白術(shù)內(nèi)生真菌AM569對3種鐮刀菌的拮抗作用及其ITS分子鑒定

吳啟婷， 任航潔， 秦曄， 徐丹， 王雪怡， 秦路平， 朱波

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

藥用白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，性溫、味苦，入脾、胃經(jīng)，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效，臨床多用于脾虛食少、痰飲眩悸、腹脹泄瀉、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等癥狀[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)具有保肝、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、治療便秘、潰瘍性急腸炎、提高免疫功能、增強(qiáng)脂代謝，抗炎抗腫瘤、降血糖等藥理活性[3]。

內(nèi)生真菌是指在生活史的某一個(gè)階段能侵染并定殖在健康植物組織內(nèi)部，且不會(huì)引起宿主植物明顯病癥的一類真菌[4]。近年來研究表明，幾乎所有的植物體內(nèi)都存在著內(nèi)生真菌，植物內(nèi)生真菌與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，互惠共生，在植物生長發(fā)育、抗逆脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[5-6]。研究表明，部分植物內(nèi)生真菌對植物病原菌具有拮抗作用。周春元等[7]從健康人參葉片中分離得到的一株優(yōu)勢內(nèi)生真菌FS-01(球毛殼菌Chaetomiumglobosum)，其對人參黑斑病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。楊濤等[8]從華重樓種子中分離到了一株內(nèi)生真菌聚多曲霉jdqmzz-1(Aspergillussydowii)，其對根腐病病原菌尖孢鐮刀菌、軟腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌具有較好的拮抗作用。

根腐病是白術(shù)生產(chǎn)栽培中主要的土傳性病害之一，危害嚴(yán)重，是白術(shù)生產(chǎn)種植鏈中亟待解決的問題。白術(shù)根腐病病原菌為復(fù)合性病原菌，主要為鐮刀菌屬真菌，包括尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和半裸鐮刀菌(Fusariumincarnatum)等[9]。目前，栽培管理中白術(shù)根腐病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治，易導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及病原菌耐藥性等問題[10]。因此，本試驗(yàn)在前期分離得到的32株白術(shù)內(nèi)生真菌的基礎(chǔ)上，采用平板對峙法考察內(nèi)生真菌對3種根腐病病原菌的拮抗作用，進(jìn)一步選取活性菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物制備，考察發(fā)酵產(chǎn)物對根腐病病原菌的拮抗作用，并最后對活性菌株進(jìn)行ITS分子鑒定，以期為白術(shù)根腐病的生物防治提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

課題組前期從白術(shù)新鮮組織中分離純化得到32株內(nèi)生真菌。白術(shù)根腐病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum，F(xiàn)O)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani，F(xiàn)S)、半裸鐮刀菌(Fusariumincarnatum，F(xiàn)I)由浙江農(nóng)林大學(xué)陳杰研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 儀器與試劑

SW-CJ-2D垂直型超凈臺(中科星宇科技發(fā)展有限公司)；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋(山東博藍(lán)達(dá)機(jī)械有限公司)；B2-25型恒溫?fù)u床(上海立德泰勀科學(xué)儀器有限公司)；PN-CCS 10 L型超純水儀(美國Millipore公司)；DHG-9031A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)；FA2004型電子分析天平(上海恒平精密電子儀器有限公司)；TC1000-S型PCR儀(上海藝斯高貿(mào)易有限公司)；HC-1016/1014型高速離心機(jī)(上海浦東天本離心機(jī)械有限公司)；海爾BCD-258WDPM型冰箱(青島海爾股份有限公司)；DYCZ-25D型電泳儀(南京金斯瑞生物科技有限公司)；ZF-268型凝膠成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)；FYL-YS真菌培養(yǎng)箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基(1 L)組成為：土豆200 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g、青霉素鈉50 mg、純水1 000 mL。PDB液體培養(yǎng)基(1 L)組成為：土豆200 g、葡萄糖20 g、青霉素鈉50 mg、純水1 000 mL。其余試劑包括NaClO溶液，乙醇，葡萄糖，DNATaq酶，脫氧核糖三磷酸(dNTP)，MgCl2，10×PCR反應(yīng)緩沖液等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌與內(nèi)生真菌的平板對峙

采用平板對峙法考察32株內(nèi)生真菌對3種白術(shù)根腐病病原菌(FO，F(xiàn)S，F(xiàn)I)的拮抗活性。在PDA平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌塊，以120°為夾角，在距病原菌菌株20 mm的3個(gè)直線方向的等距位置接種直徑為5 mm的內(nèi)生真菌菌塊，以不接種內(nèi)生真菌的病原菌平板為空白對照，待對照組病原菌長滿平板后，測量各組病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率=(對照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑)/對照組病原菌菌落直徑×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物的制備

挑取AM569菌株單菌落接種于馬鈴薯葡萄糖水(PDB)液體培養(yǎng)基中，在26 ℃、180 r·min-1恒溫條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)8 d。取發(fā)酵液抽濾，將濾液以乙酸乙酯∶濾液1∶1的比例萃取3次，旋蒸至浸膏狀。同時(shí)，將菌絲放置于50 ℃烘箱中烘至恒重，研磨成粉末，以甲醇(mL)∶菌絲粉末(g)20∶1的比例超聲提取1 h，抽濾得菌絲甲醇提取液。將菌絲甲醇提取液與發(fā)酵濾液浸膏混合，適量甲醇超聲溶解，旋蒸至浸膏狀，加入適量二甲基亞砜(DMSO)助溶，用甲醇定容至10 mL，即得AM569發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.3 AM569發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測

取AM569浸膏加入PDA固體培養(yǎng)基中(濃度為10 mg·mL-1)，在平板中央接種直徑為5 mm的3種病原菌菌株，設(shè)10 mL無菌水為陰性對照組，多菌靈500倍液為陽性對照組，5 mL DMSO+5 mL甲醇為陽性溶劑對照組，計(jì)算抑菌率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 AM569的ITS分子鑒定

使用真菌基因組DNA提取試劑盒，以無菌水沖洗3次菌絲體，進(jìn)行冷凍干燥，提取AM569的DNA[11]。采用通用引物ITS4(5′-GGAAGTAA AAGTCGTAAGG-3′)與ITS5(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到的序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，并進(jìn)行BLAST比對，用于系統(tǒng)發(fā)育分析[12]，使用Mega7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[13]，明確AM569的系統(tǒng)分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌與拮抗菌的對峙結(jié)果

在32株白術(shù)內(nèi)生真菌中，對FO、FS、FI病原菌有抑制作用的內(nèi)生真菌分別有9株、11株、21株，占比分別為28.1%、34.4%、65.6%；共26株內(nèi)生真菌至少對一種白術(shù)根腐病病原菌具有抑制作用，占總數(shù)的81.2%。對3種病原菌均有抑制作用的內(nèi)生真菌共3株，為AM171、AM262和AM569；其中，AM569綜合抑菌效果最好，對FO、FS、FI抑菌率分別為74.3%、77.5%和70.4%(表1，圖1)。

2.2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測

AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術(shù)根腐病病原菌FO、FS、FI的抑菌率如表2所示。AM569、多菌靈對病原菌FO、FS的抑菌率都是100.00%，與無菌水對照組均有顯著性差異；溶劑DMSO+甲醇組對FO、FS組抑菌率分別為31.76%和68.24%，與AM569組、無菌水組均有顯著差異。AM569對病原菌FI的抑菌率為100.00%，多菌靈對病原菌FI的抑菌率為23.53%，溶劑DMSO+甲醇組對FI的抑菌率為8.82%，與AM569組、無菌水組均有顯著性差異(表2)。綜上所述，AM569發(fā)酵產(chǎn)物對FO、FS、FI均具有顯著的抑菌性(圖2)。DMSO+甲醇溶劑對FS具有較強(qiáng)的抑菌作用，在后續(xù)試驗(yàn)中，針對FS應(yīng)考慮乙醇等為提取溶劑，以減少溶劑對試驗(yàn)結(jié)果的干擾。

表1 對FO、FS、FI 3種病原菌的抑菌效果

2.3 內(nèi)生真菌AM569的分子鑒定

將AM569序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，下載與DNA序列相似的14個(gè)序列作為參考菌株序列，再選擇Ditopellasp.(EU683067)作為外群，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[14]。結(jié)果顯示，AM569與Phomopsisasparagi(KX866925)、Phomopsiseucommii(AY601921)聚在一起，形成了一個(gè)支持強(qiáng)度為100%的末端分支(圖3)，所以將AM569鑒定為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.)真菌。

圖1 AM06、AM569對3種白術(shù)根腐病病原菌的平板抑制作用

表2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術(shù)根腐病病原菌的抑菌活性

圖2 AM569發(fā)酵產(chǎn)物對3種鐮刀菌FO、FS、FI的平板抑制效果

圖3 基于ITS序列的白術(shù)內(nèi)生真菌AM569系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)從32株白術(shù)內(nèi)生真菌中篩選得到一株內(nèi)生真菌AM569，其發(fā)酵產(chǎn)物對3種白術(shù)根腐病病原菌(Fusariumoxysporum，F(xiàn)O；Fusariumsolani，F(xiàn)S；Fusariumincarnatum，F(xiàn)I)具有顯著的抑制作用。經(jīng)ITS分子鑒定，AM56為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)真菌，該菌株已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.21947。

近年來已報(bào)道許多具有拮抗病原菌作用的內(nèi)生真菌，如藍(lán)莓健康組織中分離純化的枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)內(nèi)生真菌BB01可抑制4種藍(lán)莓病害菌生長[15]，從滇重樓塊莖中分離的8株內(nèi)生真菌對植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)生真菌對白術(shù)根腐病致病菌有顯著的抑菌性，可進(jìn)一步研究開發(fā)微生物農(nóng)藥，利用生物防治手段科學(xué)有效地防控白術(shù)根腐病，提高白術(shù)藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物往往具有較好的抗病原菌作用，如來源于核桃樹根部的一株內(nèi)生真菌G3(Fusariumcamptoceras)，其發(fā)酵產(chǎn)物對蘋果腐爛病原菌、水稻紋枯病原菌、核桃炭疽病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性[17]。苦參內(nèi)生真菌BS001(Aspergilluterreus)對黃瓜枯萎病菌具有顯著的抑菌效果，BS001菌株發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)能抑制黃瓜枯萎病菌絲的生長，同時(shí)抑制孢子萌發(fā)，對黃瓜枯萎病病原菌合成梭甲基纖維素酶有抑制作用，并且可以使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，從而能很好地抑制黃瓜枯萎病[18]。溫郁金內(nèi)生真菌ChaetomiumglobosumL18對玉米大斑病菌、禾谷鐮孢菌等多種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，抑菌譜較廣泛，可以通過侵入、穿透、纏繞等多種方式寄生于病原真菌菌絲，通過酶解作用破壞病原真菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致病原真菌死亡[19]。

擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.)是半知菌亞門、腔孢綱、球殼孢目、球殼孢科(Annonaceae)的真菌，顯著特征是分生孢子呈現(xiàn)二型性及僅有無性生殖，該屬已記錄有100多個(gè)種，可寄生于70多個(gè)不同科的草本和木本植物[20]。擬莖點(diǎn)霉屬真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對許多種植物病原菌均具有良好的抑菌效果，其在防治農(nóng)作物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。李芙蓉等[21]從丹參中分離篩選得到的擬莖點(diǎn)霉屬真菌(Phomopsissp.S4)，其發(fā)酵液提取物可以對稻瘟病菌絲的細(xì)胞壁造成破壞，從而干擾了菌絲正常的生理功能，進(jìn)而抑制了稻瘟病菌的生長。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從白術(shù)中分離得到的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌AM569對白術(shù)根腐病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，為今后生物防治白術(shù)根腐病的微生物制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。下一步擬對AM569發(fā)酵產(chǎn)物中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，以尋找目標(biāo)活性化合物，為微生物菌劑的開發(fā)與利用提供優(yōu)質(zhì)的先導(dǎo)活性物質(zhì)。