單糖/雙糖對近中性p H下共軛亞油酸囊泡影響的比較

李 磊，方 云，夏詠梅，薄純玲，樊 曄

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,2.化學(xué)與材料工程學(xué)院,合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實驗室,無錫 214122）

脂肪酸囊泡（Fatty acid vesicles，F(xiàn)AV）是脂肪酸分子及離子在其pKa附近通過氫鍵作用形成“脂肪酸二聚體”，繼而自組裝形成的封閉雙層膜結(jié)構(gòu)［1～3］，其對研究原始細(xì)胞膜模型［4～6］有重要理論意義，并在微反應(yīng)器［7］、熒光納米點(diǎn)［8］和潛在的藥物傳輸系統(tǒng)［9，10］等方面有重要應(yīng)用價值，但脂肪酸僅在其pKa附近1～2個pH單位范圍內(nèi)形成囊泡［11］.研究者們已經(jīng)添加其它雙親分子與脂肪酸共組裝［2］，或?qū)⒅舅徇M(jìn)行化學(xué)改性［3］，即通過改變FAV的囊泡砌塊增強(qiáng)FAV的穩(wěn)定性.較之上述共組裝和化學(xué)改性方法［1-3］，添加多官能團(tuán)小分子成為拓寬其pH窗口或增加其穩(wěn)定性的更簡單方法.初步發(fā)現(xiàn)一些二元醇和丙三醇可以使油酸FAV的pH窗口雙向拓寬［12］，而二乙烯三胺只能使其向堿性拓寬［13］，說明多羥基結(jié)構(gòu)對拓寬FAV的近中性pH窗口有利.文獻(xiàn)還報道單糖［14，15］、堿基［14］、氨基酸［16］、核苷［17］及二肽［18］可增加癸酸FAV的穩(wěn)定性，但尚未關(guān)注它們對FAV的pH窗口的影響.共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）作為一種天然存在的人體必需脂肪酸［19］，利用其共軛雙鍵自交聯(lián)可以幫助穩(wěn)定FAV，因而有利于透射電子顯微鏡（TEM）表征［20］.因此，本文選取CLA為FAV的囊泡砌塊，考察了乳糖等3種典型雙糖和核糖作為典型單糖及其復(fù)配物對CLA形成FAV的pH窗口的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

共軛亞油酸（CLA，純度＞95%），大連醫(yī)諾生物股份有限公司；D-（+）-海藻糖（T，純度≥99%）、蔗糖（S，A.R.級）、D-（-）-核糖（R，純度98%）、D-（+）-葡萄糖（G，A.R.級）、D-（+）-氨基葡萄糖（A，純度≥99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳糖（L，A.R.級）、2-異丙基硫雜蒽酮（ITX，A.R.級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N，N-二羥乙基甘氨酸（Bicine，純度≥99%，Ruibio進(jìn)口分裝），合肥博美生物科技有限公司；其它試劑均為分析純.實驗用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm.

FE-20型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VHX-1000C型超景深三維顯微鏡，Keyence（香港）有限公司；JEOL-JEM 2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射儀，德國ALV公司；TU1950型雙光束紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PowerArc UV 100型紫外點(diǎn)光源固化系統(tǒng)，河北藍(lán)天特?zé)舭l(fā)展有限公司；MicroCal VP-ITC型等溫滴定量熱儀，英國Malvern Panalytical儀器有限公司.

1.2 FAV的制備及其p H窗口的判斷

將氫氧化鈉的無水乙醇溶液在磁力攪拌下緩慢滴加入等摩爾CLA的無水乙醇溶液中，經(jīng)皂化反應(yīng)得到共軛亞油酸鈉，脫除溶劑后真空干燥以方便稱量及配制水溶液.用0.01 mol/L的NaOH（含0.09 mol/L的NaCl）溶液為溶劑分別配制各種糖-CLA系列儲備液，其中CLA的濃度均為3 mmol/L，激光丁達(dá)爾效應(yīng)實驗過程及判斷pH窗口方法參照文獻(xiàn)［12］.

1.3 FAV的形貌及平均粒徑表征

用磷酸鹽緩沖液重新配制1.2節(jié)中的溶液，經(jīng)紫外光引發(fā)交聯(lián)后獲取FAV的透射電子顯微鏡（TEM）影像［21］；經(jīng)動態(tài)光散射（DLS）獲取平均粒徑（Dh）［21］；超景深光學(xué)顯微鏡方法參照文獻(xiàn)［12］.

1.4 FAV的耐溫變性及耐鹽性測試

采用pH為8.5的Bicine-NaOH緩沖液（0.1 mol/L）配制3 mmol/L的CLA溶液作為儲備液，并以此為溶劑配制各種糖-CLA樣品；同時配制含NaCl（0.2 mol/L）的樣品.靜置24 h后置于60℃水浴中30 min，待溶液恢復(fù)至室溫后，在25℃下測定400 nm處的吸光度（A1）.以不含糖的CLA溶液在25℃下400 nm處的吸光度（A0）為參照值，采用公式R=（A0-A1）/A0×100%求取各體系恢復(fù)至25℃后吸光度降低的百分?jǐn)?shù)（R，%），據(jù)此判斷混合溶液中FAV的耐溫變和耐鹽性，該值越大，表示FAV的耐溫變或耐鹽性越好.

1.5 等溫滴定量熱測試

在樣品池中注入1.4 mL的CLA（6 mmol/L）緩沖溶液，參比池中注入同體積的超純水，在307 r/min及（25±0.1）℃下采用28滴（10μL）自動加樣滴定（兩滴間隔為240 s）模式加入各種糖溶液（除了糖R和A濃度為15 mmol/L，其余糖溶液均為60 mmol/L）.滴定對應(yīng)pH值的緩沖液獲得稀釋熱，各體系量熱實驗數(shù)據(jù)扣除相應(yīng)稀釋熱后得到各種糖-CLA的相互作用熱數(shù)據(jù).采用結(jié)合模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得相互作用熱力學(xué)參數(shù).

1.6 結(jié)合能計算

采用Gaussian 16軟件［22］對雙糖L或單糖R與CLA分子/離子之間弱相互作用進(jìn)行理論計算，其中幾何結(jié)構(gòu)及頻率優(yōu)化采用雜化泛函B3LYP方法結(jié)合6-311G（d，p）基組及D3（BJ）色散校正，以頻率優(yōu)化無虛頻為優(yōu)化結(jié)果穩(wěn)定性判斷依據(jù).結(jié)合能計算采用M06-2X-D3/6-311+G（2d，p）//B3LYP-D3（BJ）/6-311G（d，p）級別，并進(jìn)行基組疊加誤差（BSSE）校正.

2 結(jié)果與討論

2.1 雙糖或單糖對FAV的pH窗口的影響

采用激光丁達(dá)爾效應(yīng)［12］觀察各種糖-CLA分散液的相變，其中CLA及L-CLA分散液的典型實驗結(jié)果見圖1，分散液隨pH降低呈透明-乳光-渾濁-油滴分別對應(yīng)膠束-囊泡-乳液-分相的相態(tài)變化.圖1（A）得到CLA形成FAV的pH窗口為7.8～9.2［23］；圖1（B）得出L-CLA形成FAV的pH窗口為7.3～9.4，向近中性及堿性雙向均有拓寬，且誤差小于0.1 pH單位.

Fig.1 Determination of the p H window for FAV of CLA(A)and L?CLA(B)and other phase boundaries of the suspensions corresponding to p H variation by aid of the laser Tyndall effect observation

上述兩個體系的相邊界被標(biāo)記在各自的pH滴定曲線上［圖2（A）和（B）］.由于生理環(huán)境下形成FAV的pH窗口更受關(guān)注［10，18，24］，由圖2（C）的TEM照片觀察到L-CLA體系在近中性pH窗口端有較多囊泡；圖2（D）顯示其平均粒徑為20.6 nm；圖2（E）的DLS結(jié)果表明，其Dh為22.5 nm.上述結(jié)果均列于表1，印證了用激光丁達(dá)爾效應(yīng)判斷FAV的pH窗口的準(zhǔn)確性.等溫滴定量熱法（ITC）可以進(jìn)一步揭示溶液中的非共價鍵合作用［25～27］，L-CLA溶液體系的等溫滴定曲線如圖2（F）所示，其熱力學(xué)參數(shù)見表1，ΔG＜0且ΔS＞0說明L與CLA之間的非共價鍵合過程為自發(fā)的熵驅(qū)動過程，而ΔH＜0且ΔS＞0說明焓和熵對結(jié)合過程均有貢獻(xiàn)［25，26］，該相互作用涉及氫鍵和疏水相互作用［26］.

另外，兩種雙糖T-CLA和S-CLA分散液的結(jié)果（見本文支持信息圖S1）與圖1和圖2具有相似趨勢，其各項數(shù)據(jù)也列于表1.故本文所考察的3種雙糖均可以使FAV的pH窗口較CLA本身雙向拓寬，但與二元醇或甘油［12］相比未見明顯優(yōu)勢，初步說明并不是分子中羥基越多越有益.典型的單糖R-CLA形成FAV的結(jié)果［23］也列于表1，其拓寬FAV的pH窗口（7.0～9.5）的能力顯然強(qiáng)于3種雙糖，進(jìn)一步說明多羥基分子結(jié)構(gòu)雖然是拓寬FAV的近中性pH窗口的必要條件，但并不是唯一決定因素，還可能與這類分子在FAV表面的作用位點(diǎn)數(shù)有關(guān).推測雙糖的雙環(huán)結(jié)構(gòu)可能比單糖的單環(huán)結(jié)構(gòu)更易與FAV表面多位點(diǎn)結(jié)合，從而減少了其與環(huán)境水分子締合的剩余羥基數(shù)（與2分子R比較），因而減效.

Fig.2 p H?V HCl curve and the laser Tyndall effect proofs corresponding to different phase regions(inset)of CLA(A)and L?CLA(molar ratio 0.1∶1.0)(B),TEM image(C),apparent particle size distribution using TEM(D),average hydrodynamic diameter(D h)using DLS for L?CLA(molar ratio 0.1∶1.0)(E),and ITC determination of L titrating FAV in buffer solution at pH=7(F)

Table 1 pH window for FAV formation,average particle size at the near neutral-side p H window,and thermodynamic parameter of disaccharide(or monosaccharide)-CLA suspensions

2.2 雙糖/單糖或單糖/單糖復(fù)配物對FAV的pH窗口的微調(diào)作用

為了進(jìn)一步證實上述推測，首先以L/R-CLA分散液為例考察了雙糖/單糖復(fù)配物，圖3（A）顯示其pH窗口為7.1～9.3，圖3（B）顯示近中性pH窗口端同樣有較多囊泡，圖3（C）～（E）顯示了該體系的其它性質(zhì).T/R-CLA和S/R-CLA分散液的結(jié)果（見本文支持信息圖S2）與圖3類似，將3種雙糖/單糖復(fù)配物的數(shù)據(jù)均列于表2，可見單糖對雙糖-CLA形成FAV的pH窗口有微調(diào)作用，且更接近單糖R-CLA的結(jié)果，說明單糖在FAV表面存在比雙糖更強(qiáng)的競爭吸附，推斷單糖優(yōu)先結(jié)合可能減弱了雙糖吸附的多位點(diǎn)效應(yīng).

進(jìn)一步考察了單糖/單糖復(fù)配物對FAV的pH窗口的影響.圖4（A）表明，A/R-CLA可使FAV的近中性pH窗口端拓寬至6.5，圖4（B）～（E）顯示了該體系的其它性質(zhì).A/R-CLA及G/R-CLA兩種單糖復(fù)配物數(shù)據(jù)見表2.在具有等量糖元的基礎(chǔ)上進(jìn)行比較，由于兩種單糖/單糖復(fù)配物對近中性pH窗口的微調(diào)作用均強(qiáng)于表1中的3種雙糖，且等于或優(yōu)于R本身，支持雙糖更傾向于在FAV表面多位點(diǎn)結(jié)合的推測，因此單糖可提供更多與環(huán)境水分子締合的自由羥基，比雙糖更有利于拓寬FAV的近中性pH窗口.

Fig.3 p H?V HCl curve and the laser Tyndall effect proofs corresponding to different phase regions(inset)of L/R?CLA(molar ratio 0.1∶0.1∶1.0)(A),TEM image(B),apparent particle size distribution using TEM(C),average hydrodynamic diameter(D h)using DLS for L/R?CLA(molar ratio 0.1∶0.1∶1.0)(D),and ITC determination of L/R mixture titrating FAV in buffer solution at pH=7(E)

Fig.4 p H?V HCl curve and the laser Tyndall effect proofs corresponding to different phase regions(inset)of A/R?CLA(molar ratio 0.1∶0.1∶1.0)(A),TEM image(B),apparent particle size distribution using TEM(C),average hydrodynamic diameter(D h)using DLS for A/R?CLA(molar ratio 0.1∶0.1∶1.0)(D),and ITC determination of A/R mixture titrating FAV in buffer solution at pH=7(E)

Table 2 p H window for CLA-FAV formation,average particle size at the near neutral-side pH window and thermodynamic parameter of disaccharide/R(or monosaccharide/R)-CLA suspensions

2.3 FAV的耐溫變性及耐鹽性

溫度或鹽度變化均會引起FAV表面波動［28］而致解體，若糖與FAV表面有非共價鍵合作用，并與水有締合作用就會減緩其解體［14，15］.如表3所示，各種糖-CLA體系在升降溫循環(huán)后，吸光度均表現(xiàn)出不同程度降低，說明與FAV表面均存在非共價鍵合作用，不同程度地增強(qiáng)了FAV的環(huán)境穩(wěn)定性.

Table 3 Values of R(%)influenced by disaccharide-CLA,disaccharide/R(or monosaccharide/R)-CLA suspensions

圖5通過超景深顯微鏡觀察到各種糖-CLA體系存在微米級的多層囊泡（Multilamellar vesicles，MLV）［29］，說明糖分子還可以通過插入多層囊泡層間并與相鄰雙分子層共同結(jié)合的方式增強(qiáng)FAV的環(huán)境穩(wěn)定性［12］.

Fig.5 Optical micrographs of disaccharide?CLA(molar ratio 0.1∶1.0),disaccharide/ribose?CLA and monosaccharide/ribose?CLA(molar ratio 0.1∶0.1∶1.0)solutions at the alkaline?side p H window(pH=9.4)composed of L(A),T(B),S(C),L/R(D),T/R(E),S/R(F),A/R(G)and G/R(H)

2.4 雙糖或單糖及其復(fù)配物與FAV表面的相互作用

上述實驗結(jié)果表明，雙糖或單糖及其復(fù)配物均可以拓寬CLA形成FAV的近中性pH窗口，且按照雙糖＜單糖≈雙糖/單糖≤單糖/單糖順序依次增強(qiáng)，已經(jīng)表明這是由單糖競爭吸附以及推斷糖分子與FAV表面的作用位點(diǎn)數(shù)不同導(dǎo)致.圖6（A）列出了典型雙糖L或典型單糖R與CLA分子/離子或水分子［23］的結(jié)合能計算結(jié)果，主要為氫鍵（4～120 kJ/mol）或離子-偶極（50～200 kJ/mol）相互作用范圍［30］，結(jié)合能強(qiáng)度符合L-CLA＜R-CLA和L-Water＜R-Water兩個規(guī)律.前一個規(guī)律與單糖對FAV表面的競爭吸附強(qiáng)于雙糖的實驗結(jié)果相吻合；這兩個規(guī)律均與單糖比雙糖分子更易拓寬FAV的近中性pH窗口的實驗事實相符，也支持雙糖可能與FAV表面多位點(diǎn)結(jié)合的推測.圖6（B）據(jù)此給出了雙糖或單糖及其復(fù)配物與FAV表面結(jié)合的可能機(jī)理及其比較拓展近中性pH窗口能力的示意圖，可以解釋本文實驗結(jié)果.

Fig.6 Comparison of binding energies between saccharides and protonated/deprotonated CLA or water(A),and schematic illustration of the binding mechanism of saccharides on the FAV surface(B)

3 結(jié) 論

選取CLA為FAV的囊泡砌塊，考察乳糖等3種典型雙糖或核糖等3種典型單糖及其復(fù)配物對CLA形成FAV的pH窗口的影響.采用激光丁達(dá)爾效應(yīng)觀察各種糖-CLA分散液的相變，并確定形成FAV的pH窗口.實驗結(jié)果表明，雙糖或單糖及其復(fù)配物均可以拓寬CLA形成FAV的近中性pH窗口，且按照雙糖＜單糖≈雙糖/單糖≤單糖/單糖的順序依次增強(qiáng)，說明多羥基分子結(jié)構(gòu)雖然是拓寬FAV的近中性pH窗口的必要條件，但并不是唯一決定因素，還可能與這類分子在FAV表面的作用位點(diǎn)數(shù)有關(guān).實驗和計算結(jié)果均表明，單糖在FAV表面存在比雙糖更強(qiáng)的競爭吸附，單糖優(yōu)先結(jié)合可能減弱了雙糖吸附的多位點(diǎn)效應(yīng)，因此單糖可以提供更多與環(huán)境水分子締合的自由羥基，比雙糖更有利于拓寬FAV的近中性pH窗口.本文為進(jìn)一步選擇多羥基小分子作為FAV的調(diào)節(jié)劑提供了理論依據(jù)，也為開發(fā)生物相容性的FAV型緩釋載體提供了參考.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210860.