TRV介導(dǎo)的小報(bào)春基因沉默技術(shù)體系的建立

付偲僮 司未佳 劉穎 程堂仁 王佳 張啟翔 潘會(huì)堂

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心 花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

基因功能驗(yàn)證常用的方法有轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、基因敲除和酵母雜交等，但大部分基因驗(yàn)證方法都依賴于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建步驟繁瑣、耗時(shí)，且依賴傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化體系的基因功能驗(yàn)證不適用于無穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的物種。因此在無遺傳轉(zhuǎn)化體系的物種中，基因沉默（gene silencing）驗(yàn)證則需要另辟蹊徑。

基因沉默是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的一種重要手段，是植物自身防御病毒入侵的一種自然機(jī)制。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用病毒載體攜帶植物目的基因片段，通過各種方式侵染植物，重組病毒在植物中復(fù)制產(chǎn)生雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），在植物自身防衛(wèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）的機(jī)制作用下，dsRNA進(jìn)一步產(chǎn)生siRNA（small interference RNA，siRNA），該產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)與其具有同源性的植物內(nèi)源目的基因mRNA的降解，根據(jù)表型變異來進(jìn)行基因功能分析，實(shí)現(xiàn)植物基因功能的快速鑒定［1］。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，VIGS技術(shù)具有沉默效率高、周期短、操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，并且不需要事先知道并克隆基因全長，也無需建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，只需要一段300-500 bp的基因片段就能快速獲得表型，進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證［2］。目前，已經(jīng)成為植物基因功能研究領(lǐng)域最具有吸引力的技術(shù)之一。煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）具有基因組較小，可以侵染植物生長點(diǎn)，不產(chǎn)生典型病毒性狀，便于改造等優(yōu)點(diǎn)，是目前在植物中應(yīng)用最廣泛、效果最好的 VIGS 病毒載體［3］，對包括番茄［4］、煙草［5］、辣椒［6］等在內(nèi)的植物有良好的侵染效果。

花柱異型現(xiàn)象能夠促進(jìn)異花授粉，是植物界經(jīng)典的適應(yīng)性范例，是被子植物多樣性形成的核心因素之一［7］。小報(bào)春作為典型的花柱二型植物，是研究花柱二型形成機(jī)制的理想材料。但是報(bào)春花屬植物的體外再生非常困難，關(guān)于報(bào)春花屬植物的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究較少。前人以歐報(bào)春葉片為外植體得到了愈傷組織［8］，Hayta等［9］報(bào)道了兩種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的歐報(bào)春遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，一種是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透幼苗，能夠?qū)崿F(xiàn)在歐報(bào)春中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化；一種是根癌農(nóng)桿菌感染的花梗外植體，平均轉(zhuǎn)化率為4.6%，具有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因整合和轉(zhuǎn)化到下一代的能力，但這一方法轉(zhuǎn)化效率低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因功能分析。因此，建立小報(bào)春VIGS基因沉默體系成為基因功能驗(yàn)證亟待解決的關(guān)鍵問題。

PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶，參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會(huì)影響植物番茄紅色的積累，番茄植株的綠色部分（葉子和綠色果實(shí)）因?yàn)槿狈υ撁付鴮?dǎo)致葉綠體對光極度敏感，出現(xiàn)典型光漂白表型，因此變成白色［3］。由于植物不同部位均出現(xiàn)容易觀察的沉默表型，PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應(yīng)用。

近年來，VIGS技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于番茄［4］、蘋果［10］、玉米［11］、棉花［12］、葡萄［13］等作物中，但尚沒有在小報(bào)春中建立VIGS體系的報(bào)道。

本研究以實(shí)驗(yàn)室培育的小報(bào)春新品種‘紅星’為試驗(yàn)材料，利用小報(bào)春的PDS（八氫番茄紅素脫氫酶）基因作為標(biāo)記基因，構(gòu)建TRV2-PfPDS重組載體，以期構(gòu)建小報(bào)春VIGS體系，為小報(bào)春的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 將小報(bào)春種子播種在穴盤中，置于北京林大林業(yè)科技有限公司的人工氣候室中，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間16 h，溫度22℃，黑暗時(shí)間8 h，溫度18℃，相對濕度60%。約2個(gè)月后將小報(bào)春的種苗移植到直徑10 cm的花盆里，一周后有新葉長出時(shí)用于侵染。另外，在濕潤的濾紙上播種小報(bào)春種子，分別培養(yǎng)至白色胚軸剛剛伸出和長出子葉2種發(fā)育階段，用于真空侵染。

1.1.2 病毒載體和菌株 TRV病毒載體pTRV1和pTRV2由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傅達(dá)奇教授惠贈(zèng)，載體圖譜如圖1所示，所選用大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)為DH5α（CD201-02，全式金，北京），農(nóng)桿菌感受態(tài)為GV3101（BC304-01，博邁德，北京）。

圖1 TRV1和TRV2載體圖譜Fig.1 Vector map of TRV1 and TRV2

1.2 方法

1.2.1 報(bào)告基因擴(kuò)增 從小報(bào)春轉(zhuǎn)錄組中篩選出小報(bào)春PDS基因（PfPDS）序列，在其ORF框內(nèi)選取302 bp長度的片段。參考In-fusion引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物（上游引物為5′-TTAAGGTTACCGAATTCAT ACCGGCTTGTGAC-3′，下游引物為 5′-GCTCGGTACC GGATCCGCAAATCGATGCACT-3′），由上海生工生物有限公司合成。反應(yīng)體系為cDNA 2 μL（80 ng/μL）、上游引物 2 μL（100 μmol/L）、下游引物 2 μL（100 μmol/L）、2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL 和 ddH2O 19 μL。離心混勻后按以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將正確的條帶切下后進(jìn)行回收。

1.2.2 重組載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對TRV2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為TRV2 質(zhì) 粒 1μg、BamH I 0.7 μL（10 U）、EcoR I 0.7 μL（10 U）、10×K Buffer 5 μL，ddH2O 補(bǔ) 至 50 μL。37℃酶切3-4 h后膠回收。將1.2.1得到的基因片段與線性TRV2載體通過In-fusion連接法，50℃15 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定陽性重組子。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的條帶的菌液送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 菌液制備及侵染 取5 μL測序正確的重組質(zhì)粒TRV2-PfPDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28℃培養(yǎng)2 d，挑取外形圓潤的單個(gè)菌斑于1 mL含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL慶大霉素、25 μg/mL利福平的液體LB培養(yǎng)基中28℃搖菌（150 r/min）培養(yǎng)。

以菌液∶誘導(dǎo)LB=1∶20的比例，將搖好的菌液轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)LB中（其中卡那霉素工作濃度為50 μg/mL，慶大霉素工作濃度為50 μg/mL，利福平工作濃度為25 μg/mL，MES工作濃度為10 mmol/L，AS工作濃度為20 μmol/L），在28℃下震蕩培養(yǎng)12-16 h（150 r/min）。

將培養(yǎng)好的誘導(dǎo)LB菌液以5 000 r/min離心5 min后，棄上清，用侵染液重懸菌體。將菌液調(diào)至所需濃度（OD600）后室溫下靜置3-4 h。最后將含有TRV1的菌液與含有TRV2-PfPDS的菌液按體積比1∶1混合，待用。

1.2.4 沉默體系的構(gòu)建 侵染方式：在同樣的OD600和侵染液配方的條件下，研究葉背注射、葉柄注射、真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗4種方式的侵染效率。具體方法如下：將OD600調(diào)至1.0，侵染液為無菌水中含有10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和 200 μmol/L AS。（1）葉背注射法 ：用 5 mL一次性注射器吸取侵染液并拔掉針頭，將注射器對準(zhǔn)葉片的背面，避開葉脈，用食指隔著葉片抵住注射口，將侵染液注入葉片中，以觀察到葉片呈現(xiàn)浸漬狀為宜。對每片葉進(jìn)行注射，確保侵染液進(jìn)入植株內(nèi)部。（2）葉柄注射法：用5 mL一次性注射器吸取侵染液后，用針頭輕輕劃傷葉柄（不能將葉柄折斷），在傷口處注射少量侵染液。為保證侵染液進(jìn)入植株內(nèi)部，對每個(gè)葉柄進(jìn)行注射。2種侵染方式各處理10株小報(bào)春。（3）真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗：將分別培養(yǎng)至種子剛露白和長出子葉的小報(bào)春用于真空滲透侵染，設(shè)置3種壓強(qiáng)（-25、-50和-75 kpa）及3種侵染時(shí)間（30 s、2 min和5 min），每組處理20粒種子。葉背注射、葉柄注射、真空滲透4種侵染方式均設(shè)置相應(yīng)的空載組和對照組。所有植株在侵染后遮光處理24 h，之后在人工氣候室（光照時(shí)間16 h，溫度22℃，黑暗時(shí)間8 h，溫度18℃，濕度60%）中培養(yǎng)。

菌液濃度與侵染液配方：設(shè)置4種侵染液配方及菌液OD600（表1），合計(jì)16組處理，每組處理設(shè)置對應(yīng)的空載組和對照組，采用葉背注射法侵染5株小報(bào)春，所得數(shù)據(jù)使用SPSS和Excel軟件進(jìn)行分析。

表1 侵染液菌液濃度及配方Table 1 OD600 value and combinations of infiltration liquid

提取出現(xiàn)白化表型植株不同部位的RNA，同時(shí)提取空載組和對照組的RNA，分別反轉(zhuǎn)為用于載體檢測和表達(dá)量檢測的2種cDNA，用于載體檢測的cDNA使用TIANScript RT Kit（KR104，天根，北京）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用于表達(dá)量檢測的cDNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser（RR-047A，TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作見試劑盒說明書，引物詳細(xì)信息見表2。

表2 病毒載體檢測及表達(dá)量檢測引物Table 2 Primers for viral vector detection and gene expression level detection

2 結(jié)果

2.1 小報(bào)春VIGS體系的最佳侵染方式

比較葉背注射、葉柄注射、真空滲透種子和真空滲透具有兩片子葉的幼苗4種侵染方式的侵染效率，OD600均為1.0，侵染液均為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES。侵染后第16天首次觀察到白化現(xiàn)象，白化現(xiàn)象均出現(xiàn)在新生的葉片上，侵染40 d后不再有新的植株出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖2），白化植株表型持續(xù)變化，一直到開花，白化現(xiàn)象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現(xiàn)（圖3）。通過葉背注射法侵染小報(bào)春的效率達(dá)60%，而葉柄注射法的侵染效率為30%。真空滲透侵染法無論是侵染剛露白的種子還是帶兩片子葉的幼苗，白化現(xiàn)象均不如注射法侵染的植株表現(xiàn)明顯，僅在葉脈處出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖4），利用這兩種方法首次觀察到白化現(xiàn)象是在侵染37 d后。兩種方法中，帶兩片子葉的幼苗要比剛伸出胚軸的種子侵染效率高。對于剛剛伸出胚軸的種子，壓強(qiáng)為-25 kpa時(shí)侵染效率最高，且侵染時(shí)間越長效率越高，而對于兩片子葉的幼苗，壓強(qiáng)為-75 kpa時(shí)侵染效率最高，侵染效率與侵染時(shí)間長短無關(guān)（表3）。綜上所述，小報(bào)春最佳的侵染方式為葉背注射法。

表3 真空滲透法侵染小報(bào)春萌發(fā)種子和帶子葉幼苗的效果Table 3 Infection efficiency on P.forbesii when seeds with hypocotyl and cotyledons infected by vacuum infiltration

圖3 PfPDS沉默后小報(bào)春的白化現(xiàn)象Fig.3 Whole plant albino after PfPDS gene silenced in P.forbessii

圖4 真空滲透法侵染小報(bào)春后PDS基因的沉默效果Fig.4 Silencing effect of PDS gene in P.forbesii infected by vacuum infiltration method

2.2 小報(bào)春VIGS體系的最佳菌液濃度與侵染液配方

以葉背注射法侵染葉片，在侵染16 d后開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，在侵染20 d后不再出現(xiàn)新的白化植株，最高侵染效率為40%，空載組和對照組無明顯變化（圖2）。從16組處理結(jié)果來看（表4），侵染效率沒有表現(xiàn)出與OD600或侵染液配方具有明顯的相關(guān)性。結(jié)合2.1的結(jié)果，綜合考慮節(jié)約藥品與操作的方便性，選擇OD600為1.0，侵染液配方為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES 作為最佳的菌液濃度和侵染液配方。

表4 不同OD600與侵染液配方侵染小報(bào)春的效率Table 4 Infection efficiency of different OD600 values and different formula of infiltration liquid on P.forbesii

圖2 注射法侵染小報(bào)春后PDS基因沉默效果Fig.2 Silencing effect of PDS gene infection in P.forbesii

2.3 病毒載體檢測與表達(dá)量檢測

利用TRV病毒載體上的引物（表2）進(jìn)行PCR，在出現(xiàn)白化現(xiàn)象的植株和空載組中均檢測到了TRV1和TRV2病毒載體，對照組中沒有檢測到2種病毒載體（圖5），說明不同的侵染方式都能使攜帶有病毒載體的菌液進(jìn)入植株內(nèi)部，并且病毒載體能夠轉(zhuǎn)移到新生器官中，出現(xiàn)白化現(xiàn)象的植株P(guān)fPDS表達(dá)量顯著低于空載組和對照組。而真空滲透法侵染的植株P(guān)fPDS下調(diào)不明顯，沉默效率低，表型變化小（圖6）。比較基因沉默后小報(bào)春不同部位PDS基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)葉片、花梗、萼片中PfPDS TRV2植株P(guān)DS基因表達(dá)量均顯著低于空載組和對照組（圖7）。

圖5 基因沉默后小報(bào)春植株病毒載體檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of virus vector in P.forbessii after gene silencing

圖6 使用不同方法基因沉默后小報(bào)春PDS基因的表達(dá)量檢測Fig.6 Detection results of PDS gene expression after gene silencing by different methods

圖7 基因沉默后小報(bào)春植株不同部位PDS基因的表達(dá)量檢測Fig.7 Detection of PDS gene expression in different parts of P.forbessii after gene silencing

3 討論

小報(bào)春是報(bào)春花科報(bào)春花屬的典型花柱異型植物，本研究構(gòu)建的小報(bào)春VIGS體系能夠使白化植株表型持續(xù)變化，一直到開花，白化現(xiàn)象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現(xiàn)。說明病毒載體能夠在植株內(nèi)部轉(zhuǎn)移并且在花部器官能夠表達(dá)，該體系能夠用于研究花柱異型以及其它性狀如花香、耐熱等科學(xué)問題。

確保帶有重組載體的菌液進(jìn)入植株體內(nèi)，是VIGS技術(shù)成功與否的決定性因素。不同植物有各自最適的侵染方式，本研究所用的注射侵染法適用于肉質(zhì)、柔軟的葉片，如番茄的子葉、煙草的幼嫩真葉，該類葉片組織結(jié)構(gòu)松軟，注射器造成較小的傷口后即可利用壓力將侵染液快速的浸潤到整個(gè)葉片從而完成侵染；該方法不適合葉片比較薄而脆、葉脈較多的植物，如大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）和小麥（Triticum aestivum）等。這類植物葉片較窄、偏紙質(zhì)，用真空滲透侵染法侵染種子具有較好效果。Zhang等［14］利用抽真空方式使帶有PDS基因的病毒載體進(jìn)入發(fā)芽的小麥和劃傷的玉米種子中，最終獲得全株白化的苗子。許多木本植物葉片與草本植物相比偏革質(zhì)或蠟質(zhì)，較難侵染。利用幼嫩的扦插苗或組培苗則會(huì)更容易侵染，在月季（Rosa chinensis）和觀賞海棠（Malus spectabilis）的研究中有采用真空滲透侵染法侵染組培苗的報(bào)道［15-16］。針對具體物種構(gòu)建最適的體系是十分必要的。

八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶，參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會(huì)影響植物番茄紅色的積累，番茄植株的綠色部分（葉子和綠色果實(shí)）因?yàn)槿狈υ撁付鴮?dǎo)致葉綠體對光極度敏感，出現(xiàn)典型光漂白表型，綠色的植物葉片因此變成白色［8］。由于植物不同部位均出現(xiàn)容易觀察的沉默表型，PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應(yīng)用，但其最大缺點(diǎn)是破壞了葉綠體而影響植物的正常生長發(fā)育。通常研究植物的葉片表型時(shí)建議使用PDS基因，如要研究果實(shí)表型，則以番茄紅素合成酶基因PSY1為佳，因?yàn)樵摶虺聊笾粫?huì)導(dǎo)致紅色的果實(shí)變成黃色，不會(huì)導(dǎo)致植物綠色部分發(fā)生顏色變化［17］。

Fu等［18］利用多種侵染方式對番茄果實(shí)中控制果實(shí)成熟相關(guān)的基因進(jìn)行沉默后，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)果實(shí)上會(huì)同時(shí)出現(xiàn)綠色未成熟和紅色成熟的兩種狀態(tài)，但出現(xiàn)表型的部位僅在侵染的部位，不會(huì)出現(xiàn)在未侵染的部位。本研究中，幼苗期侵染葉片后，在整個(gè)植株的各個(gè)部位均有白化現(xiàn)象出現(xiàn)，說明病毒會(huì)在植株內(nèi)轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移的能力可能與侵染的部位和時(shí)期有關(guān)，病毒更傾向于向新生部位轉(zhuǎn)移。王旭等［19］將含有pTRV2-PDS菌液注射到刺萼龍葵葉背和幼根處，光漂白現(xiàn)象不僅在葉片上出現(xiàn)，在部分花瓣上也出現(xiàn)了白化現(xiàn)象。

VIGS是一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)，由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化基因沒有結(jié)合到染色體上，所以VIGS基因沉默是不穩(wěn)定的，侵染一段時(shí)間后沉默效果會(huì)有所衰減，表型也會(huì)恢復(fù)［20］。大部分研究所報(bào)道的VIGS表型持續(xù)時(shí)間較短，從3周到3個(gè)月不等［21-23］。小報(bào)春作為一種二年生植物，開花結(jié)實(shí)后會(huì)自然死亡。但在長日照條件下，延長小報(bào)春營養(yǎng)生長時(shí)間便可延長其整個(gè)生命周期。一些植株從幼苗期侵染至結(jié)實(shí)后衰老死亡整個(gè)過程中都持續(xù)表現(xiàn)白化現(xiàn)象，說明病毒載體能在小報(bào)春體內(nèi)存活較長的時(shí)間，可達(dá)12個(gè)月左右。由于沉默效果持續(xù)較長，大大提高了VIGS技術(shù)在小報(bào)春相關(guān)研究中的實(shí)用性，有望在小報(bào)春基因功能研究中發(fā)揮積極作用。

4 結(jié)論

構(gòu)建了PfPDS-TRV2載體，探索了最佳侵染部位、侵染液配方、菌液濃度和侵染方式，用含有200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）、10 mmol/L MgCl2和10 mmol/L乙磺酸緩沖液（MES）的侵染液，將菌液OD600分別調(diào)至1.0，混合后通過葉背注射方式侵染小報(bào)春能夠有效地沉默基因，侵染效率達(dá)60%，沉默表型可持續(xù)12個(gè)月，并能在小報(bào)春植株的各部位（從葉片到萼片）均起到沉默作用。