動(dòng)物傳染病mRNA疫苗研究進(jìn)展

秦立得，趙思俊，劉華雷，宋翠平，田文霞

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西晉中 030801；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032)

疫苗(vaccine)在動(dòng)物疫病的預(yù)防與控制中發(fā)揮了重要的作用，為應(yīng)對(duì)新發(fā)動(dòng)物疫情及不斷變異的流行毒株或菌株，疫苗需要不斷的更新，并應(yīng)具有成本低、研發(fā)速度快、生產(chǎn)方便快捷、保護(hù)效果好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。新技術(shù)在疫苗的研發(fā)中得到了重視與應(yīng)用，其中mRNA疫苗是研究的重點(diǎn)。特別是mRNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有研發(fā)生產(chǎn)周期短的顯著優(yōu)點(diǎn)，使其適用于新發(fā)病疫情的快速應(yīng)對(duì)及緊急免疫預(yù)防。在新冠肺炎(COVID-19)疫情期間，多種mRNA疫苗被緊急研發(fā)成功并通過(guò)臨床驗(yàn)證，在全球廣泛應(yīng)用，取得了良好的免疫保護(hù)效果。如輝瑞公司和BioNTech公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)的BNT162b2疫苗是第一批臨床應(yīng)用的COVID-19疫苗，在英國(guó)、加拿大等多國(guó)大規(guī)模使用，臨床Ⅲ期試驗(yàn)測(cè)試免疫保護(hù)效力高達(dá)95%[1]。論文就mRNA疫苗原理、體內(nèi)傳遞方式、誘導(dǎo)免疫機(jī)理、優(yōu)缺點(diǎn)及在動(dòng)物疫病防控中的研究進(jìn)行了綜述。

1 mRNA疫苗

20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)外源DNA和mRNA可以在動(dòng)物體內(nèi)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫。但受mRNA不穩(wěn)定和易被機(jī)體模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別并降解等因素限制，使研究更側(cè)重于DNA疫苗，mRNA更多被當(dāng)做免疫佐劑進(jìn)行研究[2]。2005年Weissman等研究證明使用修飾的外源mRNA可以降低在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)程度并避免快速降解，2008年Karikó等發(fā)現(xiàn)使用假尿苷代替尿苷可增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性并提升翻譯能力，此外大量研究從密碼子優(yōu)化、人工合成mRNA、優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)等多方面著手，增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，并降低了mRNA自身的免疫原性，這些研究為mRNA疫苗的研究及推廣應(yīng)用清除了主要障礙[3]。目前mRNA疫苗在傳染病預(yù)防、癌癥和其他免疫疾病治療等方面得到研究，并有多種抗癌、抗病毒、抗病mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或已用于臨床[4]。

mRNA疫苗可分為普通mRNA疫苗和自擴(kuò)增mRNA疫苗。mRNA疫苗的結(jié)構(gòu)與mRNA相同，包括5′-末端“帽”結(jié)構(gòu)(Cap)、5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)、開(kāi)放閱讀框(ORF)、3′-UTR和3′多聚腺苷酸序列(poly(A))，mRNA翻譯產(chǎn)生目的蛋白?？箓魅静RNA疫苗的ORF編碼目的蛋白質(zhì)，通常為誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的蛋白，包括糖蛋白、刺突蛋白、核蛋白等[5]。傳統(tǒng)的mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，而新型的自我復(fù)制型/自擴(kuò)增mRNA(self-amplifying mRNA,saRNA,SAM)可在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，可翻譯產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)。與普通mRNA結(jié)構(gòu)相比，saRNA增加了一個(gè)來(lái)源于甲病毒、黃病毒等單股正鏈RNA病毒基因組的非結(jié)構(gòu)蛋白基因(nsPs)ORF(圖1)。nsPs翻譯產(chǎn)物能夠合成RNA依賴(lài)RNA聚合酶復(fù)合物，指導(dǎo)saRNA大量復(fù)制并干擾細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)，可在細(xì)胞內(nèi)高水平的表達(dá)外源基因。saRNA細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和翻譯的過(guò)程，模擬了單股正鏈RNA病毒感染細(xì)胞后擴(kuò)增的過(guò)程，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，起到了免疫增強(qiáng)劑的作用[6]。Annette B.Vogel等研究發(fā)現(xiàn)普通mRNA和saRNA疫苗都能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)禽流感病毒的保護(hù)力，只需要使用1.25 mg的saRNA便可與使用80 mg的mRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生相同的保護(hù)水平，使用劑量相差64倍[7]。此外，在saRNA中還可插入CD40L、CD70、IL-4等免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)基因以增強(qiáng)免疫效果[8]。但saRNA疫苗也存在諸多缺點(diǎn)，saRNA比mRNA分子質(zhì)量大，對(duì)saRNA的設(shè)計(jì)和保存提出了更高的要求；saRNA細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增激活免疫系統(tǒng)并誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)?duì)機(jī)體造成損傷[9]。

圖1 mRNA和saRNA結(jié)構(gòu)

2 mRNA傳遞及誘導(dǎo)免疫反應(yīng)

mRNA疫苗可以采用肌肉注射、皮下注射、電轉(zhuǎn)染等方式進(jìn)行免疫，最主要靶細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞等專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞[8]。mRNA必須穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)才能進(jìn)一步的翻譯為蛋白質(zhì)，而在動(dòng)物體內(nèi)mRNA本身具有帶負(fù)電荷、分子質(zhì)量較大和易降解等性質(zhì)，雖然mRNA疫苗不借助載體可直接注射到體內(nèi)，但只有少量的mRNA可進(jìn)入細(xì)胞[10]。大多數(shù)mRNA疫苗借助載體進(jìn)入細(xì)胞，脂質(zhì)體載體、聚合物載體、多肽載體和病毒樣粒子載體等多種載體得到研究與應(yīng)用，其中屬于脂質(zhì)體載體的脂質(zhì)體納米粒子(lipid nanoparticles,LNPs)是應(yīng)用最廣的mRNA疫苗載體[5,8]。LNPs在mRNA疫苗體內(nèi)傳遞和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)也是mRNA疫苗研發(fā)的難點(diǎn)。LNPs通常包被mRNA分子數(shù)量較少，mRNA與可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)結(jié)合并位于顆粒核心，具有脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)，并且在體內(nèi)生物安全性較高[11]。LNPs成分較為復(fù)雜，包括可與mRNA結(jié)合的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，與細(xì)胞膜脂類(lèi)相似的磷酯，穩(wěn)定LNPs脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)的膽固醇，減少非特異性蛋白吸附和LNPs聚集的聚乙二醇-磷酯等物質(zhì)[12]。

當(dāng)mRNA疫苗注入機(jī)體時(shí)，mRNA-LNPs復(fù)合物首先被免疫細(xì)胞吞噬并形成內(nèi)體。在免疫細(xì)胞中，mRNA-LNPs復(fù)合物在酸化降解時(shí)同時(shí)被負(fù)離子化，有助于促進(jìn)mRNA從內(nèi)體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，磷脂在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[13]。mRNA疫苗在細(xì)胞質(zhì)中，借助細(xì)胞內(nèi)的翻譯系統(tǒng)翻譯產(chǎn)生抗原目的蛋白(即免疫原)，部分抗原在細(xì)胞內(nèi)被識(shí)別，加工后與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合并遞呈至細(xì)胞表面。此外，部分抗原分泌到細(xì)胞外，并再次被抗原遞呈細(xì)胞吞噬，經(jīng)加工后與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合并遞呈至細(xì)胞表面。免疫原經(jīng)不同的途徑被處理后與MHC分子結(jié)合，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[14]。

mRNA疫苗中的mRNA，saRNA復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA等成分，可被細(xì)胞內(nèi)不同的模式識(shí)別受體識(shí)別，并激活Ⅰ型干擾素途徑等先天性免疫機(jī)制，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量細(xì)胞因子[15]。激活的Ⅰ型干擾素途徑可促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞成熟，在誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；但Ⅰ型干擾素途徑也會(huì)導(dǎo)致外源mRNA或saRNA大量降解，并影響外源蛋白質(zhì)翻譯，阻礙mRNA疫苗產(chǎn)生良好的免疫效果，甚至出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象[14,16]。mRNA疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生記憶性B淋巴細(xì)胞和長(zhǎng)壽漿細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)持久的保護(hù)性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，且mRNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)以Th1型免疫反應(yīng)為主，而不是以可能會(huì)導(dǎo)致抗體依賴(lài)性增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement，ADE)的Th2型免疫反應(yīng)為主。

3 mRNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)

mRNA疫苗具有免疫效果好、研發(fā)周期短、便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被稱(chēng)為新三代疫苗[18-19]。經(jīng)典疫苗包括弱毒疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗，和亞單位疫苗、基因工程疫苗、重組載體疫苗等新型疫苗，在我國(guó)動(dòng)物疫病防控中得到廣泛的應(yīng)用。mRNA疫苗與經(jīng)典疫苗相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是研發(fā)速度快，獲知目的蛋白序列或編碼基因后，mRNA疫苗的設(shè)計(jì)與研發(fā)僅需不到1周的時(shí)間，生產(chǎn)周期較經(jīng)典疫苗也大為縮短，特別適用于新發(fā)病防控。二是安全性高，mRNA疫苗不產(chǎn)生子代病毒或細(xì)菌，不具有感染性，并且mRNA疫苗不進(jìn)入細(xì)胞核，不存在整合到基因組的風(fēng)險(xiǎn)。三是免疫保護(hù)效果好，mRNA疫苗在體內(nèi)本身具有免疫佐劑反應(yīng)，可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，并產(chǎn)生記憶性免疫反應(yīng)[17]。四是生產(chǎn)方便，生產(chǎn)mRNA疫苗需要多種工程菌和載體，不需要雞胚或培養(yǎng)真核細(xì)胞，方便大量生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低[20]。

4 動(dòng)物傳染病mRNA疫苗研究進(jìn)展

在動(dòng)物疫病mRNA疫苗研究方面，多種疫苗在動(dòng)物試驗(yàn)中顯示良好效果，尤其是病毒病的mRNA疫苗免疫保護(hù)效果較好，可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，并在攻毒試驗(yàn)中有效的保護(hù)了免疫動(dòng)物。但動(dòng)物疫病mRNA疫苗種類(lèi)較少，目前mRNA疫苗主要面向人獸共患病而研制，僅針對(duì)動(dòng)物疫病的疫苗較少。此外，與病毒相比，細(xì)菌和寄生蟲(chóng)結(jié)構(gòu)和致病過(guò)程更復(fù)雜，單一抗原難以提供有效保護(hù)，細(xì)菌病和寄生蟲(chóng)病mRNA疫苗有待更深入的研究。

4.1 流感病毒

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是禽流感的病原，可感染鳥(niǎo)類(lèi)及多種哺乳動(dòng)物，根據(jù)血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)來(lái)劃分流感病毒亞型，目前在已發(fā)現(xiàn)18個(gè)HA亞型與11個(gè)NA亞型，AIV易發(fā)生變異或重組，每年給畜牧養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成巨大損失。流感病毒mRNA疫苗研究較為充分，多種疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果，可激活機(jī)體的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，可保護(hù)同源或異源AIV的攻擊[21]。Magini D等基于H1N1型禽流感病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白1(M1)基因序列分別構(gòu)建了表達(dá)流感病毒NP(SAM(NP))、M1(SAM(M1))及NP和M1(SAM(M1-NP))的LNPs-saRNA疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)表明，這些疫苗單獨(dú)或聯(lián)合使用均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；使用H1N1和H3N2型流感病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAM(NP)和SAM(M1-NP)可有效保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物[22]。Chahal J S等[23]構(gòu)建了能表達(dá)H1N1型流感病毒HA蛋白的LNPs-saRNA疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證，小鼠免疫1次該疫苗即可獲得對(duì)H1N1型流感病毒感染有效的免疫保護(hù)。

4.2 狂犬病病毒

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的一種發(fā)病后病死率高達(dá)100%的烈性傳染病，導(dǎo)致全球每年約有50 000人死亡。Saxena S等構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的saRNA疫苗，10 mg該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類(lèi)似于DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，并在攻毒試驗(yàn)中可有效保護(hù)小鼠[24]。Stitz L等[25]構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的普通mRNA疫苗，該疫苗具有較好的熱穩(wěn)定性，低溫條件下(-80、5、25 ℃)保存12個(gè)月，高溫條件下(40、60、70、80 ℃)保存3個(gè)月，可誘導(dǎo)產(chǎn)生有充足保護(hù)效力的中和抗體；疫苗在4 ℃和56 ℃間進(jìn)行20次循環(huán)存儲(chǔ)，疫苗的免疫原性和保護(hù)性不受影響；動(dòng)物攻毒試驗(yàn)表明該疫苗可有效保護(hù)小鼠；人體Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，71%測(cè)試者(32/45)通過(guò)皮下注射80 μg或160 μg疫苗，46%測(cè)試者(6/13)通過(guò)無(wú)針注射裝置肌肉注射200 μg或400 μg疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生有充足保護(hù)效力的中和抗體。

4.3 口蹄疫病毒

口蹄疫(Foot-and-mouth disease)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的可感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的傳染病，給全世界養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。Pulido M R等使用FMDV基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA接種小鼠，小鼠分為4組，一組為對(duì)照組，其余3組小鼠分別10、50、100 μg/只的劑量接種，其中多只小鼠產(chǎn)生了高滴度的FMDV中和抗體；隨后的攻毒試驗(yàn)顯示，3/8接種mRNA疫苗的小鼠得到了有效保護(hù)[26]。

4.4 日本腦炎病毒

日本腦炎(Japanese encephalitis)是人獸共患病，病原為日本腦炎病毒(JEV,也稱(chēng)乙型腦炎病毒)，在許多亞洲國(guó)家造成了兒童腦炎，感染豬可導(dǎo)致公豬生產(chǎn)性能下降和母豬流產(chǎn)。Huang Y T等[27]在日本腦炎病毒復(fù)制子載體(SRIP)中插入腸道病毒71型SP70蛋白編碼基因，構(gòu)建了mRNA疫苗SRIP-SP70；使用小鼠進(jìn)行免疫和攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該疫苗可有效保護(hù)小鼠免受日本腦炎病毒和腸道病毒71型的致死性攻擊。

4.5 其他病毒

Powassan病毒(POWV)是一種蜱傳黃病毒，該病毒首先從1名死于腦炎的兒童大腦組織中分離，目前被檢測(cè)出在北美洲和俄羅斯鹿群和蜱蟲(chóng)中存在。Van Blargan L A等基于POWV的M蛋白前體和E蛋白編碼基因設(shè)計(jì)了LNPs-mRNA疫苗，使用小鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體，細(xì)胞試驗(yàn)證明中和抗體對(duì)多種黃病毒有中和作用；攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠可經(jīng)受POWN和Langat病毒致死劑量的攻擊[28]。

4.6 弓形蟲(chóng)病

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是可感染多種動(dòng)物和人類(lèi)的寄生蟲(chóng)，全球約1/3人口因食用被污染的食物而感染，對(duì)人間最嚴(yán)重的危害為導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)或胎兒缺陷。Chahal J S等[23]使用弓形蟲(chóng)6種特異性抗原編碼基因構(gòu)建了LNPs-saRNA疫苗，該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體；攻毒試驗(yàn)顯示，免疫小鼠攻毒后長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月內(nèi)不表現(xiàn)臨床癥狀。Luo F等[29]使用弓形蟲(chóng)核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)蛋白編碼基因構(gòu)建了LNPs-saRNA疫苗，該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體；攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示，免疫小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)且腦內(nèi)弓形蟲(chóng)量減少至對(duì)照組的46.4%，并增強(qiáng)了對(duì)急性和慢性弓形蟲(chóng)感染的保護(hù)力。

4.7 細(xì)菌

Maruggi G等[30]分別構(gòu)建了表達(dá)化膿性鏈球菌(GAS)SLOdm蛋白和無(wú)乳鏈球菌(GBS)鏈球菌BP-2a蛋白的saRNA疫苗，動(dòng)物試驗(yàn)表明，這兩種疫苗都可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫小鼠中和抗體，并有效的保護(hù)小鼠。Tameris M D等評(píng)價(jià)了通常用作卡介苗佐劑的結(jié)核桿菌mRNA疫苗MVA85A在臨床上對(duì)嬰兒的安全性、免疫原性和保護(hù)效果，開(kāi)展的臨床Ⅱ期試驗(yàn)共計(jì)對(duì)2 797名嬰兒注射MVA85A疫苗或安慰劑，結(jié)果顯示該疫苗具有良好的安全性，單獨(dú)使用也可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體[31]。

5 展望

新冠疫情期間，滅活疫苗、腺病毒載體疫苗、亞單位疫苗和mRNA疫苗等多種疫苗被緊急研發(fā)應(yīng)用，mRNA疫苗作為新一代疫苗在傳染病防控中發(fā)揮了重要作用。多種mRNA疫苗緊急研制并在臨床上快速應(yīng)用，顯示出該疫苗在應(yīng)對(duì)新發(fā)疫情中具研制速度快、安全性高、保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)[32]。臨床數(shù)據(jù)顯示接種第一針疫苗后，mRNA疫苗在保護(hù)率和誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度上優(yōu)于滅活疫苗，雖然接種第二針后，滅活疫苗也可起到良好的保護(hù)作用[33]。在保護(hù)效力方面，各種疫苗在不同國(guó)家開(kāi)展的臨床試驗(yàn)和使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，mRNA疫苗保護(hù)效力為91.3%～95.3%，較滅活疫苗(49.6%～83.5%)、腺病毒載體疫苗(66.1%～91.4%)、亞單位疫苗(55.4%～89.7%)保護(hù)效力高[34]。目前，艾滋病病毒(HIV)、埃博拉病毒(EBOV)、寨卡病毒(ZIKV)等多種病毒病mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[35]。

相對(duì)于目前在動(dòng)物防疫中廣泛應(yīng)用的疫苗，mRNA疫苗還存在成本高、運(yùn)輸保存困難、產(chǎn)品少等缺點(diǎn)，并且相關(guān)產(chǎn)品存在一定安全風(fēng)險(xiǎn)，限制了它的推廣和應(yīng)用。相關(guān)的研究和改進(jìn)集中在增強(qiáng)疫苗靶向性，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，增加蛋白質(zhì)翻譯量，減少炎癥反應(yīng)，降低生產(chǎn)運(yùn)輸成本等多方面。將來(lái)新的mRNA疫苗會(huì)不斷出現(xiàn)，與滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗等在動(dòng)物疫病防控及凈化中共同發(fā)揮重要作用。