R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PnMYB1調(diào)控三七皂苷生物合成

雷君 陳勤 鄧兵 張金渝 劉迪秋 崔秀明 葛鋒

（1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2. 云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500； 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650205）

三 七［Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen］為五加科人參屬藥用植物，作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥已有400多年的使用歷史，其根、莖、花和剪口均可入藥。三七具有止血、活血、化瘀、防治心血管疾病等藥理作用［1］，其主要活性成分為三萜皂苷，通過(guò)甲羥戊酸途徑合成［2］。目前，已從三七中分離出70多種三萜皂苷，這些皂苷根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)可分為原人參二醇型和原人參三醇型。與同屬的人參、西洋參不同，三七中主要含有的單體皂苷為人參皂苷R1、Re、Rb1、Rd和Rg1［3］。雖然三七皂苷具有很高的藥用價(jià)值，但由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難用化學(xué)方法合成。因此，研究三七皂苷的生物合成規(guī)律對(duì)利用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)三七皂苷具有重要意義。

基因轉(zhuǎn)錄的完成是通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子（DNA結(jié)合蛋白）來(lái)抑制或激活來(lái)共同實(shí)現(xiàn)［4］。轉(zhuǎn)錄因子包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是DNA結(jié)合域和蛋白質(zhì)激活或抑制結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的抑制或激活過(guò)程，基因表達(dá)功能的實(shí)現(xiàn)，植物次生代謝物的生物合成由轉(zhuǎn)錄因子 調(diào)控［5-6］。

根據(jù)結(jié)構(gòu)域不同，真核生物中含有多生物學(xué)功能的MYB類別，MYB屬于多類別轉(zhuǎn)錄因子中的一種，MYB結(jié)構(gòu)域都存在于MYB類轉(zhuǎn)錄因子中。根據(jù)數(shù)量和重復(fù)結(jié)構(gòu)，MYB可分為四類，分別為：4R-MYB亞類、R1R2R3-MYB亞類、R2R3-MYB亞類、MYB-related亞類，在植物體中普遍存在的是R2R3-MYB亞類［7］。隨著對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子研究的深入，越來(lái)越多的報(bào)道表明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物體內(nèi)萜類化合物的合成具有調(diào)控作用。如在云杉中過(guò)表達(dá)MYB類PtMYB14轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著提高云杉中萜類物質(zhì)的產(chǎn)量［8］；在長(zhǎng)春花中過(guò)表達(dá)CrBPF1轉(zhuǎn)錄因子基因能夠提高長(zhǎng)春花中吲哚生物堿和萜類物質(zhì)生物合成的相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)控吲哚生物堿和萜類物質(zhì)的生物合成［9］；虎杖的PcMYB1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物木質(zhì)素合成具有負(fù)調(diào)控作用［10］；燈盞花的EbMYB6轉(zhuǎn)錄因子對(duì)羥基肉桂酸代謝有一定的抑制作用［11］。這些研究表明，植物中的分MYB類轉(zhuǎn)錄因子可能廣泛參與萜類次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控。

為了探討三七中MYB轉(zhuǎn)錄因子是否能夠調(diào)控三萜皂苷的生物合成，本研究根據(jù)前期從三七中篩選獲得與茉莉酸甲酯應(yīng)答元件JERE cis-element響應(yīng)的PnMYB1基因片段，利用RACE技術(shù)獲得PnMYB1基因全長(zhǎng)；構(gòu)建過(guò)表達(dá)PnMYB1三七細(xì)胞系，研究PnMYB1與三七皂苷生物合成途徑中重要關(guān)鍵酶基因的互作與表達(dá)調(diào)控，揭示PnMYB1對(duì)三七皂苷生物合成的調(diào)控機(jī)制，為建立高效調(diào)控三七皂苷生物合成策略提供了理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以本實(shí)驗(yàn)室保存的三七細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物科技有限公司（中國(guó)上海）；pGEM-T克隆載體購(gòu)自Promega公司；農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300S載體為本實(shí)驗(yàn)室所保存。T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；三七總皂苷、人參皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re和人參皂苷Rd標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)家藥物和生物制品控制研究所（中國(guó)北京）；所使用的所有其他化學(xué)品均購(gòu)自生工生物科技有限公司（中國(guó)上海）。膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自生工生物科技有限公司（中國(guó)上海）；NucleoTrap? mRNA Mini kits和PCR Clean-Up Kit購(gòu)于 德 國(guó)MACHEREY-NAGEL公 司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM Reverse Transcriptase System和GoTaq? qPCR Master Mix購(gòu)自Promega公司；Universal GenomeWalker 2.0、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up購(gòu)自TaKaRa。

主要儀器為：高效液相色譜儀（安捷倫1260），色譜柱GRACE VisionHT C18HL（250 mm×4.6 mm，5 μm）。本實(shí)驗(yàn)所用引物均委托上海生工生物工程有限公司合成，加入適量的 Nuclease-free ddH2O溶解引物，使得引物濃度為10 μmol/L。具體引物序列見(jiàn)表1、表2。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

表2 啟動(dòng)子克隆的引物Table 2 Primers used for promoter clone

1.2 方法

1.2.1 RACE cDNA文庫(kù)的制備及PnMYB1全長(zhǎng)cDNA克隆 本研究采用改良的異硫氰酸胍法提取三七愈傷組織總RNA［12-13］。使用試劑盒Nucle-oTrap? mRNA Mini kits從三七總RNA中純化分離獲得三七poly（A）RNA。采用試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit制備獲得5'RACE-Ready cDNA。利用酵母單雜交系統(tǒng)獲得了PnMYB1基因的3'端 序 列［14］。以RACE-Ready cDNA為 模 板，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，獲得了PnMYB1基因的5'端序列。利用上述克隆的末端序列設(shè)計(jì)引物，獲得PnMYB1的全長(zhǎng)cDNA。用特異性引物PnMYB1-BamH I-F（5'-GGATCCATGGGGAGG AGCCCTTGCTCTGC-3'）和PnMYB1-EcoR I-R（5'-GAA TTCTCAAGACAGCCAATCTCCTCCGGAC-3'）PCR擴(kuò)增PnMYB1。將PnMYB1全長(zhǎng)cDNA的PCR產(chǎn)物克隆連接到pGEM-T載體中進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 序列特征與系統(tǒng)發(fā)育分析 氨基酸和核苷酸序列比較-BLAST；氨基酸序列相似性分析-DNAMAN；構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)-MEGA 6.0。

1.2.3 PnMYB1植物表達(dá)載體的構(gòu)建及植物轉(zhuǎn)化 重組載體pGEM-T-PnMYB1。pCAMBIA1300S雙酶切反應(yīng)使用到EcoR I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。連接這兩個(gè)DNA片段，得到植物表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1300S-PnMYB1。

利用凍融法在根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入重組載體pCAMBIA1300S-PnMYB1［15］。將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于28℃搖床，200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，并涂布于LB固體培養(yǎng)基上（其中添加卡那霉素和利福平，終濃度分別為50 mg/L的和25 mg/L），于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。篩選出的陽(yáng)性單菌落接種于含有上述相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600至0.6-0.8，離心收集菌體。然后用MGL液體培養(yǎng)基（其中添加乙酰丁香酮，終濃度為40 mg/L）重懸菌體，振蕩培養(yǎng)至OD600至0.6-0.8，接入野生型三七細(xì)胞，使三七細(xì)胞完全浸沒(méi)于菌液中，于25℃搖床，120 r/min共培養(yǎng)20 min后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到的MS固體培養(yǎng)基中（其培養(yǎng)基中添加40 mg/L乙酰丁香酮），25℃下培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)入含400 mg/L頭孢霉素的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d。除菌培養(yǎng)后，將三七愈傷細(xì)胞轉(zhuǎn)接至三七篩選培養(yǎng)基（其中添加卡那霉素和潮霉素B，終濃度分別為50 mg/L的和25 mg/L），約45 d左右繼代一次，經(jīng)過(guò)4-5次的篩選，可獲得過(guò)表達(dá)PnMYB1基因三七細(xì)胞系。

1.2.4 利用PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法從愈傷組織中提取基因組DNA，用PCR方法鑒定hpt II（正向引物為5'-GAAGTGCTTGACATTGGGGA AT-3'，反向引物為5'-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3'）基因片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸90 s，16℃保溫。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送測(cè)序。比對(duì)測(cè)序結(jié)果和載體上的抗性基因的序列。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè) 提取過(guò)表達(dá)PnMYB1基因三七細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)PnMYB1基因的三七細(xì)胞株系總RNA，利用試劑盒GoScriptTMReverse Transcriptase System 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA作為qRT-PCR的模板，使用表1中引物用以檢測(cè)鯊烯合成酶（PnSS）、鯊烯環(huán)氧酶（PnSE）、達(dá)瑪烯二醇合成酶（PnDS）、環(huán)阿屯醇合成酶（PnCAS）和PnMYB1的基因表達(dá)水平，選取GADPH作為內(nèi)參基因。根據(jù)試劑盒GoTaq? qPCR Master Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，qRT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析結(jié)果［16］。

1.2.6 三萜皂苷的定量分析 收集過(guò)表達(dá)PnMYB1基因三七細(xì)胞和未轉(zhuǎn)PnMYB1基因的三七細(xì)胞，烘干至恒重，并研磨成粉末。取約0.5 g粉末加入50 mL 70%甲醇的試管中浸泡過(guò)夜，超聲處理1.5-2.0 h。離心收集上清液，揮發(fā)干溶劑。用10 mL蒸餾水溶解揮發(fā)干溶劑后的殘余物，再用10 mL水飽和正丁醇萃取3次。將萃取液收集干燥，用70%甲醇溶解至25 mL。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=35.2527x+0.21149，R2=0.9993）計(jì)算出各樣品中三七總皂苷的含量，其中x為樣品在550 nm處的吸光度，y為三七總皂苷的含量（%，W/W）。

用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)過(guò)表達(dá)PnMYB1基因和未轉(zhuǎn)PnMYB1基因三七細(xì)胞中主要單體皂苷進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件為：流動(dòng)相為乙腈（A）/水（B），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，采用乙腈（A）/水（B）進(jìn)行梯度洗脫：0-20 min，20%的A和80%的B；20-45 min，46%的A和54%的B；45-60 min，55%的A和45%的B；60-75 min，100%的A。通過(guò)將峰面積和保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較（表3），對(duì)每個(gè)單體皂苷進(jìn)行了鑒定和定量分析。

表3 五種重要單體皂苷線性回歸方程Table 3 Linear regression equations for five major monomer saponins

1.2.7 染色體步移法克隆啟動(dòng)子 采用CTAB法提取三七基因組DNA，用RNase A消化處理，得到符合染色體步移條件的三七基因組DNA。然后將DNA分成5段，分別用限制性內(nèi)切酶Dra Ⅰ、EcoR V、Pvu II和Stu Ⅰ酶切。試劑盒NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up說(shuō)明書(shū)表明：純化酶切產(chǎn)物后，利用T4 DNA連接酶將GenomeWalker Adaptors與純化產(chǎn)物進(jìn)行連接。最后，設(shè)計(jì)PnCAS、PnDS和PnSS基因的特異性引物（表2），根據(jù)試劑盒Universal GenomeWalker 2.0的使用手冊(cè)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，獲得啟動(dòng)子序列。

1.2.8 GUS活性分析 為了闡明PnMYB1能否與三七皂苷生物合成關(guān)鍵酶的基因啟動(dòng)子相互作用，將部分啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合，構(gòu)建了PBI 121-PnDSP1、PBI 121-PnCASP1、PBI 121-PnSSP1和PBI 121-PnSEP1表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，最后對(duì)煙葉中的GUS活性進(jìn)行定量分析。利用GUS終止反應(yīng)液將1 mmol/L 的4-MU溶液稀釋成50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L，500 nmol/L和1 000 nmol/L濃度梯度的4-MU溶液。然后以GUS終止反應(yīng)液為對(duì)照，利用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)光波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為455 nm的條件下測(cè)定各濃度4-MU溶液的熒光值，從而得到4-MU濃度和熒光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Protein Assay kit測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果

2.1 PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子 家族

根據(jù)酵母單雜交篩選獲得的PnMYB1基因部分3'末端序列，并通過(guò)SMART RACE策略獲得PnMYB1的cDNA。結(jié)果表明，PnMYB1基因全長(zhǎng)1 014 bp，開(kāi)放閱讀框、編碼氨基酸、分子量、等電點(diǎn)的量值分別為723 bp、240、27.36 kD、PI 8.99。與其他植物R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列比較，PnMYB1與 桉 樹(shù)EgMYB1（CAE09058.1）、玉米ZmMYB3（NP_001105949.1）、丹 參SmMYB39（KC213793）、柳枝稷PvMYB4d（AEM17351.1）有較高的相似性（圖1），表明從三七中克隆獲得的PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子基因可能屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。

圖1 氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Amino acid sequence alignment

為分析PnMYB1與其它植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)分析了PnMYB1與其它植物的17個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建了他們的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，所有轉(zhuǎn)錄因子分為四大類，分別代表MYB轉(zhuǎn)錄因子的4個(gè)亞家族：4R-MYB、R1R2R3-MYB、R2R3-MYB和MYBrelatd。PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子蛋白與R2R3-MYB類蛋白聚為一支，且其序列與胡蘿卜DcMYB5的相似性最高，進(jìn)一步說(shuō)明PnMYB1屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。已有報(bào)道表明，一些關(guān)于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝物的合成調(diào)控起關(guān)鍵作用，如胡蘿卜中DcMYB5轉(zhuǎn)錄因子可以有效調(diào)控花青素的生物合成［17］；蘋果中MdMYB12轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素和黃酮醇的合成［18］。因此，本研究獲得的PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子有可能對(duì)三七皂苷的合成具有調(diào)控作用。

圖2 PnMYB1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of PnMYB1

2.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)分析

獲得了過(guò)表達(dá)PnMYB1的轉(zhuǎn)基因三七細(xì)胞系。PnMYB1在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（T1-T6）中的表達(dá)水平高于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（WT）。其中T5細(xì)胞系中，PnMYB1的表達(dá)量增加了2倍（圖3-E）。此外，由于PnFPS、PnSE、PnDS、PnSS和PnCAS基因均為三七皂苷生物合成的關(guān)鍵酶基因，因此它們的基因表達(dá)水平的上調(diào)對(duì)三七皂苷的合成具有調(diào)控作用。與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（WT）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中PnFPS、PnDS和PnSE的表達(dá)水平顯著升高。然而，PnSS （圖3-D）和PnCAS（圖3-F）的表達(dá)水平?jīng)]有受到明顯的影響。這些結(jié)果表明，PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子在三七細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以調(diào)節(jié)與皂苷生物合成相關(guān)的一些關(guān)鍵基因的表達(dá)。

圖3 三七細(xì)胞系T1-T6的PnFPS（A）、PnDS（B）、PnSE（C）、PnSS（D）、PnMYB1（E）和PnCAS（F）基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expressions of gene PnFPS（A），PnDS（B），PnSE（C），PnSS（D），PnMYB1（E）and PnCAS（F）in the T1-T6 cell lines of P. notoginseng

2.3 PnMYB1促進(jìn)了三七皂苷的生物合成

為了確定PnMYB1在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)是否會(huì)影響三萜皂苷的生物合成，進(jìn)行了三萜皂苷的含量分析。結(jié)果表明，6株轉(zhuǎn)PnMYB1三七細(xì)胞系的總皂苷含量都得到了顯著性提高，T1、T2、T3、T4、T5和T6的皂苷含量分別為未轉(zhuǎn)基因三七細(xì)胞的1.38、1.39、1.73、1.45、1.37和1.53倍（圖4）。采用高效液相色譜法（HPLC），對(duì)轉(zhuǎn)基因三七細(xì)胞中單體皂苷R1、Rg1、Re、Rb1和Rd含量進(jìn)行測(cè)定（圖5）。PnMYB1高表達(dá)細(xì)胞系中5種單體皂苷的含量均高于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。其中T3株系中Re含量最高，高達(dá)25.3 mg/g（圖6-C）。T3細(xì)胞系中的單體皂苷R1（圖6-A）、Re（圖6-C）、Rb1（圖6-D）和 Rd（圖6-E）的含量為所有細(xì)胞株系中最高。PnMYB1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中Rg1的平均含量約為非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的1.47倍（圖4）。在本研究中，PnMYB1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中Rd含量的增加最為顯著，這表明過(guò)表達(dá)PnMYB1不僅會(huì)影響三七總皂苷的生物合成，而且會(huì)改變?nèi)咧袉误w皂苷的比例。

圖4 三七細(xì)胞系總皂苷含量Fig. 4 Content of total saponins in the cell lines of P. notoginseng

圖5 轉(zhuǎn)PnMYB1三七細(xì)胞系的HPLC分析Fig. 5 HPLC analysis of transformed PnMYB1 P. notoginseng cell line

圖6 三七細(xì)胞系T1-T6單體皂苷R1（A）、Rg1（B）、Re（C）、Rb1（D）和Rd（E）含量Fig. 6 Contents of monomer saponins R1（A），Rg1（B），Re（C），Rb1（D）and Rd（E）in T1-T6 transgenic cell lines of P. notoginseng

上述結(jié)果表明，PnMYB1在三七細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)三七皂苷的生物合成。但PnMYB1是轉(zhuǎn)錄因子基因，并不直接參與皂苷的生物合成，為了進(jìn)一步明確PnMYB1促進(jìn)皂苷合成的機(jī)制，接下來(lái)將探討PnMYB1是否通過(guò)調(diào)節(jié)直接參與皂苷生物合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)間接實(shí)現(xiàn)對(duì)皂苷合成的調(diào)控。

2.4 PnMYB1能夠與皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子相互作用

根據(jù)圖3的結(jié)果，兩個(gè)關(guān)鍵酶（PnDS和PnSE）的基因表達(dá)水平隨著PnMYB1的過(guò)表達(dá)而增加，而另外兩個(gè)基因（PnSS和PnCAS）的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。PnDS和PnSE是三萜皂苷生物合成的關(guān)鍵酶。在過(guò)表達(dá)PnMYB1的三七細(xì)胞中，三萜皂苷含量的增加可能是由于PnDS和PnSE表達(dá)水平升高所致。

本研究對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)染不同啟動(dòng)子的煙葉和不同啟動(dòng)子與PnMYB1共轉(zhuǎn)染的煙葉的熒光值進(jìn)行了分析，以定量測(cè)定GUS活性。結(jié)果表明，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染PnCAS或PnSS啟動(dòng)子的煙葉相比，共轉(zhuǎn)染PnMYB1和啟動(dòng)子的煙葉GUS活性沒(méi)有顯著變化（圖7），說(shuō)明PnMYB1不能與PnCAS和PnSS啟動(dòng)子相互作用。然而，共轉(zhuǎn)染PnMYB1和PnSE啟動(dòng)子的煙葉表現(xiàn)出比單獨(dú)轉(zhuǎn)染PnSE啟動(dòng)子的煙葉更高的GUS活性（圖7）。將PnDS啟動(dòng)子和PnMYB1共轉(zhuǎn)染煙草葉片也得到了相似的結(jié)果（圖7）。說(shuō)明 PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子可以與PnDS和PnSE的啟動(dòng)子相互作用，PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)作用于PnDS和PnSE基因的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)PnDS和PnSE基因的表達(dá)，進(jìn)而間接實(shí)現(xiàn)對(duì)三七皂苷生物合成的調(diào)控。

圖7 GUS熒光活性分析Fig. 7 GUS fluorescence activity analysis

3 討論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成和響應(yīng)非生物脅迫方面具有重要作用［19-20］。目前已從非洲菊［21］、葡萄［22］、紅掌［23］等不同物種中分離和鑒定了多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子。本研究從三七中克隆得到PnMYB1，對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析表明，PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子中含有兩個(gè)保守的MYBDNA-Binding結(jié)構(gòu)域，表明PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子可能屬于R2R3-MYB家族。PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子與來(lái)自其他不同物種的R2R3-MYB家族的多重序列比對(duì)表明三七R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域可能參與次生代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)［24］。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，PnMYB1與胡蘿卜中的DcMYB5具有高度相似性，與R2R3-MYB類蛋白聚為一支。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明PnMYB1屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。

有報(bào)道稱可通過(guò)人參皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因在人參屬植物中過(guò)表達(dá)，從而增加人參皂苷的積累，例如，過(guò)表達(dá)鯊烯合成酶可以增加人參中人參皂苷和植物甾醇的含量［25］。我們的前期研究證實(shí)，在三七中同時(shí)過(guò)表達(dá)3-羥基-3-甲基-戊二?；o酶A還原酶（PnHMGR）和PnSS基因或過(guò)表達(dá)法尼基焦磷酸合成酶（PnFPS）基因可以促進(jìn)三萜皂苷的生物合成［26］。這些已有報(bào)道大多通過(guò)直接調(diào)控合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)次生代謝過(guò)程。近年來(lái)，隨著人們對(duì)次生代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，基于轉(zhuǎn)錄因子的代謝工程已成為提高目標(biāo)代謝物合成量的有效方法。本研究成功地揭示了PnMYB1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)三七皂苷生物合成的調(diào)控作用。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子通常作用于功能相關(guān)的幾個(gè)基因，以此調(diào)節(jié)所涉及代謝途徑的多個(gè)步驟［27］。轉(zhuǎn)錄因子具有對(duì)次生代謝物生物合成途徑“多點(diǎn)調(diào)控”的優(yōu)勢(shì)，比直接調(diào)控單個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)更加有效，同時(shí)避免了導(dǎo)入多個(gè)關(guān)鍵酶基因可能導(dǎo)致細(xì)胞組成型致死的后果，這意味著轉(zhuǎn)錄因子可以更高效地控制代謝途徑。PnDS、PnSS和PnSE是三七皂苷生物合成的的關(guān)鍵酶基因；PnCAS是植物甾醇生物合成的關(guān)鍵酶基因，與PnDS具有共享前體2，3-氧化鯊烯，因此PnCAS可能成為間接參與調(diào)節(jié)三七皂苷生物合成的關(guān)鍵基因。在本研究中，隨著PnMYB1基因的過(guò)表達(dá)，PnFPS、PnDS、PnSE的表達(dá)水平顯著升高，而PnSS和PnCAS的表達(dá)水平幾乎不變，關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的提高促進(jìn)了皂苷的生物合成。三七中的主要單體皂苷具有重要的藥理活性，如降血糖活性（Rg1）、抗氧化活性（Re）［28］、治療心腦血管疾?。≧d）、抗腫瘤活性（Rg3）和神經(jīng)保護(hù)活性（Rb1）［29-30］。本研究表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中5種主要單體皂苷（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的含量均有提高，但增加的程度各不相同。目前，我們已知PnMYB1可以通過(guò)調(diào)控三七皂苷骨架形成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)來(lái)影響皂苷的合成，在三萜骨架形成后，經(jīng)不同種類的三萜皂苷骨架修飾酶（細(xì)胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶）進(jìn)行骨架修飾，合成原人參二醇型和原人參三醇型單體皂苷，包括R1、Rg1、Re、Rb1和Rd等。由于PnMYB1過(guò)表達(dá)后，各種單體皂苷的增加量明顯不同，PnMYB1很可能對(duì)皂苷骨架修飾酶基因的表達(dá)也有一定調(diào)控作用，但由于細(xì)胞色素P450和糖基轉(zhuǎn)移酶屬超基因家族［31］，數(shù)量眾多，PnMYB1調(diào)控皂苷骨架修飾酶基因的研究有一定難度。下一步，我們將重點(diǎn)關(guān)注轉(zhuǎn)錄因子對(duì)三七皂苷骨架修飾相關(guān)的細(xì)胞色素P450和糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)影響。

4 結(jié)論

本研究揭示了R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子PnMYB1對(duì)三七皂苷生物合成的調(diào)控作用。通過(guò)PnMYB1基因在三七細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了三七細(xì)胞中三七皂苷的生物合成，并進(jìn)一步闡明PnMYB1通過(guò)與皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子相互作用，提高皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)三七皂苷的合成。