蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌三重PCR檢測方法建立與應用

胡 慧，李田美，姜艷芬

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

奶牛乳房炎是由理化因素刺激和多種病原微生物感染引起的一種乳腺疾病，嚴重威脅奶牛養(yǎng)殖業(yè)和乳制品行業(yè)發(fā)展，每年給全球造成的經(jīng)濟損失高達350億美元[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國奶牛臨床乳房炎發(fā)病率為20%～75%，而在某些地區(qū)發(fā)病率甚至超過75%[2]，引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多，以葡萄球菌屬、腸桿菌屬、鏈球菌屬和芽孢桿菌屬為主，由于地域、氣候等因素的不同，各個地區(qū)主要致病菌也有所差異[3-4]。

前期研究對陜西關中地區(qū)3個奶牛養(yǎng)殖場采集的126份臨床乳房炎乳樣進行細菌分離純化、16S rDNA鑒定和生化鑒定，共分離純化得到11個屬的病原菌，其中蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的分離率較高，分別為15.9%、11.9%和4.8%，且肺炎克雷伯氏菌均分離自經(jīng)過頭孢喹肟和頭孢噻呋輪換用藥治療的乳房炎乳樣。蠟樣芽孢桿菌已成為引起歐洲食物中毒事件的第三大常見菌[5]，攝入被蠟樣芽孢桿菌污染的食物會引起惡心、嘔吐和腹瀉，同時該菌也是引起奶牛乳房炎的重要環(huán)境致病菌，能依附于其他細菌加快黏附并定植于乳房上皮細胞中，導致乳腺的感染，嚴重者可致奶牛死亡。Fei P等[6]從奶牛場350個環(huán)境和生牛乳樣本中共檢測到56株蠟樣芽孢桿菌，若管理和清潔不當，則是引起乳房炎的潛在威脅。產(chǎn)色葡萄球菌是牛、綿羊、山羊中常見的皮膚共生和機會性乳房炎病原體，同時也是奶牛乳房炎常見病原菌凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)中分離率最高的細菌，能產(chǎn)生多種腸毒素，引起乳房持續(xù)性的感染，導致乳體細胞計數(shù)增加和牛奶的品質下降，在歐洲和美國被認為是引起奶牛亞臨床乳房炎的最常見非金黃色葡萄球菌之一[7-8]。肺炎克雷伯氏菌是重要的條件性致病菌，廣泛存在于自然界中，可引起嚴重的肺炎、血液感染、臨床乳房炎[9]。Gao J等[10]從中國13個省的123個奶牛場臨床型乳房炎的奶樣中共分離肺炎克雷伯氏菌124株(51%)。該菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素有耐藥性[11]，并且能夠迅速傳播和轉移，抗生素治療效果不理想，從而導致乳腺的長期感染和產(chǎn)奶量大幅度降低[12]，且奶?？祻秃笠矡o法恢復正常生產(chǎn)水平，造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，致病菌的快速檢測對于臨床治療與防控至關重要。

目前，國內(nèi)外學者已針對乳房炎常見病原建立了單項[13]以及多重PCR檢測方法[14-16]，但尚無同時檢測這3種病原菌的多重PCR方法報道，本研究建立了蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌及肺炎克雷伯氏菌的三重PCR方法，為畜牧生產(chǎn)及可能引起奶牛乳房炎的相應病原菌的檢測提供高效、特異的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物 蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、產(chǎn)色葡萄球菌(Staphyococcuschromogenes)由西北農(nóng)林科技大學獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室分離鑒定并保存；大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、沙門氏菌(CVCC2185)、金黃色葡萄球菌(ACCC 01011)、鏈球菌(CVCC 1887)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(CVCC49)，腐敗梭菌C55-1(CVCC60021)，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，由西北農(nóng)林科技大學獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存。

根據(jù)GenBank中收錄的基因序列信息并參考相關文獻[17-19]，引用蠟樣芽孢桿菌的溶血素基因hblA、肺炎克雷伯氏菌的溶血酵素基因khe、產(chǎn)色葡萄球菌的超氧化物歧化酶sodA引物序列，并由北京擎科生物科技有限公司合成。引物的序列、擴增片段長度見表1。

表1 三重PCR引物序列

1.1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)，青島科源生物科技公司產(chǎn)品；DNA標準DL 2 000，近岸蛋白質科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設備 生物顯微鏡，重慶中顯光電儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀、冷凍高速離心機，Eppendorf AG公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品；NanoDrop OneC，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單項PCR檢測方法的建立 蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)色葡萄球菌分別接種到BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，按照細菌基因組提取試劑盒推薦步驟提取細菌基因組DNA。分別以3種菌的細菌基因組DNA為模板，以ddH2O為陰性對照，進行單項PCR擴增。PCR反應體系：2×ESTaqMastermix 12.5 μL，上、下游引物各1.25 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O 9 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增完成后，將PCR產(chǎn)物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像，觀察結果并保存。

1.2.2 三重PCR檢測方法的建立

1.2.2.1 擴增條件的優(yōu)化 以3種菌的混合DNA為模板，對PCR反應的引物濃度、退火溫度等進行優(yōu)化，以確定最佳反應體系和反應程序。反應體系為：2×ESTaqMastermix 12.5 μL，不同組合濃度的3對引物，模板DNA混合物1 μL，滅菌ddH2O將反應體積補至25 μL。反應程序：94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。對退火溫度(50、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60 ℃)、各引物濃度組合(BC-hblA、KP-khe、SC-sodA引物濃度(μmol/L)分別為0.4、0.1、0.2；0.4、0.1、0.1；0.4、0.15、0.2；0.4、0.15、0.1；0.6、0.1、0.2；0.6、0.1、0.1；0.6、0.15、0.2；0.6、0.15、0.1)等反應條件進行優(yōu)化，篩選出三重PCR擴增的最佳反應條件。

1.2.2.2 特異性試驗 采用優(yōu)化后的擴增條件及程序分別以蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌的DNA為模板，進行三重PCR擴增反應。

1.2.2.3 敏感性試驗 將過夜培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液用平板法進行計數(shù)。然后直接取蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)色葡萄球菌菌液混合并進行10倍倍比稀釋，以各梯度菌液作為模板，采用優(yōu)化后的三重PCR擴增條件進行反應。此外，分別提取蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌DNA，并用NanoDrop OneC超微量紫外分光光度計測量3種細菌基因組DNA濃度，然后混合3種DNA并進行10倍倍比稀釋，以各梯度DNA為模板，采用優(yōu)化后的三重PCR擴增條件進行反應。

1.2.2.4 穩(wěn)定性試驗 應用建立的三重PCR方法，分別取蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌的DNA樣品各2份，每隔1周進行1次試驗，重復檢測3次，驗證三重PCR的穩(wěn)定性。

1.2.3 樣品采集及檢測 2020年10月，在陜西關中地區(qū)某奶牛場采集臨床型乳房炎乳樣共14份，采樣前先經(jīng)消毒液噴淋乳房及腹部體表以清除污物，再用消毒毛巾(一牛一巾)擦拭乳房和乳頭部位，棄去前3把乳，收集30 mL乳汁于滅菌試管中，置于冰盒中于6 h內(nèi)帶回實驗室。同時應用三重PCR方法和傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及16S rDNA測序進行乳樣細菌的檢測。取奶樣1 mL接入9 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 h～8 h，提取細菌基因組DNA，以ddH2O為陰性對照，3種細菌混合DNA為陽性對照，應用三重PCR方法檢測；同時將乳樣顛倒混勻，均勻涂抹于血平板上(50 mL/L綿羊血)，37 ℃培養(yǎng)24 h。分別選擇不同形態(tài)特征的菌落經(jīng)革蘭氏染色觀察細菌的形態(tài)后，再劃線接種到BHI瓊脂培養(yǎng)24 h～48 h。挑取經(jīng)鏡檢確認純化的菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后劃線，選取單菌落模板進行16S rDNA PCR擴增，符合測序標準的擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物公司測序。測序結果在NCBI網(wǎng)站進行Blast序列比對，確定細菌種屬。

2 結果

2.1 單項PCR的建立

分別對3種DNA進行單項PCR擴增后，蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)色葡萄球菌分別在995、425、222 bp處擴增出與目的條帶大小相符的特異性條帶(圖1)，ddH2O陰性對照無擴增條帶。

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)色葡萄球菌；2.肺炎克雷伯氏菌；3.蠟樣芽孢桿菌；4.ddH2O

2.2 三重PCR檢測方法的建立

2.2.1 退火溫度的優(yōu)化 將3種DNA等比例混合作為模板，選擇不同的退火溫度(50 ℃～60 ℃)進行三重PCR擴增，結果表明，退火溫度在52.3 ℃～54.0 ℃擴增效果較好，確定54.0 ℃為最佳退火溫度(圖2)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～8.退火溫度分別為50、50.9、52.3、54.0、56.3、58.1、59.3、60 ℃；9.ddH2O

2.2.2 引物濃度的優(yōu)化 取不同濃度的引物組合進行三重PCR反應，結果表明BC-hblA、SC-sodA、KP-khe引物濃度分別為0.6、0.2、0.1 μmol/L時擴增效果最好(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～8.BC-hblA、KP-khe、SC-sodA引物濃度(μmol/L)的組合分別為0.4、0.1、0.2；0.4、0.1、0.1；0.4、0.15、0.2；0.4、0.15、0.1；0.6、0.1、0.2；0.6、0.1、0.1；0.6、0.15、0.2；0.6、0.15、0.1；9.ddH2O

2.2.3 特異性檢測 采用優(yōu)化好的擴增條件進行三重PCR的特異性檢測，結果顯示以產(chǎn)色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌DNA為模板均可擴增出特異的目的片段，而以其他常見細菌DNA和ddH2O陰性對照均未擴增出相應的條帶(圖4)，表明建立的三重PCR方法的特異性較好。

M.DNA 標準DL 2 000;1～4.分別為混合DNA、蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)色葡萄球菌；5～10.分別為大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌；11.ddH2O

2.2.4 敏感性檢測 以蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液混合后10倍梯度稀釋作為模板，采用優(yōu)化好的擴增條件進行三重PCR反應，結果顯示，該方法對蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌菌液最低檢測限為9.9×103、1.1×103、1.0×104CFU/mL(圖5)。

M.DNA標準DL 2 000;1～7.分別為混合菌液的100～106倍比稀釋；8.ddH2O

將三者DNA分別等比例混合后進行10倍系列稀釋后作為模板，采用優(yōu)化好的擴增條件進行PCR反應，結果顯示，該方法對蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌DNA最低檢測限分別為35.8、6.3、40.2 pg/μL(圖6)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～6.分別為混合DNA的100～105倍比稀釋；7.ddH2O

2.2.5 穩(wěn)定性檢測 應用建立的三重PCR方法在不同時間對每份樣品重復檢測3次，結果顯示3次的檢測結果是一致的，表明該方法具有良好的可重復性。

2.3 樣品采集及檢測

應用建立的三重PCR方法和傳統(tǒng)細菌分離培養(yǎng)方法同時對14份臨床乳房炎乳樣進行檢測。結果顯示，傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)方法檢測蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的樣品陽性率分別為28.6%(4/14)、14.3%(2/14)和7.1%(1/14)，三重PCR方法蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的陽性率分別為35.7%(5/14)、14.3%(2/14)和7.1%(1/14)(圖7)，其中蠟樣芽孢桿菌的PCR檢測陽性率高于細菌分離鑒定陽性率，總體細菌分離鑒定與PCR檢測方法的陽性符合率為87.5%。

M.DNA 標準DL 2 000;1.混合DNA；2～15.樣品；16.ddH2O

3 討論

食品安全問題受到人們的廣泛關注，奶源的安全問題乃重中之重。大規(guī)模使用抗生素造成的抗生素殘留以及細菌耐藥性增高導致奶牛乳房炎治療困難，使得快速檢測出主要致病菌成為奶牛乳房炎科學防控的前提。本實驗室前期調(diào)查結果表明，陜西部分地區(qū)奶牛乳房炎乳樣中蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌均占有較大比例，且蠟樣芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌耐藥情況較為嚴重。

近年來的研究建立了針對奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌等的多重PCR方法。馬保臣等[15]建立的四重PCR方法對牛奶中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和酵母菌單項檢測限度分別為104、102、103、103CFU/mL，該方法未進行4種病原菌混合樣品的敏感性測定。Ashraf A等[16]建立了包括產(chǎn)色葡萄球菌在內(nèi)的9種乳房炎病原菌的多重PCR方法，該方法雖然特異性強，敏感性達到50 pg/μL，但操作難度高且不易推廣。陳亞明[17]建立的單項PCR對無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌最低檢測限為0.1 pg/μL，對大腸埃希氏菌的最低檢測限0.01 pg/μL，雖然單項PCR靈敏度高，但其建立的多重PCR敏感性較單項PCR方法低。Shome B R等[19]建立的多重PCR對細菌組合的牛奶稀釋液提取的DNA進行檢測時表皮葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、溶血鏈球菌的最低檢測限為102CFU/mL，與本研究菌液靈敏度相似，但該方法仍需在菌液濃度范圍內(nèi)提取細菌基因組DNA進行檢測。王宇[20]建立了金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌綠的三重PCR方法，其靈敏度分別為5.97×10-2、6.68×10-2、5×10-2ng/μL，與本研究的DNA的最低檢測量分別為35.8、6.3、40.2 pg/μL的靈敏度相近。

本研究成功建立了能夠同時檢測蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的三重PCR方法，特異性好，對菌液以及DNA均具有較高靈敏度，對3種細菌菌液的最低檢測量分別為9.9×103、1.1×103、1.0×104CFU/mL；對臨床樣品的檢測與傳統(tǒng)細菌分離鑒定相比較，檢出率高。在檢測乳房炎病原菌時如果沒有檢測到大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌或鏈球菌等常見病原菌，尤其經(jīng)過常規(guī)用藥未見效果時，建議應用本研究建立的方法進行檢測以明確病原并采取相應的治療措施。與傳統(tǒng)的分離鑒定方法相比，本研究建立的三重PCR方法可以直接應用菌液作為模板進行PCR擴增而不需要提取細菌組DNA，明顯縮短了檢測時間，為明確引起乳房炎的病原菌的檢測補充了新的方法，并為畜牧生產(chǎn)中這3種細菌的快速檢測提供了有效方法。