調(diào)控豬ETV5基因miRNA的篩選鑒定

李虹儀 彭國(guó)良 肖正中 張茂

（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，韶關(guān) 512005）

ETV5（E-twenty-six variant gene 5）是 一 種 轉(zhuǎn)錄因子，屬于多瘤病毒增強(qiáng)子激活劑PEA3（poly- omavirus enhancer activator 3，PEA3）亞族，是ETS（E-twenty-six，ETS）家族中的一部分［1］，ETS因子在哺乳動(dòng)物發(fā)育和成年組織中廣泛表達(dá)，可以作為多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子，調(diào)節(jié)生物過(guò)程如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，ETS因子在多種內(nèi)分泌系統(tǒng)中都很活躍，包括垂體、甲狀腺、乳腺、前列腺、卵巢、睪丸和胰腺等［2］。

ETV5基因最早發(fā)現(xiàn)在小鼠睪丸支持細(xì)胞（sertoii cells）中表達(dá)，對(duì)精原干細(xì)胞的自我更新及維持起著重要的調(diào)節(jié)作用，靶向破壞ETV5基因的小鼠在沒有阻斷精原干細(xì)胞正常分化的情況下失去了精原干細(xì)胞自我更新的維持能力，從而發(fā)生進(jìn)行性生殖細(xì)胞消耗和僅支持細(xì)胞綜合征［3-4］。后來(lái)，研究人員對(duì)小鼠ETV5基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，ETV5敲除雄性小鼠生長(zhǎng)及睪丸發(fā)育異常，小鼠經(jīng)歷第一波生精時(shí)精原干細(xì)胞開始消失至最終只有支持細(xì)胞，ETV5敲除小鼠雖然有產(chǎn)生精子但是不育［5］。將ETV5敲除小鼠的生殖細(xì)胞植入W/Wv小鼠睪丸中不能生成精子，從而說(shuō)明ETV5對(duì)精原干細(xì)胞的存活和數(shù)量穩(wěn)定具有重要作用［6］。將ETV5敲除小鼠作為受體移植入正常小鼠生殖細(xì)胞沒有得到后代，同時(shí)還意外的發(fā)現(xiàn)ETV5敲除小鼠血睪屏障發(fā)生異常，敲除ETV5后可能改變了睪丸免疫特權(quán)。ETV5的敲除在雌性小鼠上面也同樣導(dǎo)致不育，雌性小鼠在敲除ETV5后出生兩周齡時(shí)卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)缺陷，成年雌性小鼠即使在促性腺激素治療后排卵也減少并且出現(xiàn)對(duì)交配不感興趣的現(xiàn)象［7］。在ETV5突變的小鼠研究中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子ETV5的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致小鼠不育、胚胎和圍產(chǎn)期死亡增加、出生后生長(zhǎng)受限、腎臟不對(duì)稱和多指［8］。以上研究表明，ETV5是維持小鼠精原干細(xì)胞自我更新和增殖能力的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)小鼠的生殖具有非常重要的作用。

miRNAs（microRNAs）是一類內(nèi)源性的短片段非編碼RNA，調(diào)控體內(nèi)多數(shù)基因，廣泛參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育，比如細(xì)胞增殖、凋亡和分化，系統(tǒng)的免疫，疾病的發(fā)生、發(fā)展等［9］。ETV5基因?qū)π∈缶杉?xì)胞及精子的生成具有重要調(diào)控作用，在生殖方面發(fā)揮重要作用，然而對(duì)調(diào)控ETV5基因的miRNA還了解很少，特別是在農(nóng)業(yè)動(dòng)物豬上面。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)調(diào)控豬ETV5的miRNA，構(gòu)建豬ETV5基因UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)行篩選，將篩選出來(lái)的miRNA轉(zhuǎn)染豬睪丸支持細(xì)胞及胎兒成纖維細(xì)胞，檢測(cè)ETV5基因表達(dá)情況，驗(yàn)證篩選出來(lái)miRNA對(duì)ETV5基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR酶PrimeSTAR MAX DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xba I、連接試劑盒In-Fusion? HD Cloning Kit、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自TaKaRa公司，膠回收試劑盒Gel Extraction Kit、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo-free Plasmid Mini Kit I、細(xì)胞RNA提取試劑盒Total RNA Kit I購(gòu)自O(shè)mega公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 Reagent、定量試劑PowerUpTMSYBRTMGreen 預(yù)混液購(gòu)自Life Technologies，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，miRNA的合成由蘇州吉瑪基因合成，引物由深圳華大基因合成。

293細(xì)胞、ETV5基因敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞、豬睪丸支持細(xì)胞、豬DNA、雙熒光素酶報(bào)告基因載體（pmirGLO載體）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)控ETV5基因miRNA的信息學(xué)預(yù)測(cè) 使用在線分析軟件TagetScan 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、miRanda（http：//www.microrna.org/）預(yù)測(cè)調(diào)控ETV5的miRNA，同時(shí)將結(jié)合位點(diǎn)的序列與豬序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 參考GenBank中豬ETV5基因（NM_001243025.1）序列設(shè)計(jì)引物ETUF：5'-tgtttaaacgagctcgctagcCTACACTGAGGGCTTTGCTTACTAAG-3'；ETUR1：5'-tgcctgcaggtcgactctagaTTTTTTAAACTGAAAGCAAACTTCTTT-3'，以豬DNA為模板，用PrimeSTAR? Max DNA Polymerase進(jìn) 行 擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測(cè)序。利用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit回收目的片段。利用限制性內(nèi)切酶Nhe I、 Xba I對(duì)質(zhì)粒pmirGLO進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行回收 目 的 片 段。利 用In-Fusion? HD Cloning Kit對(duì)擴(kuò)增片段UTR和經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒pmirGLO進(jìn)行連接構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，連接結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)化、挑菌及菌液PCR檢測(cè)，檢測(cè)引物如下：ETF：5'-CTACACTGAGGGCTTTGCTTA-3'，ETR1：5'-AAACTGAAAGCAAACTTCTT-3'，將PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌液送華大基因測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 293細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇293細(xì)胞系于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒與合成的miRNA mimics共同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，利用LipofectamineTM3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以亂序序列作為陰性對(duì)照（NC），轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測(cè) 收集的細(xì)胞吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后用 PBS洗滌兩次，加入100 μL報(bào)告基因細(xì)胞裂解液，充分裂解后4℃，12 000 r/min 離心3 min后取上清液，取50 μL上清液于96孔板（白板）中，加入100 μL螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑，于多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性。檢測(cè)完再往各孔里加入50 μL含有100 μL海腎螢光素酶檢測(cè)工作液，再次于多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)海腎熒光素酶的活性。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè) 復(fù)蘇ETV5敲除細(xì)胞系，39℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)后提取細(xì)胞總RNA，用miR-19特異頸環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR檢測(cè)用miR-19 的表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參。引物使用如下：miR-19特異頸環(huán)引物：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGTTTT-3'，miR-19R：5'-GGCTGTGCAAATCTATGC-3'，miR-19F：5'-AGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。

復(fù)蘇豬胎兒成纖維細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞，利用LipofectamineTM3000分別將miR-19 mimics、inhibitor和對(duì)照序列（NC）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，48 h后熒光定量PCR檢測(cè)ETV5的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。引物如下，ETVF2：5'-GCCAGCCATGAACTACGACA-3'，ETVR2：5'-CACTCGGACTCGGCTTTCAG-3'。

檢測(cè)結(jié)果根據(jù)以下公式計(jì)算出目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的比值來(lái)反應(yīng)各檢測(cè)基因的表達(dá)豐度： 2-ΔCt＝ 2-（Ct 目的基因 -Ct 內(nèi)參基因）。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以 P＜0.05作為差異顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，用GraphPad Prism6完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及圖表制作。

2 結(jié)果

2.1 信息學(xué)預(yù)測(cè)作用于ETV5基因的miRNA

分別用在線分析軟件TagetScan 7.1和miRanda 預(yù)測(cè)調(diào)控ETV5的miRNA，結(jié)果顯示，TagetScan 7.1網(wǎng)站預(yù)測(cè)到9個(gè)miRNA，miRanda得到31個(gè)，預(yù)測(cè)得到的共同miRNA有8個(gè)，其中豬保守結(jié)合的有6個(gè)，分別為miR-19、miR-137、miR-129、miR-101、miR-219和miR-200（圖1），其中miR-19與ETV5 3'UTR有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 調(diào)控豬ETV5基因的miRNA預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of miRNA regulating porcine ETV5 gene

2.2 MiR-19通過(guò)抑制豬ETV5 3'UTR序列降低熒光素酶活性

為了檢測(cè)預(yù)測(cè)的miRNA與ETV5之間的靶關(guān)系，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的豬ETV5 3'UTR序列2 260 bp并將其連接到pmirGLO載體上，構(gòu)建pmirGLO-ETV5質(zhì)粒。將pmirGLO-ETV5質(zhì)粒分別與緊密結(jié)合的小RNA miR-19、miR-137、miR-129和miR-101共轉(zhuǎn)細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-19的細(xì)胞其熒光素酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖2）。

圖2 熒光素酶活性檢測(cè)Fig.2 Detection of luciferase activity

2.3 miR-19抑制胎兒成纖維細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞中ETV5基因的mRNA表達(dá)

在豬胎兒成纖維細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-19 mimcs、inhibitor和NC，熒光定量PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中ETV5的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-19 mimcs 可顯著降低豬胎兒成纖維細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞中ETV5的mRNA表達(dá)，miR-19 inhibitor 則結(jié)果相反（P＜0.01，圖3-4）。

圖3 MiR-19調(diào)控胎兒成纖維細(xì)胞中ETV5 mRNA的表達(dá)Fig.3 MIR-19 regulating the mRNA expression of ETV5 in the fetal fibroblasts

2.4 細(xì)胞ETV5基因的敲除升高miR-19的表達(dá)

利用CRSPR/Cas9技術(shù)敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞中的ETV5基因，檢測(cè)敲除細(xì)胞中miR-19的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-19的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，圖5）。

圖4 MiR-19調(diào)控睪丸支持細(xì)胞中ETV5 mRNA的表達(dá)Fig.4 MIR-19 regulating the mRNA expression of ETV5 in the Sertoli cells

圖5 miR-19在ETV5敲除細(xì)胞中的表達(dá)量Fig.5 Expression of miR-19 in the ETV5 knockout cells

3 討論

雄性個(gè)體在青春期后能夠源源不斷地產(chǎn)生精子以繁殖后代，這一過(guò)程的持續(xù)發(fā)生有賴于睪丸中的精原干細(xì)胞，精原干細(xì)胞的自我更新及分化能力對(duì)于成年雄性生殖力的維持起著決定性作用，相關(guān)研究也因此成為生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［10］。在小鼠上面的研究表明，ETV5的缺失造成精原干細(xì)胞漸行性消亡最終導(dǎo)致枯竭，進(jìn)而不能正常生精及不育，同時(shí)ETV5還能激活與精原干細(xì)胞自我更新相關(guān)的基因如Bcl6b、Lhx1等促進(jìn)精原干細(xì)胞的更新［11］。此外ETV5還能直接調(diào)控對(duì)小鼠精原干細(xì)胞體外維持非常重要的miRNA21［12］，而ETV5基因在哺乳動(dòng)物性別發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)受到SOX9基因的調(diào)控［1］。綜上所述，ETV5基因在生殖方面的功能非常重要，既能調(diào)節(jié)其它基因及miRNA的表達(dá)，也在特定時(shí)期受到上游基因的調(diào)節(jié)。miRNAs在各組織系統(tǒng)的基因表達(dá)控制中起著關(guān)鍵作用，其功能包括調(diào)節(jié)自我更新、細(xì)胞分化、增殖和凋亡［12］，在精原干細(xì)胞方面有很多的miRNA參與精原干細(xì)胞的更新和分化，如在小鼠上面發(fā)現(xiàn)的有miRNA-125a［13］、miRNA-20和miRNA-106a［14］、miRNA-224［15］、miRNA-322［16］、miRNA-486-5p［17］等，在 人 上 面 有miRNA-31-5p［18］、miRNA-663a［19］等。然而，豬上面關(guān)于ETV5的報(bào)道較少，特別是調(diào)控ETV5基因的miRNA鮮有報(bào)道。本研究初步篩選調(diào)控豬ETV5基因的miRNA，為研究調(diào)控豬ETV5基因的miRNA提供參考。

利用在線軟件對(duì)調(diào)控豬ETV5基因的可能miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同軟件出來(lái)的結(jié)果相差較大，miRanda得到的數(shù)量較多，篩選工作量也較大，采用韋恩圖將不同軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行合并，可在一定程度上縮小篩選范圍。而從熒光素酶檢測(cè)結(jié)果上看，僅有miR-19顯著降低熒光素酶的活性，miR-19以8mer方式與靶序列進(jìn)行結(jié)合，且在ETV5 3'端有兩個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)，由此可見，在預(yù)測(cè)時(shí)有意識(shí)地挑選更保守結(jié)合方式且多結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，可在一定程度上提高篩選的成功率。

ETV5基因在小鼠睪丸、腦、腎、肺等組織中表達(dá)并發(fā)揮著不同的功能，此外還對(duì)小鼠體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（mESCs）存在調(diào)控作用［20］。在醫(yī)學(xué)方面的研究中還發(fā)現(xiàn)ETV5基因在腫瘤侵襲［21］、甲狀腺癌形成［22-23］、肝臟脂肪代謝［24］及祖神經(jīng)元細(xì)胞分化［25］等方面有重要作用。在豬中，本研究前期檢測(cè)到了ETV5基因除了在睪丸組織中表達(dá)外，還在腦、心臟、肝臟、腎臟及肺中表達(dá)。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到ETV5基因3'UTR片段并構(gòu)建pmirGLO-ETV5質(zhì)粒，在初步預(yù)測(cè)miRNA中選擇較為保守結(jié)合的miR-19、miR-137、miR-129、miR-101分別與pmirGLO-ETV5質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4條miRNA中只有miR-19轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低，表明miR-19可能對(duì)ETV5基因有調(diào)控作用。合成miR-19模擬物分別轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞，定量檢測(cè)ETV5的mRNA表達(dá)量發(fā)現(xiàn)ETV5基因的表達(dá)顯著降低，而轉(zhuǎn)染抑制物時(shí)ETV5基因的表達(dá)顯著提高，表明miR-19能夠下調(diào)ETV5 mRNA的表達(dá)，而抑制miR-19則能夠提高ETV5的基因表達(dá)量。

豬胎兒成纖維細(xì)胞是一種體細(xì)胞，通常作為供體用于體細(xì)胞核移植制備克隆豬，同時(shí)基因編輯豬的制備中也常選用豬胎兒成纖維細(xì)胞用于篩選出基因編輯細(xì)胞系進(jìn)而制備基因編輯豬進(jìn)行研究。睪丸支持細(xì)胞附著于曲細(xì)精管基膜上，是唯一一種與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞，為精原干細(xì)胞提供生長(zhǎng)、發(fā)育和自我更新所需的各種細(xì)胞因子，并為精子發(fā)生提供物理支撐和穩(wěn)定微環(huán)境［26-27］。本研究選擇豬的胎兒成纖維細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞來(lái)研究ETV5基因與具有調(diào)控作用miRNA具有較好代表性，并且也驗(yàn)證了miR-19在這兩種細(xì)胞中對(duì)ETV5基因具有明顯調(diào)控作用。在后面試驗(yàn)中對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞的ETV5基因進(jìn)行敲除后檢測(cè)miR-19的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-19相對(duì)表達(dá)量顯著升高，再次驗(yàn)證了miR-19與ETV5基因之間的調(diào)控關(guān)系。

4 結(jié)論

miR-19對(duì)豬ETV5基因的表達(dá)有調(diào)控作用，為進(jìn)一步開展miRNA調(diào)控豬ETV5基因影響豬生殖方面的研究提供參考。