解鉀細菌的分離篩選及其對水稻的促生效果

俞海平， 傅慶林， 劉俊麗， 林義成， 郭彬， 劉琛*

(1.紹興市上虞區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 紹興 312300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021)

鉀在水稻體內(nèi)參與了光合作用、碳水化合物的轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)合成等過程[1]。每季水稻鉀吸收量為155.2 kg·hm-2，缺鉀會抑制水稻的生長發(fā)育，降低水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。土壤中鉀素含量豐富，但多以礦物鉀和固定鉀形式存在，不能被植物直接吸收。據(jù)報道，我國耕地鉀素有效性較低，加之高強度的利用，作物收獲帶走了大量鉀素，進一步加劇了土壤鉀缺乏[4]。我國水稻主產(chǎn)區(qū)最佳施鉀量為45～80 kg·hm-2，但我國鉀礦資源稀少，50%～70%的鉀肥都依賴進口，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中鉀肥施用量往往不足[5-6]。使用生物肥料替代傳統(tǒng)化肥可以有效減少化肥使用，降低生產(chǎn)成本，促進生態(tài)友好型作物的生產(chǎn)。

許多研究表明，解鉀細菌能分解含鉀礦物，將土壤中的無效鉀轉(zhuǎn)化為速效養(yǎng)分，增加土壤中鉀元素的含量[7]。葛紅蓮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，用解鉀細菌可顯著提高黃瓜的根長、株高和質(zhì)量。陳臘等[9]研究結(jié)果表明，接種解鉀菌可以增加拔節(jié)期、吐絲期玉米的株高、地上生物量、葉面積指數(shù)和葉綠素。一方面，解鉀菌產(chǎn)生的有機酸和無機酸可以通過降低其周圍環(huán)境的pH，直接促進含鉀礦物的風(fēng)化，導(dǎo)致可交換性鉀的緩慢釋放，提高環(huán)境速效鉀含量；另一方面，解鉀菌可通過分泌多糖黏附于含鉀礦物表面從而形成特殊的微環(huán)境來促進其解鉀功能的發(fā)揮[10]。

本研究針對浙江地區(qū)紅壤及氣候特點，從水稻根際土中分離篩選高效解鉀菌，通過盆栽試驗研究其對水稻的促生潛力，同時將菌株與具有促磷吸收效應(yīng)的叢枝菌根真菌進行混合培養(yǎng)，研究他們之間的互作效應(yīng)，以期為微生物鉀肥研發(fā)提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤樣品為浙江省建德市水稻根際土壤，裝入無菌自封袋中，貼上標(biāo)簽，運回實驗室進行解鉀菌的分離。試驗用培養(yǎng)基為亞歷山大硅酸鹽細菌培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[11]。

1.2 解鉀細菌的分離和篩選

稱取5 g土壤的樣品，加入45 mL無菌水，振蕩約20 min后靜置備用。按照梯度稀釋法進行分離。挑選清晰且具有明顯解鉀圈的單個菌落，在解鉀培養(yǎng)基上劃線純化。根據(jù)菌落四周有無透明圈和可溶性指數(shù)大小篩選高效解鉀菌(可溶性指數(shù)=水解圈直徑D/菌落直徑d)[9]。篩選后的菌株4 ℃保存在斜面培養(yǎng)基上，對其進行鑒定和促生效果驗證。

1.3 解鉀細菌的鑒定

參照文獻[12]對解鉀細菌進行菌種鑒定，鑒定內(nèi)容包括菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色以及菌種的生理生化測定。按照細菌基因組提取試劑盒說明書(Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit)提取供試菌株的總基因組DNA，采用16S rRNA基因通用引物對27F/1492R進行PCR擴增[9]，將PCR產(chǎn)物送生工生物科技(上海)有限公司進行測序。得到的16S rDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站上進行BLAST序列比對分析，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹用Bootstrap法(1 000次)重復(fù)檢驗。

1.4 解磷菌株對水稻生長的影響

1.4.1 處理設(shè)計

試驗設(shè)置不接種處理為對照；接種解鉀菌JK4(解鉀菌處理)；接種叢枝菌根真菌(解磷菌處理)；同時接種叢枝菌根真菌和解鉀菌JK4(組合菌處理)。每個處理3個重復(fù)。供試水稻品為甬優(yōu)7872。

土壤有機質(zhì)含量為12.3 g·kg-1，全氮含量為1.18 g·kg-1，速效磷含量為8.34 mg·kg-1，速效鉀含量為76.8 mg·kg-1，pH 6.8。

1.4.2 測定指標(biāo)

土壤速效鉀、有效磷，以及植株中氮、磷、鉀含量分別按照標(biāo)準NY/T 889—2004、NY/T 1121.7—2014、NY/T 2017—2011測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，多重比較采用Turkey檢驗(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤解鉀細菌的篩選

從根際土壤中分離出5株解鉀細菌，分別命名為JK1、JK2、JK3、JK4和JK5。采用以鉀長石粉為唯一鉀源的培養(yǎng)基對菌株的解鉀能力進行測定，其中JK4的解鉀圈最大，可溶性指數(shù)達到3.37(表1)。選擇JK4進行后續(xù)研究。

表1 菌株在解鉀培養(yǎng)基上的可溶性指數(shù)

2.2 解鉀細菌的鑒定

菌落圓形，凸起，光滑，邊緣整齊，表面光滑，無色透明。革蘭氏染色陰性，菌體桿狀，兩端鈍圓，有莢膜，菌體中央產(chǎn)生橢圓形芽孢，依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步鑒定為芽胞桿菌。

將測序獲得的供試菌株的16S rRNA基因序列進行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果，下載同源性最近的菌株和株外源菌株的序列，和測試菌株一起采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。JK4與Paenibacillusmucilaginosus序列相似性為99.8%，屬于膠質(zhì)芽孢桿菌屬。

2.3 解鉀細菌對水稻的促生作用

接種JK4后水稻的籽粒和秸稈的全鉀含量分別為3.44 g·kg-1和34.7 g·kg-1，與不接種對照相比，分別提高0.15 g·kg-1和5.70 g·kg-1。土壤有效鉀含量為140.3 mg·kg-1，而對照僅為75.7 mg kg-1，達到顯著性差異。結(jié)果表明，解鉀菌株對水稻具有較好的促生作用。

叢枝菌根真菌處理水稻的籽粒和秸稈的全磷含量分別為3.24 g·kg-1和1.79 g·kg-1，與對照相比，分別提高0.41 g·kg-1和0.24 g·kg-1。土壤有效磷含量為17.7 mg·kg-1，而對照僅為12.7 mg·kg-1，達到顯著性差異(表2)。圖2表明，叢枝菌根真菌可以促進水稻對磷的吸收。但同時接種解鉀菌和叢枝菌根真菌后，土壤速效鉀與對照差異不明顯。

柱上無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2 接種菌對土壤速效養(yǎng)分含量的影響

3 小結(jié)與討論

近年來，由于鉀肥價格較高，加之農(nóng)民偏重施氮磷肥，輕視鉀肥的作用，導(dǎo)致稻田鉀素虧缺，對水稻增產(chǎn)潛力和土壤健康造成不利影響[13]。研究表明，解鉀菌對含鉀硅酸礦物具有分解作用，可以提高土壤鉀的有效性，促進植物根系吸收利用，達到提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的目的[14]。不少學(xué)者針對不同作物篩選的解鉀菌，其解鉀能力受土壤類型、鉀礦類型、土壤pH、鉀離子濃度等諸多因素的影響[15]。如趙君等[16]從南方紅壤區(qū)杉木人工林根際土壤中篩選出的解鉀菌解鉀率為60.49%，宋聰?shù)萚17]篩選的解鉀菌發(fā)酵15 d后，發(fā)酵液中可溶性鉀含量達到37.77 mg·L-1，吳紅艷等[18]從番茄土壤中篩選的解鉀菌K02發(fā)酵液中可溶性鉀含量高達41.84 mg·L-1。應(yīng)用高效的解鉀菌可以改善多種作物的生長、抗逆性品質(zhì)和產(chǎn)量。朱娟娟等[19]發(fā)現(xiàn)解鉀菌能夠提高枸杞葉片類黃酮、熒光激發(fā)比花青素相對指數(shù)、花青素和氮素平衡指數(shù)，降低O2·-和H2O2含量，增加可溶性糖含量及過氧化氫酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和轉(zhuǎn)化酶活性，緩解鹽脅迫對枸杞幼苗的影響。這些研究說明，應(yīng)用高效的解鉀菌可以改善作物的生長。本研究中接種解鉀菌后土壤有效鉀含量相比對照增加了64.6 mg·kg-1，達到顯著性差異，說明解鉀菌可以活化土壤中的無效鉀，從而提高土壤鉀的生物有效性。本研究各處理水稻籽粒的全鉀含量無顯著差異。Xu等[2]分析了2 216份水稻籽粒樣品，發(fā)現(xiàn)水稻籽粒鉀含量在0.31%，因此，水稻吸收的鉀主要存儲在營養(yǎng)器官(秸稈)中，籽粒中相對較少，說明水稻籽粒鉀含量一般不受鉀肥施用量的影響，主要由基因型決定[20]。

劉曉倩等[21]研究結(jié)果表明，混合施用解磷菌、解鉀菌使土壤過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶4種生物酶類活性分別比對照提高了40.2%、95.6%、119.4% 和 29.0%，顯著增加烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值。楊冬艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，溶磷菌和解鉀菌配施產(chǎn)生了疊加效應(yīng)，土壤速效氮、磷、鉀含量顯著高于其他處理。而在本研究中，解鉀菌與叢植菌根真菌混施后，僅促進了磷的活化，但對鉀的影響不顯著。可能是由于解鉀菌與叢植菌根真菌混配后產(chǎn)生了競爭關(guān)系，不利于解鉀菌在根部的定植和存活。因此，掌握這些微生物之間的相互作用，將幾種微生物有機混合在一起，確定菌劑的最佳組合，對微生物菌肥的開發(fā)利用有重要意義。