度。

腸屏障功能障礙會(huì)導(dǎo)致危險(xiǎn)的腸道菌群及其產(chǎn)物進(jìn)入腸系膜靜脈進(jìn)而經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，從而導(dǎo)致或加劇肝損傷。發(fā)酵組合物GCQ在生物發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，在腸道中發(fā)揮抑制致病菌、清除腸道毒素、促進(jìn)有益菌增殖等多種益生功效，進(jìn)一步達(dá)到平衡腸道菌群、降低炎癥及增強(qiáng)腸道免疫功能的作用，促進(jìn)腸道構(gòu)建穩(wěn)定的腸道屏障，降低內(nèi)毒素水平及慢性炎癥的發(fā)生[21]。

2.5 甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷模型大鼠肝組織病理性改變的影響

肉眼觀察與生理鹽水處理未保護(hù)的慢性肝損傷大鼠比較，GLX和GCQ保護(hù)肝臟的大小、色澤、質(zhì)地均有差異，但兩者間比較差異不大（見圖5）。

圖 5 不同組大鼠慢性肝損傷肝臟病理圖Fig.5 Liver pathology of chronic liver injury in different groups of rats

光鏡觀察與生理鹽水處理未保護(hù)的慢性肝損傷大鼠比較，GLX和GCQ保護(hù)肝組織肝細(xì)胞氣球樣變數(shù)量相對(duì)較少，發(fā)生腫脹性炎癥和局部壞死改變的程度偏輕，但GLX和GCQ對(duì)慢性肝損傷的保護(hù)作用無(wú)顯著差異（見圖6）。

圖 6 不同組慢性肝損傷大鼠光鏡觀察肝臟病理圖（100×）Fig.6 Light microscope observation of liver pathology in different groups of rats with chronic liver injury (100×)

電鏡觀察與生理鹽水處理未保護(hù)的慢性肝損傷大鼠比較，GLX和GCQ保護(hù)肝細(xì)胞及其細(xì)胞發(fā)生炎癥、線粒體變性或破壞的程度偏輕，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原原纖維較少，但GLX和GCQ對(duì)慢性肝損傷的保護(hù)作用無(wú)顯著差異（見圖7）。

圖 7 不同組慢性肝損傷大鼠電鏡觀察肝臟病理圖（10000×）Fig.7 Electron microscopic observation of liver pathology in different groups of rats with chronic liver injury (10000×)

2.6 甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷模型大鼠腸道菌群的影響

腸道菌群的變化在與慢性肝病、脂肪肝及肝硬化的發(fā)病及病情進(jìn)展中有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)糞便、結(jié)腸黏膜的菌群相對(duì)豐度及功能的改變對(duì)慢性肝炎及肝硬化的發(fā)病及預(yù)后有不同程度的影響[22]。圖8結(jié)果表明，經(jīng)CCL4造模處理后，與未處理前相比雙歧桿菌合乳桿菌數(shù)量減少；經(jīng)GLX和GCQ保護(hù)慢性肝損傷模型動(dòng)物，EMB、EC、KV、CD數(shù)量降低，而TPY、MRS增高，尤以GCQ組明顯，說明CCl4肝損傷可以引起腸道菌群的變化，GLX和GCQ在起到保肝護(hù)肝作用的同時(shí)，起到一定的調(diào)節(jié)腸道菌群作用。

圖 8 不同處理組慢性肝損傷大鼠腸道菌群示意圖Fig.8 Schematic diagram of intestinal flora of rats with chronic liver injury in different treatment groups

中草藥成分影響菌群的豐度和多樣性，菌群組成改變與宿主免疫和代謝活動(dòng)密切相關(guān)。中草藥含有許多具有益生元活性的成分，這些成分可增加雙歧桿菌、乳桿菌屬、擬桿菌門、普氏菌屬的豐富度，抑制厚壁菌門，降低腸道中厚壁菌門/擬桿菌門的比例；中草藥活性成分作為一種特殊益生元，通過促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌增殖和抑制致病菌的雙向作用方式，達(dá)到平衡腸道菌群的目的[23]。中草藥成分可以被腸道菌群轉(zhuǎn)化代謝而賦予新的功能活性、生物利用度，研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖被腸道菌群降解/發(fā)酵產(chǎn)生低聚糖等，能促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)宿主生理；中藥可影響參與氨基酸和脂質(zhì)代謝的腸道細(xì)菌及其代謝物，發(fā)揮治療作用；同時(shí)，一些中藥小化學(xué)分子經(jīng)菌群轉(zhuǎn)化后會(huì)進(jìn)一步增加其生物活性[24]。

3 討論與結(jié)論

肝臟是人體重要的代謝器官，肝損傷疾病嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量。研究指出，引起肝損傷的原因有多種，如化學(xué)性肝損傷、病毒性肝損傷、酒精性肝損傷等，其中化學(xué)性肝損傷是一類影響因子多且多發(fā)的肝損傷類疾病，主要病理改變包括肝纖維化、脂肪變性及肝硬化等。近年來采用中藥治療肝損傷逐漸成為相關(guān)治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究通過腹腔注射CCl4溶液的方式建立大鼠慢性肝損傷模型，對(duì)經(jīng)微生物發(fā)酵這一特殊炮制手段處理的中藥-甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)慢性肝損傷的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)研究。

綜上研究，通過對(duì)甘草葛根發(fā)酵組合物保護(hù)慢性肝損傷大鼠造模給藥后的動(dòng)物表現(xiàn)、死亡及淘汰率、肝功指標(biāo)、肝臟組織學(xué)變化和腸菌群定量分析顯示：甘草葛根發(fā)酵組合物對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，該作用與保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝組織纖維化水平、抑制炎癥反應(yīng)、降低內(nèi)毒素水平及調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

Liu等[25]研究顯示，甘草酸的生物轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中；廣譜抗生素抑制了中藥主要成分的吸收，并且通過抑制結(jié)腸菌群顯著抑制了甘草酸向甘草次酸的生物轉(zhuǎn)化。Li等[26]研究甘草酸二銨通過干預(yù)改變了非酒精性脂肪肝病小鼠的腸道菌群組成，提高了乳酸桿菌屬等益生菌的豐度；降低厚壁菌門/擬桿菌門的比值，減少了內(nèi)毒素產(chǎn)生菌，增加了短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，顯著減輕腸道低度炎癥，進(jìn)一步改善緊密連接蛋白的表達(dá)、杯狀細(xì)胞數(shù)量和黏液分泌，從而增強(qiáng)腸道屏障功能，達(dá)到降低小鼠體重、肝臟脂肪變性及肝臟炎癥的作用。本研究對(duì)象甘草葛根發(fā)酵組合物作為微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物組合物，除含有中藥活性成分及衍生成分外，還可能含有大量益生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸、肽類、氨基酸等活性物質(zhì)，可通過促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌增殖，平衡腸道菌群，降低腸道內(nèi)毒素的水平，起到保肝護(hù)肝作用[27]。

通過本研究顯示，傳統(tǒng)中藥可通過體外生物發(fā)酵處理：一方面，促進(jìn)原有中藥活性成分的高效溶出與生物轉(zhuǎn)化；另一方面，通過發(fā)酵過程富集微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，豐富活性成分的種類以及提高活性物質(zhì)含量，達(dá)到增強(qiáng)傳統(tǒng)中藥功效作用、增強(qiáng)生物利用度的目的。但是，中藥活性成分通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的機(jī)理及不同活性代謝產(chǎn)物與活性成分間的協(xié)同作用關(guān)系，以及活性物質(zhì)的具體作用靶點(diǎn)和代謝過程相關(guān)機(jī)理研究，還需要進(jìn)一步深入地研究與探討。