柑橘中農(nóng)藥多殘留檢測方法比對分析

賈惠言， 吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040)

隨著城鄉(xiāng)居民收入的提高和消費質量的改善，農(nóng)產(chǎn)品消費需求正從“吃飽”向“吃好、吃得安全、吃得營養(yǎng)健康”快速轉變，水果攝入量不斷增加。柑橘為蕓香科柑橘亞科柑橘屬植物，其種類繁多，包括橙、橘、柚、柑、檸檬及其雜交后代等[1]。柑橘的果肉及果皮含有豐富的活性小分子[2-3]，兼具食用與保健功能。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2019年我國柑橘產(chǎn)量為4 584.5萬t，是我國產(chǎn)量最高的水果，占到水果產(chǎn)量的16.7%[4]。

農(nóng)藥在柑橘生產(chǎn)中應用普遍，而不規(guī)范的使用導致農(nóng)藥殘留檢出及超標問題頻有發(fā)生，因此，柑橘中農(nóng)藥殘留對生態(tài)及健康的影響備受關注[5-7]。Li等[8]分析了我國2 922份柑橘樣品的農(nóng)藥殘留情況，表明有86%的樣品中存在40種不同的農(nóng)藥殘留；林濤等[9]研究表明，丙溴磷、吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、吡唑醚菌酯等農(nóng)藥在柑橘中的檢出頻次較高。因此，作為鮮食初級農(nóng)產(chǎn)品，為保障居民健康及出口貿(mào)易，對柑橘進行農(nóng)藥殘留檢測十分必要。

目前，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要采用氣相色譜法、液相色譜法及色譜質譜聯(lián)用法等，按照GB/T 20769、GB 23 200.8等標準進行檢測。色譜及色譜質譜聯(lián)用法靈敏度和準確度高，但是樣品上機檢測前的處理步驟比較冗繁，且需要昂貴的儀器設備及專業(yè)技術人員，不能滿足農(nóng)產(chǎn)品在政府監(jiān)管和生產(chǎn)經(jīng)營消費者自查等方面的需求[10-12]。我國已頒布標準的酶抑制率法受乙酰膽堿酯酶特異性的影響，檢測的農(nóng)藥種類有限，僅用于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測[13-15]，且該方法的檢出限不能滿足《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[16]中規(guī)定的果蔬中農(nóng)藥最大殘留限量要求，穩(wěn)定性和重復性也差[17]。為提高監(jiān)管與檢驗效率，亟需開發(fā)具有特異性強、靈敏度符合要求、樣品前處理步驟簡單、快速及低成本的農(nóng)藥殘留快速檢測方法?；诳乖贵w特異性識別的膠體金免疫層析技術可檢測的藥物種類更多，而且具有簡單、快速、準確和特異性強等優(yōu)點，可滿足快速分析檢測的需要，并易于在農(nóng)場和市場普及推廣，尤其適宜現(xiàn)場篩選和大量樣品的快速分析，但目前生產(chǎn)的檢測試紙種類較少[18]。

綜上所述，本研究以柑橘作為研究對象，根據(jù)寧波市農(nóng)產(chǎn)品質量檢測中心歷年對柑橘農(nóng)藥殘留的監(jiān)測結果，以挑選檢出頻次較高的4種農(nóng)藥(嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、多菌靈)及國內(nèi)市場抽檢常超標的丙溴磷作為目標物，分別制備5種農(nóng)藥的膠體金免疫層析試紙條，并組裝成柑橘5聯(lián)農(nóng)藥速測卡，最后比較超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS法)與膠體金免疫層析快速檢測法的靈敏度、精密度及實際樣品的檢測結果。

1 材料與方法

1.1 材料

嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷及多菌靈完全抗原及其單克隆抗體及顆粒直徑25 nm的膠體金溶液(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所)；上述5種農(nóng)藥標準品(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心)；乙腈(色譜純，德國 Merck公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純，杭州瓶窯和順化工試劑廠)；N-丙基乙二胺(primarysecondary amine，PSA)；填料(40～63 μm，北京安譜公司)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Aladdin公司)；0.22 μm有機濾膜(天津津滕公司)；玻璃纖維紙(中國奧斯龍公司)；硝酸纖維素膜(NC膜，美國Millipore公司)；樣品墊、PVC底板、吸水墊(上海杰一生物科技有限公司)；氯化鈉、檸檬酸三鈉、碳酸鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；柑橘(寧波市農(nóng)產(chǎn)品質量檢測中心)。

Acquity Xevo TQ-S型高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);噴膜機(杭州峰航科技有限公司);切條機(杭州峰航科技有限公司);Avanti J-E高速冷凍離心機(美國BECKMAN COULTER公司)；BlueStar B紫外-可見分光光度儀(北京萊伯泰科儀器有限公司)；Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 膠體金標記抗體

采用目測法及分光光度法確定膠體金標記抗體的最適pH和最適穩(wěn)定量，以分光光度法的測定結果為準[19-20]。將抗體置入透析袋中，在去離子水或極低濃度的鹽水(0.005 mmol·L-1NaCl，pH 7.0)中進行透析，中間換3次透析液。10 000 r·min-14 ℃離心60 min后除去抗體沉淀，取上清液備用。Foubert等[21]用K2CO3調節(jié)膠體金溶液pH，然后加入用Tris緩沖液(pH 8.5，10 mmol·L-1)稀釋的抗體反應15 min，加入牛血清白蛋白(BSA)溶液,膠體金/BSA=40/1(V∶V)，劇烈攪拌混合物10 min。將金標抗體以3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄去沉淀；將上清以12 000 r·min-1、4 ℃離心1 h，棄上清；沉淀用10-1原體積的含有1% BSA和1%蔗糖的10 mmol·L-1Tris緩沖液溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金免疫層析試紙條制備條件優(yōu)化

選擇常用的二抗?jié)舛?0.5 mg·mL-1)噴質控線，膠體金抗體稀釋比例選擇常用的1∶5，如果預實驗結果C線顏色淺，則升高濃度與比例。包被抗原用0.01 mmol·L-1pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋成3個濃度梯度(嘧菌酯、吡蟲啉、多菌靈為0.60、0.30、0.15 mg·mL-1，啶蟲脒為0.40、0.20、0.10 mg·mL-1，丙溴磷為1.00、0.50、0.25 mg·mL-1)，用三維噴點平臺噴于硝酸纖維素膜上作為檢測線；用確定的抗原濃度噴檢測線，膠體金抗體稀釋比例選擇常用的1∶5，把羊抗兔IgG稀釋成3個濃度梯度(嘧菌酯、丙溴磷、多菌靈為1.00、0.50、0.25 mg·mL-1，啶蟲脒為0.80、0.40、0.20 mg·mL-1，吡蟲啉為2.00、1.00、0.50 mg·mL-1)，用三維噴點平臺噴于同一硝酸纖維素膜的不同部位作為質控線；檢測線與質控線相距5 mm，并做上標記以防止制作試紙條時貼反方向，制作成試紙條，根據(jù)試紙條測試結果確定檢測線、質控線的最適印跡量。以抗原和二抗的最適印跡量噴于硝酸纖維素膜，取出干燥后裁成2.5 cm×4 mm大小的長條，將金標抗體按照3個不同稀釋度吸附于結合墊上制作成試紙條(嘧菌酯、丙溴磷、多菌靈為1∶2、1∶4、1∶8，啶蟲脒為1∶2、1∶5、1∶10，吡蟲啉為1∶1、1∶2、1∶5)，進行系列濃度的各農(nóng)藥標樣方陣試驗。根據(jù)顯示鮮紅色的程度，確定最適金標記抗體稀釋度。

1.2.3 膠體金免疫層析試紙條的組裝

包被抗原用碳酸鹽緩沖液(0.01 mmol·L-1CBS，pH 9.6)稀釋，羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液(0.01 mmol·L-1PBS，pH 7.4)稀釋，用三維噴點平臺噴于硝酸纖維素膜上，作為檢測線和質控線(兩線相距5 mm，并做標記，以防制作試紙條時貼反方向)，取出干燥，裁成2.5 cm×4 mm的長條備用。將金標抗體吸附于結合墊，干燥后備用。

取PVC板，先撕掉黏貼硝酸纖維素膜部位的紙條，裁取相應長度的硝酸纖維素膜黏貼在塑料板上，然后取吸附好金標抗體的玻璃纖維貼于相應部位，要壓住硝酸纖維素膜，再黏好吸水材料和未吸附金標抗體的玻璃纖維紙，將5個試紙條按農(nóng)藥名稱分別放入5聯(lián)卡槽中對應位置。

1.2.4 樣品前處理

UPLC-MS/MS法。稱取柑橘樣品(已勻漿)5.00 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20.0 mL乙腈，振蕩提取30 min后，于9 500 r·min-1離心3 min。在15 mL聚四氟乙烯離心管中準確稱量100 mg PSA和200 mg無水硫酸鎂，加入3 mL上清液，振蕩提取30 min后離心。在2 mL離心管中分取0.1%甲酸溶液0.5 mL，加入0.5 mL上清液，混合均勻，通過0.22 μm尼龍濾膜后待測。

免疫層析法。由于多菌靈、丙溴磷、吡蟲啉在水中溶解度低，因此，在0.01 mol·L-1、pH 7.4的PBS中加20%甲醇作為樣品提取液。稱取已勻漿的柑橘樣品2.00 g，以加入5 mL提取液、振蕩2 min、靜置3 min作為待測液。

1.2.5 檢測方法

UPLC-MS/MS法。(1)液相參數(shù)。流動相為0.1%甲酸溶液(A)與色譜純乙腈(B)，采用梯度洗脫條件進行分離。0～0.5 min，流動相為50%A+50%B；0.5～0.6 min，B相由50%線性升為90%，A相由90%線性降為10%；0.6～4.5 min，流動相為90% B+10%A；4.5～4.6 min，B相由90%線性降為50%，A相由10%線性升為90%；4.6～6.0 min，流動相為50% B+50%A。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18，柱溫35 ℃，樣品室溫度為15 ℃，流速為0. 3 mL·min-1，進樣體積10 μL。(2)質譜參數(shù)。電噴霧離子源，正離子掃描ESI(+)，多反應監(jiān)測(multiplereactionmonitoring，MRM)模式；電離電壓為3.00 kV，霧化溫度為500 ℃，霧化氣流速為1 000 L·h-1，源溫為150 ℃，錐孔氣流速為150 L·h-1。嘧菌酯母離子404.11m/z，子離子分別為329.07m/z和372.17 *m/z(定量離子)，駐留時間為0.025 s，錐孔電壓為20 V，碰撞電壓分別為48和22 eV；啶蟲脒母離子223.2m/z，子離子分別為90m/z和125.9 *m/z(定量離子)，駐留時間為0.025 s，錐孔電壓為26 V，碰撞電壓分別為32和20 eV；吡蟲啉母離子256.1m/z，子離子分別為175.1m/z和209.1 *m/z(定量離子)，駐留時間為0.025 s，錐孔電壓為22 V，碰撞電壓分別為18和36 eV；丙溴磷母離子374.9m/z，子離子分別為304.9m/z和346.7 *m/z(定量離子)，駐留時間為0.025 s，錐孔電壓為34 V，碰撞電壓分別為15和10 eV；多菌靈母離子192.0m/z，子離子分別為132.0m/z和159.9 *m/z(定量離子)，駐留時間為0.025 s，錐孔電壓為24 V，碰撞電壓分別為28和18 eV。

免疫層析法。將速測卡水平放置，用滴管吸取前處理液上清(盡量不吸到果肉和果皮)，在加樣孔中滴加3～4滴待測液，反應8～10 min，若T線顏色出現(xiàn)，結果為未檢出(陰性)；若T線不顯色，結果為檢出(陽性)；若T線、C線均不顯色則檢出結果無效。

1.2.6 靈敏度試驗比較

UPLC-MS/MS法。用制備好的柑橘基質空白液與0.1%甲酸溶液(5∶5，V∶V)進行稀釋，分別移取10 mg·L-1上述5種農(nóng)藥標準中間溶液，用柑橘基質空白液進行梯度稀釋，嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷均配成0.050、0.010、0.005、0.001、0.000 5 mg·L-1的系列標液，多菌靈配成0.50、0.10、0.010、0.005、0.001 mg·L-1系列標液，繪制基質標準曲線。

免疫層析法。柑橘空白樣品中加入樣品提取液，振蕩2 min，靜置3 min，取上清液作為標準品稀釋液。嘧菌酯的稀釋濃度為10.0、5.0、1.0、0.2、0.1、0.02 mg·L-1，啶蟲脒添加濃度為50.0、20.0、10.0、2.0、0.5、0.1 mg·L-1，吡蟲啉添加濃度為30.0、7.5、1.5、0.3、0.06、0.015 mg·L-1，丙溴磷添加濃度為25.0、5.0、1.0、0.2、0.04、0.01 mg·L-1，多菌靈添加濃度為30.0、7.5、1.5、0.3、0.06、0.01 mg·L-1，每組均設置空白對照。根據(jù)1.2.5進行檢測，根據(jù)實驗結果確定試紙條的最低檢出限。

1.2.7 精密度與準確度試驗比較

UPLC-MS/MS法。用添加回收試驗衡量分析方法的精密度和準確度，5種農(nóng)藥添加濃度均為0.010、0.10、1.0 mg·kg-1，每個濃度重復5次。

免疫層析法。精密度組柑橘空白樣品各取5.0 g，分別加入檢出限濃度的嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷、多菌靈標準品，重復3次，按照1.2.5所述方法進行檢測。準確度組根據(jù)《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》要求，分別對20份柑橘陽性樣品(添加不小于檢測限的農(nóng)藥標準品)和20份柑橘陰性樣品進行檢測，通過數(shù)據(jù)分析速測方法的假陰性率和假陽性率，評價其與UPLC-MS/MS的一致性。對20份柑橘抽檢樣品進行速測結果與儀器定量檢測結果比對分析，進行速測卡方法準確性數(shù)據(jù)分析。

假陰性率=假陰性數(shù)/總陽性數(shù)×100%，其中，總陽性數(shù)=陽性數(shù)+假陰性數(shù)；

假陽性率=假陽性數(shù)/總陰性數(shù)×100%，其中總陰性數(shù)=陰性數(shù)+假陽性數(shù)；

準確率=(陽性數(shù)+陰性數(shù))/總數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 膠體金標記抗體最適pH與最適穩(wěn)定量

通過目測法與分光光度法檢測膠體金標記抗體時的最適pH和最適濃度，以分光光度法得出的最適穩(wěn)定濃度計算抗體實際用量。實際抗體用量=最適抗體濃度(μg·mL-1)×抗體體積(mL)/膠體金體積(mL)×(1+20%)。表1總結了膠體金標記5種農(nóng)藥抗體的最適pH、最適抗體濃度及最適穩(wěn)定量。

2.2 試紙條檢測線、質控線及結合墊包被量優(yōu)化

對梯度稀釋用于檢測的完全抗原、二抗及金標抗體進行系列濃度的各農(nóng)藥標樣方陣試驗，根據(jù)顯示鮮紅色的程度，確定檢測線上的抗原包被量、質控線上的二抗包被量及結合墊上金標抗體的包被量。由表2可知，嘧菌酯檢測抗原包被濃度為0.30 mg·mL-1，二抗包被濃度為0.50 mg·mL-1，金標抗體稀釋比例為1∶4；啶蟲脒檢測抗原包被濃度為0.20 mg·mL-1，二抗包被濃度為0.40 mg·mL-1，金標抗體稀釋比例為1∶5；吡蟲啉檢測抗原包被濃度為0.60 mg·mL-1，二抗包被濃度為1.00 mg·mL-1，金標抗體稀釋比例為1∶2；丙溴磷檢測抗原包被濃度為0.50 mg·mL-1，二抗包被濃度為0.50 mg·mL-1，金標抗體稀釋比例為1∶4；多菌靈檢測抗原包被濃度為0.30 mg·mL-1，二抗包被濃度為0.50 mg·mL-1，金標抗體稀釋比例為1∶4。

表1 膠體金標記抗體最適pH及最適穩(wěn)定量測試結果

表2 試紙條抗原、二抗及金標抗體包被量方陣試驗結果

2.3 待檢農(nóng)藥在不同檢測方法下靈敏度對比

UPLC-MS/MS法。表3顯示，根據(jù)線性方程，嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷的濃度線性范圍在0.000 5～0.050 mg·L-1，多菌靈在0.001～0.50 mg·L-1。柑橘基質標準液濃度與峰面積線性關系良好，相關系數(shù)在0.998 6～0.999 9。

表3 各農(nóng)藥線性回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍

免疫層析法。用柑橘空白樣品提取液稀釋系列濃度的農(nóng)藥標準品，按照1.2.5步驟進行檢測，確定試紙條的最低檢出限。由表4可知，嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷、多菌靈試紙條的最低檢出限分別為0.2、0.5、0.3、0.2、0.3 mg·kg-1。

表4 試紙條靈敏度檢測結果

2.4 待檢農(nóng)藥在不同檢測方法下的準確度與精密度

UPLC-MS/MS法。表5顯示，多菌靈的添加水平為0.10～1.00 mg·kg-1，其他4種農(nóng)藥在柑橘中的添加水平均為0.010～1.0 mg·kg-1。嘧菌酯平均回收率為78%～91%，相對標準差均小于7.0%；啶蟲脒平均回收率為79%～103%，相對標準差均小于1.2%；吡蟲啉平均回收率為88%～95%，相對標準差均小于1.3%；丙溴磷平均回收率為73%～78%，相對標準差均小于3.1%；多菌靈平均回收率為87%～95%，相對標準差均小于5.0%。

免疫層析法。表6顯示，向精密度組柑橘空白樣品分別加入檢出限濃度的嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷、多菌靈5種農(nóng)藥標準品，3批次試紙條的結果一致，精密度良好。

準確度組分析快速檢測方法驗證了柑橘樣品中5種農(nóng)藥檢測結果的準確率，以及速測方法的假陰性率和假陽性率。由表7可知，陰性樣本快速檢測試紙法的結果與抽檢樣本屬性完全一致，測試結果均為陰性，5種農(nóng)藥的速測結果均無假陽性，準確率達100%。陽性樣本中，嘧菌酯的假陽性率為10%，準確率為90%；啶蟲脒、丙溴磷的假陽性率為5%，準確率為95%；多菌靈、吡蟲啉的假陽性率為0，準確率為100%。

表5 柑橘中5種農(nóng)藥的添加回收率

表6 免疫層析法檢測柑橘中5種農(nóng)藥精密度結果

3 小結

該研究針對柑橘中檢出率高的4種農(nóng)藥(嘧菌酯、多菌靈、啶蟲脒、吡蟲啉)及常超標的中高毒農(nóng)藥丙溴磷制備膠體金免疫層析試紙條，并合并成5聯(lián)速測卡。結果顯示，這5種農(nóng)藥在柑橘中用免疫層析法檢測的靈敏度均不高于GB 2763—2019中規(guī)定的最大殘留限量(MRL)，柑橘中嘧菌酯、啶蟲脒、吡蟲啉、丙溴磷、多菌靈的MRL分別為1.0、0.5、1.0、0.2、5.0 mg·kg-1。但檢測靈敏度明顯低于超高效液相色譜串聯(lián)質譜的方法。免疫層析速測卡的優(yōu)點在于檢測方法簡便，基質效應低[22]，樣品提取液可同時提取上述5種農(nóng)藥，并可在15 min內(nèi)獲得結果，其檢測結果假陰性率為0%，假陽性率為0～10%，與儀器檢測結果符合率為100%。綜上所述，該速測卡可對柑橘中5種常見農(nóng)藥殘留同時快速定性檢測，基本可滿足農(nóng)戶對這5種高風險農(nóng)藥的源頭自檢，在為確定采收時期提供依據(jù)的同時，減少農(nóng)藥超標，確保柑橘上市售賣，對保障柑橘的安全食用、消費者的健康和生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

表7 柑橘不同樣本的速測結果