苦豆子生物堿抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究

蘇永霞，蘇日拉格，沙日扣，馬永嘉，吳晨晨，路 浩，趙寶玉*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅平?jīng)?744000；3.阿拉善左旗銀根蘇木綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古阿拉善 750300；4.阿拉善左旗動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古阿拉善 750300)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種發(fā)生在胃腸道的非特異性炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn′s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，IBD的發(fā)病原因主要與腸道微生物異常、免疫反應(yīng)失調(diào)、環(huán)境變化和基因變異有關(guān)[2]。目前，該病每年在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率增長較快，且發(fā)病年齡趨于年輕化，發(fā)病率在5歲以下兒童中增長最快[3]。據(jù)估計(jì)美國有超過100萬居民以及歐洲有250萬居民患有IBD，該病目前已演變成一種全球性的疾病，病情嚴(yán)重者會有不同程度的腸外表現(xiàn)及全身表現(xiàn)，對患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的困擾[4]。其中，UC的病程較長、反復(fù)發(fā)作，病程嚴(yán)重者最終與直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。UC的常用治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸鹽、抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑和生物制劑等，但是長期使用部分患者會對藥物產(chǎn)生依賴性，一旦停止用藥則會復(fù)發(fā)，也有患者在治療期間會發(fā)生病情惡化情況[6]。因此，目前急需探索出新的藥物，緩解IBD的發(fā)生發(fā)展。近年來，傳統(tǒng)中藥因其毒副作用小、安全環(huán)保及動物體不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，已成為全社會的研究熱點(diǎn)，特別是中草藥的抗炎活性也受到廣泛關(guān)注。多種試驗(yàn)證明中草藥具有很好的抗炎作用，因此，通過開發(fā)中草藥的抗炎功效來治療炎癥性腸病，將為炎癥性腸病的治療和中草藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也對國家禁抗減抗限抗行動和畜禽健康養(yǎng)殖的發(fā)展具有重要意義。

苦豆子(Sophoraalopecuroides)是豆科槐屬多年生草本植物，別名苦甘草、苦豆根和草槐等，作為傳統(tǒng)的藥用植物，主要分布在我國新疆、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西和甘肅等西北荒漠地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國苦豆子分布面積約為180萬hm2，資源蘊(yùn)藏量大[7]?！侗静菥V目》記載，苦豆子有清熱解毒、抗菌消炎和止痛鎮(zhèn)靜等藥理功效，常被民間用來治療痢疾和胃痛等疾病[8]?？喽棺铀幱脙r(jià)值極高，寧夏回族自治區(qū)已將苦豆子列入重點(diǎn)保護(hù)的六大地道藥材之一，是寧夏中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)[9]。苦豆子的主要活性成分是生物堿，包括槐定堿、槐果堿、苦豆堿、槐胺堿以及苦參堿等多種單體生物堿[10]。現(xiàn)代藥理研究顯示，苦豆子總堿(total alkaloid ofSophoraalopecuroides，TASA)具有抑菌抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用，尤其對機(jī)體的慢性炎癥治療作用顯著，其對肝臟[11]、肺臟、胰腺[12]和腸道[13]的炎性損傷治療作用較好。因此，本研究通過葡聚糖硫酸鈉鹽溶液(dextran sodium sulfate，DSS)建立小鼠急性期UC模型，同時(shí)采用不同劑量TASA進(jìn)行處理，觀察小鼠結(jié)腸組織的損傷程度以及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，探究TASA對UC的治療作用，為UC治療提供新思路，同時(shí)也為苦豆子資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物堿 2019年10月，在內(nèi)蒙古阿拉善吉蘭泰鎮(zhèn)(105°45'54.320 4"E，39°45'43.812"N)采集苦豆子種子，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室提取得到苦豆子種子總生物堿(西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物中毒病實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康昆明小鼠，雌雄各半(雌性25只，雄性25只)，體重20 g±2 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)室溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，于試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 葡聚糖硫酸鈉鹽，大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒，西安恩典生物科技有限公司產(chǎn)品；糞便潛血定性檢測試劑，北京雷根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；二甲苯、無水乙醇、甲醛(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器設(shè)備 RM2016型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；YT-7FB型生物組織攤烤片機(jī)，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DGP-9057B-2型干燥箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Ni-U正置顯微鏡，南京斯高譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎模型建立與分組給藥

1.2.1.1 潰瘍性結(jié)腸炎模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)[14]中介紹的方法，將DSS溶于生理鹽水中配制成40 mg/mL的DSS溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，小鼠連續(xù)自由飲用40 mg/mL的DSS溶液7 d，建立急性期UC模型。

1.2.1.2 動物分組給藥 昆白小鼠隨機(jī)分為對照組，模型組，TASA高、中、低劑量組(60、30、15 mg/kg)，每組10只小鼠。對照組小鼠自由飲水7 d，模型組小鼠自由飲用40 mg/mL的DSS溶液7 d，TASA治療組小鼠在自由飲用40 mg/mL DSS溶液的同時(shí),分別按上述劑量的苦豆子生物堿灌胃7 d。于試驗(yàn)第8天處死小鼠，采樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.2.2 疾病活動指數(shù)評估 試驗(yàn)期間，通過疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)分?jǐn)?shù)來評估小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的臨床進(jìn)展。造模及治療后每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、測定小鼠的體重、觀察糞便的性狀并進(jìn)行糞便隱血檢查。DAI的具體評定方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，按照評分標(biāo)準(zhǔn)對小鼠體重變化、糞便性狀以及糞便隱血情況進(jìn)行評分，隨后將相關(guān)分?jǐn)?shù)相加除以3即為DAI評分，DAI評分值越高表示小鼠臨床癥狀越嚴(yán)重。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 結(jié)腸長度變化測定 試驗(yàn)第8天，處死小鼠，取肛門至結(jié)腸部分的腸管，測量結(jié)腸的長度，隨后沿腸系膜縱行剪開，用無菌PBS沖洗結(jié)腸除去糞便，觀察腸道黏膜的出血和損傷情況。

1.2.4 結(jié)腸組織病理變化觀察 試驗(yàn)第8天，處死小鼠，距離肛門5 cm處取小鼠結(jié)腸段，用100 mg/mL的中性甲醛固定，隨后用梯度乙醇和二甲苯脫水透明，石蠟包埋組織塊，隨后進(jìn)行組織切片(切片厚度為5 μm)和蘇木素伊紅(HE)染色。最后，使用顯微鏡觀察結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的完整性、腸黏膜充血水腫以及炎性細(xì)胞浸潤等情況。

1.2.5 結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的檢測 取已處理的小鼠結(jié)腸組織，加生理鹽水使用組織勻漿機(jī)在冰上制備結(jié)腸組織勻漿，組織勻漿的濃度為100 mg/mL，隨后將勻漿液以2 000 r/min離心20 min，吸取上清液，置-20 ℃保存，隨后用ELISA試劑盒檢測結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間比較采用單因素方差分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 潰瘍性結(jié)腸炎造模結(jié)果

小鼠自由飲用40 mg/mL的DSS溶液后，試驗(yàn)前4 d體重持續(xù)增長，從第5天開始小鼠體重下降，于試驗(yàn)第7天下降到最低。便血情況顯示，試驗(yàn)第1～2天，小鼠未見便血情況，糞便隱血試劑盒測定隱血陽性(+)；試驗(yàn)第3天，2只小鼠出現(xiàn)輕微便血情況，小鼠被毛粗亂、精神狀態(tài)較差；試驗(yàn)第4～5天，6只小鼠出現(xiàn)明顯血便，且小鼠的活動明顯減少；試驗(yàn)第7天所有小鼠都出現(xiàn)腹瀉、肉眼血便。造模結(jié)束后處死小鼠，取出結(jié)腸部分，發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸嚴(yán)重縮短、腸道出現(xiàn)水腫情況，沿腸系膜縱行剪開腸道，發(fā)現(xiàn)腸道黏膜出血嚴(yán)重，部分腸段有潰瘍形成，以上試驗(yàn)結(jié)果顯示造模效果較好。造模組小鼠便血和結(jié)腸組織損傷情況見圖1。

圖1 造模組小鼠便血和結(jié)腸損傷

2.2 小鼠體重和DAI變化結(jié)果

與對照組相比，DSS模型組小鼠體重在試驗(yàn)前4 d穩(wěn)定增長，從第5天開始體重劇烈下降，于試驗(yàn)第7天降到最低；與DSS模型組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠體重增長，且隨著試驗(yàn)天數(shù)的增長模型組與TASA治療組之間小鼠體重變化差異加大，各治療組小鼠體重變化沒有顯著差異；與對照組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠體重增長緩慢(圖2)。與對照組相比，DSS造模組小鼠DAI評分在試驗(yàn)期間持續(xù)上升，于試驗(yàn)第7天達(dá)到峰值；與DSS模型組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠DAI評分在試驗(yàn)前4 d有所上升，在第5天后DAI評分持續(xù)下降，且各治療組小鼠DAI評分沒有顯著差異；與對照組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠DAI評分有所上升(圖3)。說明采用苦豆子生物堿治療后，對UC模型小鼠臨床癥狀有所改善。

圖2 小鼠體重變化

圖3 小鼠DAI評分變化

2.3 小鼠結(jié)腸長度測量結(jié)果

試驗(yàn)期結(jié)束后，處死小鼠獲取結(jié)腸部分，隨后測量結(jié)腸長度變化(圖4)。與對照組相比，DSS模型組、TASA高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，且DSS模型組小鼠結(jié)腸縮短的更加明顯(P<0.01)；與DSS模型組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠的結(jié)腸長度顯著增加，差異極顯著(P<0.01)；幾個(gè)治療組之間相比，TASA高劑量組小鼠結(jié)腸長度比TASA中、低劑量組的長，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果說明，采用苦豆子生物堿治療后能明顯的改善DSS模型組小鼠結(jié)腸縮短程度，且高劑量組的改善作用更加顯著。

A.對照組；B.模型組；C.高劑量組；D.中劑量組；E.低劑量組；對照組與其他幾組相比，**P<0.01；TASA治療組與DSS模型組相比，##P<0.01

2.4 小鼠結(jié)腸黏膜病理變化結(jié)果

試驗(yàn)期結(jié)束后，采用HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化(圖5)。與對照組相比，DSS模型組小鼠結(jié)腸壁增厚、腸黏膜上層細(xì)胞壞死脫落、腺體排列紊亂、杯狀細(xì)胞大量缺失以及存在淋巴細(xì)胞浸潤等，結(jié)腸組織的病理變化涉及到黏膜層及黏膜下層；與DSS模型組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸組織的病理變化明顯減輕，腸腺排列整齊，黏膜層上皮細(xì)胞缺失減少、炎癥細(xì)胞浸潤減輕；與對照組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸主要變化就是腸管增粗、腸腔變小，其他病理損傷較輕，且各治療組小鼠結(jié)腸組織的病理變化相似，沒有表現(xiàn)出明顯劑量差異性。

A.對照組；B.模型組；C、D、E分別為TASA高、中、低劑量組

2.5 小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子檢測結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束后，采用ELISA檢測小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α的含量變化(圖6)。與對照組相比，DSS模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α的含量升高，且差異極顯著(P<0.01)，表明DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎造模效果較好；與DSS模型組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸組織中這兩種炎癥因子的含量都降低，差異極顯著(P<0.01)，表明苦豆子生物堿治療可以抑制炎癥因子的分泌；與對照組相比，TASA高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和TNF-α稍微升高，但差異不顯著，且各治療組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的水平相似，沒有表現(xiàn)出明顯的劑量差異性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩種炎癥因子在DSS模型組均較對照組明顯升高，TASA干預(yù)后表達(dá)均較DSS模型組明顯下降。

A.對照組；B.模型組；C.高劑量組；D.中劑量組；E.低劑量組；DSS模型組與對照組相比，**P<0.01；TASA治療組與DSS模型組相比，##P<0.01

3 討論

苦豆子作為西北地區(qū)的一種傳統(tǒng)藥用植物，主要藥理活性成分是生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌抗炎、中樞抑制及對心血管系統(tǒng)疾病的保護(hù)等作用[16]。由于苦豆子抗炎效果較好，在民間常被用來治療胃腸炎等疾病。因此，本研究進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)來證實(shí)苦豆子生物堿是否可以緩解由DSS誘導(dǎo)的急性UC，結(jié)果顯示，其對UC模型小鼠表現(xiàn)出良好的治療作用。

UC是一種病因尚不明確、病程長、易反復(fù)發(fā)作的以直腸和結(jié)腸黏膜彌漫性炎癥為特征的慢性疾病，主要的臨床表現(xiàn)為便血、腹痛和腹瀉，其結(jié)腸的病理損傷主要為黏膜層化膿水腫、杯狀細(xì)胞壞死缺失以及隱窩層炎性細(xì)胞浸潤等[17-19]，如果不及時(shí)治療可大大增加患結(jié)腸癌的幾率。目前，UC也是世界范圍內(nèi)的一種公共性疾病，引起越來越多人的關(guān)注。在過去的幾十年里為了研究該疾病，眾多學(xué)者建立了大量的實(shí)驗(yàn)動物UC模型，主要包括化學(xué)試劑誘導(dǎo)法、復(fù)合法、免疫法、基因模型和中醫(yī)模型等[20]。其中，化學(xué)試劑誘導(dǎo)的腸道炎癥模型是最常用UC模型，在化學(xué)法中DSS誘導(dǎo)的UC模型因成本低、操作簡單并且其病理表現(xiàn)與人類潰瘍性結(jié)腸炎有許多相似之處而被廣泛應(yīng)用，可作為研究UC發(fā)病機(jī)制和治療的工具[21]。DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生可能與其進(jìn)入腸道中造成腸黏膜單層上皮受損，從而導(dǎo)致促進(jìn)炎癥發(fā)生的腸道內(nèi)容物(如細(xì)菌及其產(chǎn)物)擴(kuò)散到下層組織有關(guān)[22]。本試驗(yàn)中，小鼠自由飲用40 mg/kg的DSS溶液后，體重下降明顯、DAI評分升高以及結(jié)腸組織充血水腫嚴(yán)重，且造模過程中小鼠沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，所以40 mg/kg的DSS溶液造模效果較好。隨后，采用60、30、15 mg/kg的苦豆子總堿在造模的同時(shí)進(jìn)行治療，最終對小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎表現(xiàn)出很好的改善作用。首先，苦豆子生物堿治療后，小鼠的體重變化、DAI評分以及便血程度都有所改善。此外，UC模型小鼠結(jié)腸長度出現(xiàn)變短情況，采用苦豆子生物堿治療能夠緩解結(jié)腸縮短程度，并且可以減輕結(jié)腸組織的充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤及維持腸黏膜的完整性，腸黏膜作為腸道免疫的主要屏障，在養(yǎng)分消化吸收以及抵抗病原微生物入侵具有重要作用[23]，而苦豆子生物堿治療能夠維持UC模型小鼠腸黏膜的完整性。

大多數(shù)研究顯示，UC的發(fā)生與基因遺傳、環(huán)境影響、腸道免疫反應(yīng)失調(diào)以及腸道菌群紊亂等有關(guān)，其中免疫因素扮演著重要的角色[24]。在炎癥性腸病中，相關(guān)炎癥信號通路的過度激活使炎癥因子之間不平衡，最后會導(dǎo)致疾病進(jìn)一步發(fā)展及結(jié)腸組織的損傷。腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-lβ(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)以及中性粒細(xì)胞激活肽-Ⅰ/白細(xì)胞介素-8(IL-8)已被證明是炎癥性腸病的發(fā)生時(shí)引起腸道炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[25]。研究顯示，在炎癥性腸病患者中TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平顯著升高，治療后這些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生明顯降低[26-28]。在本試驗(yàn)中，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β的水平升高，采用苦豆子生物堿治療后這兩種細(xì)胞因子的含量都有所下降，說明苦豆子生物堿治療能夠抑制結(jié)腸炎小鼠機(jī)體炎癥因子的分泌。綜上所述，通過緩解體內(nèi)與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)的這些主要指標(biāo)，證實(shí)了苦豆子生物堿對UC的治療作用。