荊條不同部位揮發(fā)油成分的GC-MS分析

魏 婧，唐麗杰，婁曉月，侯婷婷，楚雨汝，劉 艷，劉冰冰，王 寧，錢慧琴

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

荊條（Vitex negundovar.heterophylla）是黃荊的主要變種，系馬鞭草科牡荊屬多年生小灌木，分布于我國(guó)東北、華中、西北等地區(qū)。在我國(guó)民間多當(dāng)草藥使用，其莖葉可治久痢，而花、枝葉可作為提取植物芳香油的原料[1]。此外，荊條具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，花可作為優(yōu)良的蜜源，葉片可泡茶飲用，也可開發(fā)成具抗疲勞、提神醒腦等功效的功能性食品[2-3]?，F(xiàn)代研究表明，荊條主要含有木脂素、類黃酮、環(huán)烯醚萜類、倍半萜類和三萜類等成分，具有顯著的抗炎、抗氧化的藥理活性[4-8]。

目前，關(guān)于荊條的揮發(fā)油的研究多集中于GCMS分析荊條葉和花中揮發(fā)油組成成分。劉晶鑫等[8]和王發(fā)松等[9]從荊條葉的揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)β-丁香烯含量較高。張書鋒等[10]發(fā)現(xiàn)野生荊條花揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為β-丁香烯、β-水芹烯和桉油精等。這些研究對(duì)于了解荊條葉和花中揮發(fā)油成分有一定的幫助，但忽略了荊條莖揮發(fā)油成分的研究，未能全面分析荊條莖、葉和花之間揮發(fā)油成分組成與含量差異。因此，本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS技術(shù)對(duì)荊條不同部位中揮發(fā)性組成成分進(jìn)行比較，旨在為明確荊條不同部位的物質(zhì)基礎(chǔ)和荊條的合理開發(fā)利用提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荊條 采自河南省輝縣市，于2021年7月花開放后采集；無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FA2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；1200型手掌離心機(jī) 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；安捷倫7890B 7000C氣質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent 19091S-433色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將新鮮的荊條按照莖、葉、花三個(gè)部位進(jìn)行裁剪、洗凈、陰干、粉碎，過65目篩，備用。

1.2.2 揮發(fā)油的提取 稱取荊條莖、葉、花粗粉各50 g，置1000 mL圓底燒瓶中，按照料液比1:10 mL/g加入蒸餾水，室溫浸泡2 h，按照2020 版《中國(guó)藥典》四部附錄中“揮發(fā)油測(cè)定法”中的“甲法”提取10 h，靜置冷卻分層，得淡黃色油狀物。用石油醚溶解油狀物置離心管中，再加無水硫酸鈉，于12000 r·min-1離心30 min，吸取上清液，備用。

1.2.3 GC-MS分析 色譜條件：Agilent 19091S-433色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為氦氣，流量2.3145 mL/min，進(jìn)樣量為0.2 μL，不分流，進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫條件：初始溫度60 ℃，保持1 min，然后以12 ℃·min-1升至200 ℃后，再以5 ℃·min-1升至280 ℃·min-1，保持4 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量范圍m/z 40～500。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用NIST 10標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)和文獻(xiàn)資料分析荊條莖、葉和花的揮發(fā)油成分總離子流圖確定其組成，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性成的相對(duì)百分含量[11]。采用SIMCA 14.1軟件和微生信在線平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn）對(duì)荊條不同部位的揮發(fā)油成分進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 荊條不同部位揮發(fā)油成分分析

荊條莖、葉和花中揮發(fā)油的總離子流圖如圖1，按照面積歸一法計(jì)算各揮發(fā)油成分相對(duì)百分含量，結(jié)果見表1。

圖 1 荊條不同部位揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of different parts of VNH

由表1可知，從荊條不同部位中的揮發(fā)油成分共鑒定出83種，包括烯烴類34種，酮類12種、醇類16種、氧化物類和烷烴類各3種、醚類、酯類和醛類各2種、其他10種。荊條莖、葉和花中分別鑒定出14、58和55種，相對(duì)含量分別占其總揮發(fā)油的59.91%、98.32%和95.83%。

表1 荊條不同部位揮發(fā)油成分Table 1 Volatile components from different parts of VNH

2.2 揮發(fā)油成分類別

為了確定荊條中不同部位主要貢獻(xiàn)成分的類型，根據(jù)化合物的官能團(tuán)將揮發(fā)油成分進(jìn)行分類，并計(jì)算出各類化合物的相對(duì)百分含量，結(jié)果見表2。荊條莖、葉和花中所含主要化合物有烯烴類（35.15%、60.85%和50.06%）和醇類（7.23%、20.89%和14.00%），不同部位中烯烴類均以β-丁香烯（19.12%）占絕對(duì)主導(dǎo)；莖和花中醇類以β-桉葉醇（5.2%和3.94%）為主要貢獻(xiàn)成分，而葉中則以桉樹腦（6.91%）為主要成分。另外，荊條葉和花中烯烴類和醇類化合物的含量和數(shù)量均明顯高于其莖。由表2可看出荊條不同部位主要揮發(fā)油成分組成相似，但在揮發(fā)油成分組成和含量上仍存在一定的差異。

表2 荊條不同部位各揮發(fā)油成分的含量及數(shù)量Table 2 Various volatile components and quantities in different part of VN

續(xù)表1

2.3 共有成分和特有成分

荊條莖、葉和花中所含共有揮發(fā)油成分有8種，包括γ-pyronene（7）、β-丁香烯（11）、β-金合歡烯（12）和3,7（11）-桉葉二烯（22）等。由圖2可知，荊條不同部位的共同成分的相對(duì)含量存在較大差異，其中β-丁香烯在荊條不同部位中含量都較高，β-丁香烯是一種萜烯類成分，在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗炎和抗氧化等方面產(chǎn)生顯著的生物活性[12-17]。β-金合歡烯（12）的含量莖（8.77%）＞葉（8.44%）＞花（5.73%），β-金合歡烯調(diào)節(jié)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激神經(jīng)毒性和遺傳毒性[18]；另外，β-金合歡烯是多種蚜蟲蟲害的警報(bào)信息素[19]，因此，可通過吸引蚜蟲捕食者來作為間接防御[20-21]。β-甲基紫羅蘭酮（36）的含量花 （10.27%）遠(yuǎn)高于其莖（4.67%）和葉（3.09%），可作為食用香料和日用香精。莖中茅蒼術(shù)醇（58）和β-桉葉醇（59）的含量高于其花和葉，β-桉葉醇具有潛在的抗過敏、抗腫瘤和抗血管生成活性[22-25]。茅蒼術(shù)醇能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤活性[26-27]。

圖 2 荊條不同部位共有成分的堆積圖Fig.2 Stacked plot of the common components from different parts of VNH

從荊條不同部位中揮發(fā)油成分的組差異分析，荊條花中特有成分有21種，占其揮發(fā)油成分量的21.88%，包括烯烴類7種（6.17%），酮類4種（7.39%），醇類5種（3.39%），氧化物類1種（0.44%），其他4種（4.49%），主要特有成分有2,3-二氫-3-[2-氨基乙基]-5-甲氧基-1,3-二甲基吲哚-2-酮（3.97%）、二苯環(huán)庚烯酰胺（3.3%）、檜烯（2.57%）等。荊條葉中特有成分22種，占其揮發(fā)油成分的18.26%，包括烯烴類9種（10.61%）、酮類3種（1.65%）、醇類4種（3.2%）、醛類2種（0.6%）、氧化物類2種（1.22%）、酯類1種（0.86%）、其他1種（0.12%），主要特有成分有β-松油烯（8.2%）、欖香醇（2.01%）、丁香烯氧化物（1.12%）等。荊條莖中特有揮發(fā)油成分4種，占其揮發(fā)油成分的8.68%，包括正二十一烷（3.45%）、N-（2-氧代-1,3-二氫苯并咪唑-5-基）乙酰胺（2.75%）、2,4-二叔丁基苯酚（1.81%）、14-甲基十五烷酸甲酯（0.67%）。

2.4 主成分分析

為了直觀、判斷荊條不同部位之間揮發(fā)油成分是否存在差異，采用Smica-P軟件對(duì)荊條不同部位揮發(fā)性進(jìn)行主成分分析，具體結(jié)果見得分圖3和載荷圖4。得分圖是通過分析不同樣品之間的距離判斷各樣品揮發(fā)油組成成分的差異程度，載荷圖根據(jù)不同化合物與原點(diǎn)之間的距離和方向確定各種揮發(fā)油成分與各個(gè)主成分之間的相關(guān)性[28]。

由圖3可知，第1和2主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為52.2%和47.8%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，能全面反映樣品的整體信息。因此，以上兩個(gè)主成分可作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。在得分圖中顯示荊條不同部位處于相對(duì)獨(dú)立的空間，表明荊條不同部位揮發(fā)油成分有顯著差別，同時(shí)說明PCA分析能夠?qū)ηG條不同部位進(jìn)行有效的區(qū)分。此外，圖中花和莖中距離較近，二者與葉距離較遠(yuǎn)，說明花和莖中揮發(fā)油的組成和含量有一定的相似性，而與葉有較大差異。

由圖4可知，各個(gè)揮發(fā)油成分在載荷圖中中各象限的分布較為分散，說明差異明顯的相關(guān)物質(zhì)在主成分中的貢獻(xiàn)率比較大。載荷圖中各個(gè)揮發(fā)油成分與原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)，該成分對(duì)應(yīng)主成分的相關(guān)性越高，說明這些化合物可能就是區(qū)分不同部位的關(guān)鍵化合物[29]。β-松油烯（3）、欖香醇（54）、丁香烯氧化物（69）等揮發(fā)油成分，分布于第一象限內(nèi)，與PC1呈正相關(guān)，是荊條葉的主要差異成分。檜烯（2）、2,3-二氫-3-[2-氨基乙基]-5-甲氧基-1,3-二甲基吲哚-2-酮（38）、二苯環(huán)庚烯酰胺（78）等物質(zhì)位于第二象限，與PC1呈負(fù)相關(guān)，是花的主要差異性成分。莖的差異性成分位于第三、四象限內(nèi)，與PC2呈負(fù)相關(guān)，其中貢獻(xiàn)較大的包括2,4-二叔丁基苯酚（75）、14-甲基十五烷酸甲酯（63）、正二十一烷（73）等。以上差異性成分可作為區(qū)分荊條不同部位的化學(xué)標(biāo)志物。

圖 3 荊條不同部位揮發(fā)油主成分析得分圖Fig.3 Score scatter plot of PCA of volatile components in different parts of VNH

圖 4 荊條不同部位揮發(fā)油的主成分析載荷圖Fig.4 Loading scatter pot of PCA of volatile components in different parts of VNH

2.5 聚類分析

采用Ward聚類法，以Euclidean距離為測(cè)度，相對(duì)百分含量為基準(zhǔn)，對(duì)荊條不同部位的揮發(fā)油成分進(jìn)行聚類分析[30]，結(jié)果見圖5。上方樹狀表示荊條不同部位的聚類，中部填充顏色的深淺表示各部位中各類揮發(fā)油成分含量的高低，顏色越深表示相對(duì)含量越高。由上方的聚類分析可知，荊條的花和莖聚為一類，再與葉聚為一類，說明荊條花和莖揮發(fā)油成分種類和含量間有一定的相似度，但與葉之間的差別較大，這與主成分分析的結(jié)果保持一致。

圖 5 荊條不同部位揮發(fā)油聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of volatile components of different parts of VNH

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS聯(lián)用分析技術(shù)從荊條莖、葉和花中的揮發(fā)油中共鑒定出83種揮發(fā)性成分，其中，從莖中鑒定出14種，葉中鑒定出58種，花中分鑒定出55種。通過PCA和聚類分析發(fā)現(xiàn)荊條不同部位的揮發(fā)油組成成分和含量存在一定的差異。從種類的角度來看，荊條不同部位揮發(fā)性成分中既有共有成分，也存在特有成分。共有揮發(fā)性成分僅有8種，且相對(duì)含量存在較大差異。其中，β-丁香烯在荊條莖、葉和花中相對(duì)含量較高，分別為19.12%，17.98%和16.61%。另外，從分類的角度來看，荊條莖、葉和花中烯烴類化合物相對(duì)含量較高，而烯烴類主要成分中β-丁香烯和β-金合歡烯的含量較高。β-丁香烯在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗炎等方面顯示較好的藥理活性，而β-金合歡烯可以作為某些香料產(chǎn)品的基本原料。因此，無論是在臨床上，還是在農(nóng)業(yè)或者工業(yè)生產(chǎn)中，荊條莖揮發(fā)性成分的加工和開發(fā)都是不可忽視的。綜上所述，荊條不同部位揮發(fā)油具有較高藥用和工業(yè)價(jià)值，這為荊條不同部位揮發(fā)油的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。