超聲波結(jié)合酶法提取艾葉總生物堿工藝優(yōu)化及其抑菌活性

陳 陽，廖子蔚，陶娟娟，江 丹，孫代華,2，陳志元,

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北黃石 435000；2.湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，湖北黃石 435000）

艾葉（Artemisia argyileaves）又名艾蒿、家艾，氣味清香、味苦，廣泛分布于我國的湖北、河南、安徽等地[1-3]。在我國南方，艾葉常被作為食物原料制作艾葉粽、艾葉饅頭、艾葉餅干等功能性食品[4]。目前，對艾葉的應用主要集中于其黃酮類成分、多糖、艾葉精油上，而對艾葉中生物堿利用的報道較少[5-7]。有研究表明生物堿化合物具有較為顯著的降血糖、抗腫瘤、保護神經(jīng)系統(tǒng)、治療炎癥、治療心腦血管疾病等作用，具有較高的經(jīng)濟價值[8-10]。

傳統(tǒng)提取生物堿的方法主要有冷凝回流法、有機溶劑提取法、超聲提取法，但都提取時間較長或得率不高[11]。近年來，已有報道證明超聲波結(jié)合酶法提取生物堿具有較高的研究前景[12]。生物酶解技術(shù)可以在極短的時間內(nèi)將植物細胞壁分解，促使內(nèi)部天然產(chǎn)物活性成分流出，極大地提高了目標成分的提取率[13-15]。超聲波技術(shù)利用超聲波與介質(zhì)的機械摩擦、空化、解聚、放熱等作用，使天然產(chǎn)物在溶劑中瞬間產(chǎn)生的空穴崩解，細胞破碎，從而縮短了胞內(nèi)外的物質(zhì)交換時間[16-17]。因此，與傳統(tǒng)的生物堿提取方法相比，超聲波結(jié)合酶法提取生物堿具有耗時時間短、提取量高等優(yōu)勢[12]。

目前，僅有使用有機溶劑提取法對艾葉中總生物堿進行提取的研究，但提取方式較為單一、有效成分提取量較低且功能活性尚不明確[18]。本課題組尚未發(fā)現(xiàn)有超聲波結(jié)合酶法提取艾葉中總生物堿及其抑菌活性的相關(guān)研究報道。因此，對超聲波結(jié)合酶法提取艾葉中總生物堿的工藝進行優(yōu)化并研究其抑菌活性是非常有意義的。本實驗以單因素實驗和Plackett-Burman試驗篩選出對艾葉總生物堿提取量影響較大的因素，再利用Box-Behnken試驗對超聲波結(jié)合酶法提取艾葉中總生物堿的工藝進行優(yōu)化研究，以獲得提取艾葉中總生物堿的最佳工藝條件，并運用紙片法和稀釋法測定艾葉總生物堿提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性，為艾葉中總生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)和艾葉資源的綜合利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾葉 湖北省桐羅堂中藥材有限公司，經(jīng)湖北師范大學張新潮副教授鑒定為菊科植物艾A. argyiLevl. et Vant.的干燥葉；鹽酸小檗堿 標準品HPLC≥98%，中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（酶活力≥50000 U/g，327T011）、果膠酶（酶活力≥50 U/g，335A022） 索萊寶科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）美國MicroBiologics公司；慶大霉素 上海吉至生化科技有限公司。

TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用有限公司；AB135-S分析天平 梅特勒-托利多公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海深信實驗儀器有限公司；Synergy H1多功能酶標儀 美國Biotek公司；觸摸式超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 艾葉總生物堿提取工藝 精確稱取50 g艾葉（過60目篩）和0.75 g復合酶（纖維素酶:果膠酶=1:1），加入到5倍體積的純凈水中，混勻，升溫至50 ℃，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，水浴酶解2 h，在酶解過程中每隔10 min測量溶液pH，并根據(jù)測定結(jié)果使用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH，保持溶液pH穩(wěn)定，酶解結(jié)束后升溫溶液至95 ℃滅活復合酶，然后使用95%乙醇和純凈水將溶劑調(diào)整為25倍量的70%乙醇溶液，超聲（140 W，55 ℃）40 min，過濾，搖勻，即得艾葉總生物堿提取液樣品。

1.2.2 單因素實驗 精確稱取50 g艾葉（過60目篩），參考冀德富等[12]的方法并根據(jù)預實驗的結(jié)果設(shè)定酶解溫度50 ℃，復合酶添加量2%（纖維素酶:果膠酶=1:1），料液比1:25 g/mL，酶解pH5.0，酶解時間2 h，乙醇濃度70%，超聲溫度55 ℃，超聲功率140 W，超聲時間30 min為艾葉總生物堿單因素實驗過程中的常規(guī)變量。以超聲時間（20、30、40、50、60 min）、復合酶添加量（0%、1%、2%、3%、4%）、料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）、酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、超聲功率（120、140、160、180、200 W）、酶解pH（4、5、6、7、8）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、超聲溫度（50、55、60、65、70 ℃）8個變量代替單因素實驗中的相應常規(guī)變量，研究各因素對艾葉總生物堿提取量的影響。

1.2.3 Plackett-Burman試驗篩選關(guān)鍵因素 依據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以艾葉總生物堿的提取量為響應值，對料液比、復合酶添加量、酶解時間、酶解pH、超聲時間、超聲功率、乙醇濃度、超聲溫度8個變量進行篩選，每個單因素選取低水平（-1）和高水平（1）兩個水平，共計12組實驗。Plackett-Burman試驗因素及水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental

1.2.4 Box-Behnken試驗優(yōu)化艾葉總生物堿提取工藝 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取超聲時間（A）、復合酶添加量（B）和酶解時間（C）為自變量，設(shè)定艾葉總生物堿的提取量為響應值，進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，實驗設(shè)計表如表2所示。

表2 響應面試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Design factors and level of response surface methodology

1.2.5 艾葉總生物堿提取量測定 參考李杰等[18]的方法，精密稱取12.5 mg鹽酸小檗堿對照品（105 ℃干燥至恒重）溶解至終濃度為0.25 mg/mL。分別吸取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，以硫酸定容后在350 nm吸光度下檢測樣品的吸光度A值。以鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度為橫坐標，測得的吸光度A值為縱坐標，得到標準曲線A=0.0698C+0.0602，R2=0.9981。使用建立鹽酸小檗堿標準曲線的方法，測定艾葉總生物堿提取液樣品的吸光度A值，并根據(jù)A值計算出樣品中艾葉總生物堿的濃度[19]。艾葉總生物堿的提取量按照公式（1）計算：

式中：Y為艾葉總生物堿提取量，mg/g；C為根據(jù)鹽酸小檗堿標準曲線計算得到的艾葉總生物堿的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為艾葉總生物堿定容后的體積，mL；M為實驗使用的艾葉樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 培養(yǎng)基的配制 抑菌實驗選用LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨5.0 g、酵母粉2.5 g、氯化鈉5.0 g、去離子水500 mL，LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加入2.5%的瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.2.7 菌懸液的制備 分別將各供試菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，使用無菌接種針挑取少許活化后的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，然后繼續(xù)37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h后，使用無菌生理鹽水稀釋制備出含菌1×106～1×107CFU/mL的菌懸液[20]。

1.2.8 紙片法測定艾葉總生物堿抑菌圈直徑 用加樣槍移取30 μL經(jīng)活化的菌懸液于LB固體培養(yǎng)基上，用L型玻璃涂布棒涂布均勻。向6 mm藥敏紙片上分別加10 μL無菌提取物溶液（總生物堿濃度分別為1.6、3.2、6.4 mg/mL），將藥敏紙片貼于平板表面。以無菌水做陰性對照，以慶大霉素作為陽性對照。將涂布有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的LB固體培養(yǎng)基平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。所有實驗設(shè)置3個平行實驗組，測定各抑菌圈的直徑[21]。

1.2.9 最低抑菌濃度（MIC）測定 采用兩倍稀釋法測定艾葉總生物堿的最低抑菌濃度，將艾葉總生物堿梯度稀釋為0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL，分別精確吸取1 mL各梯度稀釋液于無菌試管中，再在各個試管中加入1 mL LB液體培養(yǎng)基和100 μL菌懸液，對照組中使用1 mL無菌水代替艾葉總生物堿稀釋液，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。以試管澄清狀態(tài)的稀釋液濃度為最低抑菌濃度[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗使用軟件SPSS20.0進行顯著性分析，以O(shè)rigin8.6作圖，采用Design-Expert V8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對艾葉總生物堿提取量的影響 從圖1A可以看出，當超聲時間為40 min時，艾葉總生物堿的提取量達到最高值，隨著超聲時間延長其提取量逐漸降低。這可能是由于當超聲時間為40 min時，艾葉細胞壁破壞度最高，酶促反應過程較為徹底。但是隨著超聲時間延長，艾葉總生物堿會被超聲波的熱效應、剪切效應以及空穴效應分解，從而導致艾葉總生物堿的提取量降低[23]。因此，超聲時間應在30～50 min較為合理。

2.1.2 復合酶添加量對艾葉總生物堿提取量的影響由圖1B可知，艾葉總生物堿的提取量隨著復合酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在2%時達到最高值。當酶濃度在適宜的范圍內(nèi)時，隨著酶濃度的升高，酶與底物相互碰撞接觸的機會開始加劇，酶對艾葉細胞壁的酶解速率加快，從而使胞內(nèi)總生物堿溶出率增加。當酶濃度過高時，由于酶存在競爭性抑制作用，反而降低了細胞壁的酶解度，導致胞內(nèi)溶出物減少[24]?？紤]到酶的價格問題，因此復合酶添加量應在1%～3%較為合理。

圖 1 超聲時間（A）、復合酶添加量（B）、料液比（C）、酶解時間（D）、超聲功率（E）、酶解pH（F）、乙醇濃度（G）以及超聲溫度（H）對艾葉總生物堿提取量的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time (A), compound enzyme addition amount (B), solid to liquid ratio (C), enzymolysis time (D), ultrasonic Power (E), enzymatic pH (F), ethanol concentration (G) and ultrasonic temperature (H) on yield of total alkaloids from Artemisia argyi leaves

2.1.3 料液比對艾葉總生物堿提取量的影響 由圖1C可知，艾葉總生物堿的提取量隨著料液比的升高呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢。這是因為隨著料液比的增加，溶劑進入細胞壁的速率加快，從而利于溶劑將胞內(nèi)物質(zhì)帶出，然而當料液比繼續(xù)增加時，細胞轉(zhuǎn)運通道達到飽和狀態(tài)，并不能繼續(xù)提高艾葉總生物堿的提取量?？紤]到生產(chǎn)耗能問題，因此料液比應在1:20～1:30 g/mL較為合理。

2.1.4 酶解時間對艾葉總生物堿提取量的影響 從圖1D中可以看出，艾葉總生物堿的提取量隨著酶解時間的增加先升高后降低，在酶解時間為1.5 h時達到最大值，這與Meng等[25]的研究結(jié)果一致。因此，酶解時間在1～2 h較為合理。

2.1.5 超聲功率對艾葉總生物堿提取量的影響 由圖1E可知，艾葉總生物堿的提取量隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這是因為隨著超聲功率的增加，細胞壁被破壞程度逐漸提高，胞內(nèi)物質(zhì)溶出的更加徹底。但超聲功率過高時會造成過熱現(xiàn)象，從而分解胞內(nèi)目標物質(zhì)[26]。因此，選擇超聲功率為140～180 W較為適宜。

2.1.6 酶解pH對艾葉總生物堿提取量的影響 由圖1F可知，當酶解pH為6時，艾葉總生物堿的提取量最高。這可能是因為復合酶在較為合適的pH范圍內(nèi)，酶活較高，過高或過低的反應pH均會影響酶與底物的結(jié)合，從而造成提取量下降[27]。因此，選擇酶解pH為5～7較為適宜。

2.1.7 乙醇濃度對艾葉總生物堿提取量的影響 由圖1G可知，乙醇濃度在50%～80%范圍內(nèi)，艾葉總生物堿的提取量逐漸升高，乙醇濃度為80%時，提取量達到最大值。當乙醇濃度高于80%時，提取量逐漸下降。這可能是由于隨著乙醇濃度的增加，艾葉中的脂溶性成分溶出，這些脂溶性成分可能與乙醇-水分子相互結(jié)合，從而與艾葉中的生物堿形成競爭關(guān)系，導致艾葉總生物堿的提取量下降[28]。

2.1.8 超聲溫度對艾葉總生物堿提取量的影響 由圖1H可知，在50～60 ℃，隨著超聲溫度的升高，艾葉總生物堿的提取量提高，當超聲溫度高于60 ℃，艾葉總生物堿的提取量開始下降，可能是由于溫度過高導致生物堿結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，部分生物堿被分解，從而引起艾葉總生物堿的提取量下降[29]。

2.2 關(guān)鍵因素分析

使用Minitab17軟件對Plackett-Burman試驗設(shè)計表（表3）中的各項數(shù)據(jù)進行多元回歸方程分析，得到以艾葉總生物堿的提取量為響應值的回歸方程為：Y=0.4793+0.0701A+0.0758B+0.0370C+0.0820D+0.0387E-0.0325F-0.0076G+0.0005H，同時得到各因素的效應評價情況，如表4所示。

表3 Plackett-Burman試驗各因素設(shè)計及響應值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman test

根據(jù)表4中效應值的大小可知，影響艾葉總生物堿提取量的各因素大小順序為酶解時間（X4）＞復合酶添加量（X2）＞超聲時間（X1）＞超聲功率（X5）＞料液比（X3）＞超聲溫度（X8）＞乙醇濃度（X7）＞酶解pH（X6）[30]。根據(jù)P的大小可知，超聲時間、復合酶添加量以及酶解時間對艾葉總生物堿提取量的影響具有顯著性意義（P＜0.05），而料液比、超聲功率、酶解pH、乙醇濃度和超聲溫度影響無顯著性意義（P＞0.05）。因此選擇超聲時間、復合酶添加量和酶解時間這三個顯著因素進行響應面優(yōu)化分析。根據(jù)單因素實驗的結(jié)果并考慮生產(chǎn)成本，固定料液比1:25 g/mL、超聲功率160 W、酶解pH6.0、乙醇濃度80%和超聲溫度60 ℃。

表4 Plackett-Burman試驗各因素效應評價Table 4 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design

2.3 Box-Benhnken試驗優(yōu)化分析

2.3.1 響應面多元回歸方程的建立 采用Design-Expert V8.0.6軟件對表5中的響應面數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合分析。得到兩個因素之間交互作用對艾葉總生物堿提取量影響的等高線圖和3D響應面圖（圖2），并得到以艾葉總生物堿的提取量為目標的回歸方程模型公式為：Y=-0.67351+0.034709A+0.13931B+0.80485C+(3.17500E-004)AB+(1.31839E-017)AC-0.031700BC-(4.59625E-004)A2-0.031663B2-0.24715C2。

圖 2 各因素交互作用對艾葉總生物堿提取量的影響Fig.2 Effects of various factors interactions on the yield of total alkaloids from Artemisia argyi leaves

表5 響應面優(yōu)化方案及結(jié)果Table 5 Response surface optimization scheme and results

2.3.2 響應面方差分析 進一步對該模型進行方差分析以及顯著性檢驗，結(jié)果如表6所示。

由表6可知，該回歸方程模型P＜0.05且失擬項P=0.8463＞0.05，表明該多元回歸方程模型的擬合度較高，用于優(yōu)化艾葉總生物堿的提取量可靠性強[31]。另外，該模型的決定系數(shù)R2=0.9938且調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9859，說明通過該方程得到的優(yōu)化實驗結(jié)果相關(guān)性和真實性較強。因此，該模型可用于優(yōu)化和預測艾葉總生物堿的提取量。表6中A、B、BC、A2、B2和C2對艾葉總生物堿提取量的影響具有顯著性意義（P＜0.05），而C、AB、AC對艾葉總生物堿提取量的影響不具有顯著性意義（P＞0.05）[32]。使用Design-Expert V8.0.6軟件對該多元回歸方程模型的最佳提取工藝進行預測，得出艾葉總生物堿提取的最佳條件為超聲時間38.31 min，復合酶添加量1.63%，酶解時間1.52 h，在此基礎(chǔ)上，預測艾葉總生物堿的提取量最高為0.718 mg/g。

表6 響應面回歸方程模型方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface regression equation model

2.3.3 艾葉總生物堿的最優(yōu)提取條件驗證結(jié)果 考慮到工業(yè)實際生產(chǎn)情況，并結(jié)合超聲時間40 min、復合酶添加量1.60%、酶解時間1.5 h進行三次平行驗證實驗，得到艾葉總生物堿提取量的平均值為0.720±0.05 mg/g，與得到的預測值無顯著性差異（P＞0.05）。李杰等[18]使用乙醇直接提取艾葉總生物堿，并利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法對其響應面數(shù)據(jù)進行建模，優(yōu)化提取工藝后得到艾葉總生物堿的提取量為

0.3827 mg/g。本實驗采用超聲波結(jié)合酶法提取艾葉總生物堿將其提取量提高約188.14%。因此，超聲波結(jié)合酶法提取艾葉總生物堿不僅具有較高的工業(yè)價值，而且拓寬了艾葉總生物堿的利用空間。

2.4 抑菌活性分析

2.4.1 艾葉總生物堿抑菌效果分析 圖3是艾葉總生物堿提取液對大腸桿菌（Ⅰ）和金黃色葡萄球菌（Ⅱ）的抑菌作用效果圖，其中ⅠA和ⅡB為20%慶大霉素抑菌圈，ⅠB和ⅡA為3.2 mg/mL的艾葉總生物堿抑菌圈。由圖3和表7可知，艾葉總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較為明顯的抑菌效果，且隨著濃度的增加抑菌圈的直徑逐漸變大。3.2 mg/mL的艾葉總生物堿對大腸桿菌的抑菌作用與20%慶大霉素抑菌作用效果相近；3.2 mg/mL的艾葉總生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌作用略強于20%慶大霉素抑菌作用效果。這說明艾葉總生物堿對不同的致病菌種類抑菌效果也不相同。總體來說，艾葉總生物堿具有抑菌效果。

圖 3 艾葉總生物堿提取液對大腸桿菌（Ⅰ）和金黃色葡萄球菌（Ⅱ）的抑菌作用Fig.3 Antibacterial effect of the extract of total alkaloids from Artemisia argyi leaves on Escherichia coli (Ⅰ) and Staphylococcus aureus (Ⅱ)

表7 不同濃度艾葉總生物堿提取液的抑菌性Table 7 Antibacterial properties of extracts of total alkaloids from Artemisia argyi leaves at different concentrations

2.4.2 艾葉總生物堿最低抑菌濃度結(jié)果 由表8可以看出，艾葉總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為3.2、1.6 mg/mL。這表明艾葉總生物堿對金黃色葡萄球菌的抑菌活性高于大腸桿菌。

表8 艾葉總生物堿的最低抑菌濃度（MIC）Table 8 Minimum inhibitory concentration (MIC) of the total alkaloids from Artemisia argyi leaves

3 結(jié)論

本實驗使用超聲波結(jié)合酶法提取艾葉總生物堿，首先通過單因素實驗得到各個因素的最佳范圍條件，再使用Plackett-Burman法篩選出對艾葉總生物堿提取量影響較為顯著的因素，最后利用Box-Behnken法對提取工藝進行優(yōu)化分析，得出最佳的提取工藝條件為超聲時間40 min，復合酶添加量1.60%，酶解時間1.5 h，料液比1:25 g/mL，酶解pH6.0，超聲功率160 W，乙醇濃度80%，超聲溫度60 ℃，在此提取工藝條件下艾葉總生物堿的提取量為0.720±0.05 mg/g。另外，通過抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，艾葉總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果高于大腸桿菌。從實際應用方面分析，艾葉總生物堿提取物可能成為一種新型的抑菌原料去替代合成抗生素應用于生物、化學、飼料加工等領(lǐng)域。本實驗為艾葉總生物堿的利用提供了參考依據(jù)，擴大了艾葉資源的利用范圍。