奶牛乳房炎4種常見病原菌多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

劉冬霞，張淑霞，徐海玲，許信剛，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

乳房炎(Mastitis)是奶牛疾病中對奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟影響較大的一種疾病，可導(dǎo)致乳制品行業(yè)的大量生產(chǎn)損失[1]。乳房炎通常是宿主對乳房內(nèi)感染的反映，由大量細菌感染引起[2]。目前引起牛乳房炎的病原主要為革蘭氏陰性菌，如大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌，以及革蘭氏陽性菌，如無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，這些微生物中的大多數(shù)也作為人類的病原體出現(xiàn)[3-6]。準確且經(jīng)濟有效的乳房炎病原體檢測對于奶牛乳房炎的診斷、監(jiān)測和控制非常重要。乳汁微生物鑒定常被認為是乳房炎診斷的“金標準”，該方法盡管較為準確，但耗時較長、方法繁瑣、敏感性較低，故而難以滿足臨床需要。此外，許多病原體具有共同的形態(tài)特征，并在患病牛中引起相似的臨床癥狀，通過培養(yǎng)的方法進行快速診斷多發(fā)性和繼發(fā)性感染存在困難的，而不依賴于病原菌培養(yǎng)的多重PCR技術(shù)因其快速、特異性地同時檢測多個細菌物種的特點已成為奶牛乳房炎病原菌檢測的主流手段[7-8]。本研究通過比對分析，針對奶牛乳房炎臨床常見致病菌如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的相對保守基因設(shè)計特異性引物，建立和評估了多重PCR檢測方法，為早期診斷和臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、蠟樣芽孢桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、糞腸球菌和表皮葡萄球菌，均由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 2×EsTaqMasterMix、DNA標準、瓊脂糖、細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成；血清瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基，參照文獻[9]方法配制。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀(K960)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SJ-CJ-1FD)，蘇潔醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-50HJ)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的大腸埃希氏菌phoA基因(序列號：M13345.1)、金黃色葡萄球菌nuc基因(序列號：CP029087.1)、無乳鏈球菌tuf基因(序列號：AF276256.1)、肺炎克雷伯氏菌khe基因(序列號：KX842080.1)，利用Primer 5.0分析軟件，設(shè)計4對特異性引物，由奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。

表1 多重PCR引物

1.2.2 模板DNA的制備 細菌純培養(yǎng)物按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 單項引物PCR擴增及鑒定 以上述方法提取的4個菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2 μL，ddH2O補足。按下列條件進行PCR擴增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，94 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取0.5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)多次試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果的因素主要是退火溫度和引物濃度，因此本試驗對這兩個反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA等量混勻作為模板。將退火溫度按照2 ℃梯度設(shè)定為51.8、54.1L、56.2L、58.5L、59.7L、62.0 ℃進行試驗；按照0.25 μmol/L的濃度梯度設(shè)定各對引物濃度組合分別為(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μmol/L)進行優(yōu)化，篩選多重PCR擴增的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.2.5 特異性試驗 以上述方法提取的4個菌基因組DNA混合物作為模板，以非目標菌株基因組DNA和雙蒸水作為對照，每孔均加入4對引物進行擴增，檢測多重PCR反應(yīng)的特異性。

1.2.6 敏感性試驗 用核酸蛋白定量儀分別測得大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板的質(zhì)量濃度分別為 171.1、191.6、109.6、208.9 ng/μL，將已測定濃度的4種菌的模板DNA按101～109梯度進行稀釋，在優(yōu)化好的多重PCR體系下進行擴增，觀察單項PCR和多重PCR擴增的靈敏度。

1.2.7 臨床奶樣檢測 陜西地區(qū)部分奶牛場送檢了35份臨床奶樣，利用建立的多重PCR檢測方法和傳統(tǒng)細菌分離結(jié)合16S rRNA測序分析的方法同時對其進行檢測，比較二者之間的檢出率及符合率。符合率=(共同陽性數(shù)+共同陰性數(shù))/所檢樣品數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR擴增結(jié)果

單項PCR擴增結(jié)果如圖1，可以分別觀察到666 bp(大腸埃希氏菌)、287 bp(無乳鏈球菌)、477 bp(金黃色葡萄球菌)和209 bp(肺炎克雷伯氏菌)的條帶，大小與預(yù)期相符。

M.DNA 標準DL 2 000;1.大腸埃希氏菌；2.無乳鏈球菌；3.金黃色葡萄球菌；4.肺炎克雷伯氏菌

2.2 多重PCR擴增條件的優(yōu)化

對引物的濃度和退火溫度進行了優(yōu)化。多重PCR反應(yīng)體系中各對引物終濃度各為1.0 μmol/L時最佳(圖2)；最適退火溫度為56.2 ℃(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.0.25 μL；2.0.5 μL；3.0.75 μL；4.1.0 μL；5.1.25 μL；6.1.5 μL

M.DNA 標準DL 2 000;1.51.8 ℃；2.54.1 ℃；3.5 6.2 ℃；4.58.5 ℃；5.59.7 ℃；6.62 ℃

2.3 特異性試驗結(jié)果

使用4個引物對的引物混合物通過多重PCR擴增目標菌株和非目標菌株的基因組DNA(圖4)，結(jié)果多重PCR測定分別為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌的均能擴增出666、477、287、209 bp的目的條帶，而非目標菌株未觀察到條帶。

M.DNA 標準DL 2 000;1.大腸埃希氏菌+金黃色葡萄球菌+無乳鏈球菌+肺炎克雷伯氏菌；2.大腸埃希氏菌；3.金黃色葡萄球菌；4.無乳鏈球菌；5.肺炎克雷伯氏菌；6.蠟樣芽孢桿菌；7.牛棒狀桿菌；8.乳房鏈球菌；9.糞腸球菌；10.表皮葡萄球菌；11.陰性對照

2.4 敏感性試驗結(jié)果

將提取的細菌基因組DNA混合后倍比稀釋，利用優(yōu)化好的多重PCR擴增條件進行擴增，分別測出多重PCR對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌DNA模板最低檢出限分別為17.11、19.16、109.6、20.89 pg/μL(圖5A)，單項PCR檢測最低量分別為大腸埃希氏菌1.711 pg/μL、金黃色葡萄球菌0.191 pg/μL、無乳鏈球菌1.096 pg/μL、肺炎克雷伯氏菌2.089 pg/μL(圖5B、圖5C、圖5D、圖5E)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～9.101～109倍比稀釋DNA的PCR擴增結(jié)果；A.大腸埃希氏菌+金黃色葡萄球菌+無乳鏈球菌+肺炎克雷伯氏菌；B.大腸埃希氏菌；C.金黃色葡萄球菌；D.無乳鏈球菌；E.肺炎克雷伯氏菌

2.5 臨床樣本檢測

對35份的送檢樣品同時進行多重PCR及細菌分離鑒定進行檢測，結(jié)果見表2；部分樣品多重PCR檢測結(jié)果見圖6。多重PCR檢測技術(shù)的陽性檢出率為51.4%，細菌分離鑒定檢出的陽性率為45.7%，兩種方法同時檢測4種病原菌檢出的符合率為94.3%。

表2 樣品檢測結(jié)果

M.DNA 標準DL 2 000;1～10樣品

3 討論

乳房炎因其高患病率和高發(fā)病率已成為危害全球奶牛健康最重要的疾病之一。多項研究證實了乳房炎對畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟性和危害性[10]。近年來，國內(nèi)對于奶牛乳房炎防治手段的研究在逐漸進步，但是還沒有一種有效手段能對奶牛乳房炎進行預(yù)防和治療，奶牛乳房炎發(fā)病率依然保持很高的水平。研究表明，可引起奶牛乳房炎的細菌多達上百種，乳房炎致病菌檢測或鑒定不及時往往會延誤疾病的治療。因此建立一種針對奶牛乳房炎主要致病菌的診斷方法就顯得尤為迫切。目前，PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原的檢測，尤其是多重PCR技術(shù)的出現(xiàn)更是極大地滿足了臨床檢測需要[11-12]。本研究建立的多重PCR檢測方法選取的大腸埃希氏菌phoA基因，金黃色葡萄球菌nuc基因，無乳鏈球菌tuf基因，肺炎克雷伯氏菌khe基因都具有高度保守又廣泛存在的特點。根據(jù)以上基因設(shè)計的4對特異性引物，擴增出來的片段均正確且特異性良好。敏感性試驗結(jié)果顯示，多重PCR方法的靈敏度比單項PCR方法的相比降低了101～102倍，這可能是引物間的相互影響引起的，但已經(jīng)能滿足臨床檢測的需要。該方法可用于細菌培養(yǎng)物或臨床樣本，均能準確地鑒定病原菌。所建立分子檢測試驗對臨床收集的35份樣本檢測中得到了驗證(表2)。應(yīng)用這種方法可以繼純培養(yǎng)物或臨床樣本中簡單提取基因組DNA后，在1個工作日內(nèi)確定出奶牛乳房炎感染的致病菌。

綜上，本試驗建立的多重PCR方法可以快速、特異性地診斷由主要致病菌大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌單獨或混合感染引起的奶牛乳房炎，且靈敏度高，能滿足臨床檢測的需要，為臨床感染用藥提供指導(dǎo)。同時應(yīng)用該方法可以了解牛群的健康狀態(tài)，為提高群體健康管理的質(zhì)量和精確度提供參考。