大豆耐鹽種質(zhì)的篩選及其耐鹽生理特性分析

石廣成 楊萬明 杜維俊 王敏

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，榆次 030600）

土壤鹽漬化導(dǎo)致全球耕地面積不斷的減少，并極大程度限制著作物產(chǎn)量和品質(zhì)的提高［1］。我國鹽漬土分布十分廣泛，其面積已經(jīng)超過9 000 萬hm2，而且由于全球氣溫的升高，人們對化肥的不合理使用，以及環(huán)境污染，使土壤鹽漬化越來越嚴重，對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展造成了嚴重的威脅［2］。栽培大豆屬于中度耐鹽農(nóng)作物，它所能夠承受的土壤鹽度閾值為5.0 ds/m，如果土壤的鹽度從5.0 ds/m提升至10.2 ds/m時，大豆植株的死亡率和葉片的壞死將大大的提升，葉緣卷曲、葉片枯萎黃化或者葉片缺綠，最終導(dǎo)致大豆產(chǎn)量和品質(zhì)下降，其中鹽敏感品種所受的影響比耐鹽品種更大［3］。因此，對耐鹽品種的篩選是應(yīng)對鹽堿土壤危害的一個有效措施。

不同的大豆品種之間，其耐鹽性存在差異［4-5］，為挖掘大豆種質(zhì)資源的耐鹽品種，邵桂花等［6］通過咸水澆灌大田，對1 716份大豆品種進行耐鹽性鑒定，篩選出了85-140、早熟6號等敏鹽品種和鐵豐8號、文豐7號等耐鹽品種。劉光宇等［7］通過水培法利用100 mmol/L NaCl對29份大豆脅迫處理，進行耐鹽性鑒定。牛遠等［8］利用徐豆14、臨豆10、中黃55和合豆3號大豆為試驗材料，通過不同的鹽濃度對大豆芽期和苗期生長的影響，評價了不同大豆品種的耐鹽能力。羅慶云等［9］用石英砂作為基質(zhì)，通過澆含有不同濃度NaCl的營養(yǎng)液進行脅迫處理，鑒定了6個大豆品種的耐鹽特性。Valencia等［10］在光照培養(yǎng)箱中通過液營養(yǎng)水培法鑒定出Lee68等耐鹽品種。Lee等［11］在溫室中使用100 mmol/L NaCl，利用土培法對14個大豆品種進行鑒定，鑒定出了PI506820、Hartwing等5個耐鹽品種。本研究采用致死濃度作為苗期大量材料的耐鹽性初篩，方法更為簡單。

鹽漬土對植物的主要影響表現(xiàn)為降低植物種子發(fā)芽率、出苗率以及成活率和生物量積累，使植物葉片失綠甚至提前死亡［12］。鹽漬土對植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫以及氧化脅迫，而這些脅迫主要是由于Na+和Cl-在植物不同組織中不斷積累，影響膜的滲透性，從而改變了植物對離子的吸收，導(dǎo)致離子吸收不平衡，進而對植物的生長產(chǎn)生了一系列的毒害作用［13］。大豆耐鹽性的強弱可以體現(xiàn)在植株不同的形態(tài)和生理響應(yīng)之上。不同研究者采用不同指標對耐鹽性進行評價。張翠平等［14］通過對不同大豆品種葉片光合指標，鑒定了18份大豆品種的耐鹽性。張海波等［15］利用150 mmol/L NaCl脅迫后，對不同大豆品種表型測定以及MDA、SOD和游離Pro的含量變化，比較了4個不同大豆品種的耐鹽性。

由于耐鹽性鑒定條件和指標眾多，確定較為困難，使得耐鹽機理研究不夠深入。本研究通過致死濃度的方法對332份材料進行耐鹽性初篩，并結(jié)合表型性狀和生理性狀等指標進行全面評價，試圖探尋不同耐鹽性大豆品種的形態(tài)和生理響應(yīng)。同時期望能夠挖掘更多的大豆耐鹽性種質(zhì)資源為大豆耐鹽育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試332份大豆種質(zhì)材料由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種室提供，以國際公認耐鹽品種Lee68和敏鹽品種Jackson作為對照材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗方法采用王聰?shù)龋?6］方法進行，具體如下：將大豆種子播種于50穴的育苗盤中，以蛭石作為基質(zhì)，每穴2株，3次重復(fù)，采用隨機區(qū)組設(shè)計。待到真葉完全展開后對其進行NaCl脅迫處理。將NaCl溶于1/4的Hoagland營養(yǎng)液之中，每隔2 d澆液1次，每個育苗盤澆1.5 L。脅迫的起始濃度為70 mmol/L，以后每次更換營養(yǎng)液時以30 mmol/L遞增，為了更準確地評價該品種的致死濃度，當(dāng)NaCl濃度達到190 mmol/L時，每次澆液以10 mmol/L遞增，然后統(tǒng)計各個品種的致死濃度（植株2/3以上葉片黃化、萎蔫即可視其為死亡，死亡時濃度視為該品種的致死濃度）。以敏鹽品種Jackson和耐鹽品種Lee68的致死濃度作為參考標準，對不同的大豆品種進行耐鹽性分類。

根據(jù)初篩結(jié)果，分別從不同的耐鹽等級中各選擇1個代表性品種，以耐鹽品種Lee68和敏鹽品種Jackson作為對照品種。根據(jù)品種在不同濃度下的表現(xiàn)及劉謝香等［17］的耐鹽性鑒定方法，選擇濃度為150 mmol/L NaCl溶液脅迫處理。將品種播種于盛有蛭石的花盆中，每盆播種5粒，再覆蓋1 cm蛭石。待子葉完全展開后間苗，每盆留苗2株。待真葉完全展開后進行處理，以60 mL 150 mmol/L的NaCl溶液脅迫處理，等量清水為對照，每2 d澆液一次，共澆5次后取材，對各項指標進行測定。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 形態(tài)性狀的測定 將植株從基質(zhì)中取出，洗凈其上的基質(zhì)，用濾紙吸干表面的水分。用卷尺測量植株的根長和株高。然后將樣品置于105℃殺青15 min，調(diào)至80℃烘干至恒重，分別稱量其地上部和地下部干重。

1.2.2.2 植物離子含量的測定 將烘干的植株根、莖、葉分別稱取0.05 g，用研缽磨成粉末狀，樣品處理參考王寶山等［18］的方法。將樣品加入一定量的去離子水中，100℃水浴鍋中煮沸1.5 h，冷卻后定容，6 000 r/min離心5 min，上清液用于離子測定。取10 mL樣品上清液定容至100 mL，使用6400A 型火焰光度計測定Na+、K+的含量。參考雷啟福等［19］和周強等［20］的方法取 5 mL 樣品上清液，加入2 mL硝酸溶液（V濃硝酸∶V水=1∶1）和2 mL丙酮，使用5 mg/mL硝酸銀溶液定容至25 mL，使用UV1100紫外可見光分光光度計測定Cl-含量。

1.2.2.3 葉片SPAD值的測定 用SPAD-502型葉綠素測定儀測定大豆植株葉片葉綠素的含量。每盆植株選2片真葉的3個不同部位進行測定，3次重復(fù)。

1.2.2.4 光合指標的測定 在上午9點至下午13點，使用LI-6400型便攜式光合作用測定系統(tǒng)，測定5個大豆品種的幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)，主要包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間二氧化碳（Ci）及蒸騰速率（Tr）。采用固定紅藍光源進行試驗，光強為1 200 μmol/m2/s，溫度25℃，空氣流速為0.5 L/min，相對濕度60%，3次重復(fù)。

1.2.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel 2007，差異顯著性分析采用DPS9.01軟件進行相關(guān)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 NaCl脅迫下不同大豆品種的表型分析

在332份栽培大豆供試品種中，致死濃度為250 mmol/L時的品種數(shù)量最多，共計83份，占總材料的25%；其次是致死濃度為240 mmol/L時的品種，共計70份，占總材料的21.1%。致死濃度為190 mmol/L的敏鹽材料2份，占0.6%；致死濃度為為270 mmol/L的品種15份，占4.5%；致死濃度為280 mmol/L的耐鹽品種3份，占0.9%（圖1）。結(jié)果表明，大豆品種間的耐鹽差異性比較大，中度耐鹽品種占比最大。致死濃度鑒定結(jié)果在所測資源中基本呈正態(tài)分布。

圖1 不同濃度NaCl處理后332份栽培大豆死亡情況Fig.1 Death of 332 cultivated soybeans treated with different concentrations of NaCl

本試驗中敏鹽品種Jackson的致死濃度為200 mmol/L，篩選出較Jackson更為對鹽脅迫敏感的材料2份，分別為陜西八月黃和中黃80，篩選出與Jackson對敏鹽程度相當(dāng)?shù)牟牧?份，分別為天鵝蛋、岢嵐黃豆和荷豆15。本試驗中耐鹽品種Lee68致死濃度為270 mmol/L，篩選出較Lee68更耐鹽的材料3份，分別為沁源大黑豆、運城扁黑豆和農(nóng)科6號，篩選出與Lee68耐鹽程度相當(dāng)?shù)牟牧?4份，其中4份為育成品種，8份地方品種，2份本實驗室育成的品系。這些材料可作為耐鹽性研究和耐鹽育種的基礎(chǔ)材料（表1）。

表1 不同大豆品種的NaCl致死濃度Table 1 Lethal concentrations of NaCl in different soybean varieties

通過致死濃度鑒定后，分別選擇耐鹽級別不同的3個品種進行進一步的鑒定。不同耐鹽品種在150 mmol/L NaCl脅迫10 d后的表型癥狀見圖2。敏鹽品種陜西八月黃和Jackson的葉片枯黃卷曲嚴重，中度耐鹽品種晉大70葉片只有小部分失綠，高度耐鹽品種汾豆105和Lee68保持正常的生長，并未看到有相應(yīng)的鹽害癥狀。

圖2 150 mmol/L NaCl脅迫下大豆品種苗期表型癥狀Fig.2 Phenotypic symptoms of soybean varieties at seedling stage under 150 mmol/L NaCl stress

2.2 NaCl脅迫對大豆苗期干重、株高及根長的影響

在150 mmol/L的NaCl脅迫下所有大豆品種植株干重、株高及根長均低于對照，說明150 mmol/L NaCl脅迫對這5個大豆品種的生長均產(chǎn)生了抑制作用。汾豆105的相對干重、相對株高和相對根長均顯著高于陜西八月黃和晉大70，且晉大70顯著高于陜西八月黃（表2）。說明汾豆105的耐鹽性最強，晉大70次之，陜西八月黃耐鹽性最弱，其與致死濃度鑒定結(jié)果相一致。表明致死濃度鑒定可以作為一種快速有效的耐鹽性鑒定手段。另外汾豆105的相對干重和相對根長均顯著高于國際公認耐鹽材料Lee68，而陜西八月黃的相對株高和相對根長均顯著低于國際公認敏鹽材料Jackson。這兩個材料可以作為耐鹽性研究的基礎(chǔ)材料。

表2 NaCl脅迫對大豆植株干重、株高及根長的影響Table 2 Effects of NaCl stress on the plant dry weight，plant height and root length of soybean

2.3 NaCl脅迫對大豆苗期不同部位離子含量的影響

2.3.1 NaCl脅迫對Cl-分布的影響 植物吸收過量Cl-，會造成離子毒害現(xiàn)象，導(dǎo)致大量細胞死亡，進而抑制植物生長。在本研究中，鹽脅迫后大豆植株的根、莖和葉中的Cl-相較于對照都有不同程度升高。在根中，陜西八月黃和晉大70的Cl-分別上升5.51%和8.82%，相較于對照，變化不顯著；汾豆105相較于對照，在根中的Cl-上升了243.04%，顯著高于對照；Lee68和Jackson與對照相比均顯著上升，分別上升了107.66%和96.21%。在莖中陜西八月黃、晉大70、汾豆105、Jackson和Lee68的Cl-含量均顯著上升，分別上升了396.67%、296.09%、226.94%、372.26%和177.96%，就其上升幅度而言，陜西八月黃＞Jackson＞晉大70＞汾豆105＞Lee68。在葉中，陜西八月黃、晉大70、汾豆105、Jackson、Lee68和汾豆105相較于對照均呈顯著關(guān)系，其中Jackson上升幅度最大，上升745.90%，陜西八月黃次之，上升498.35%；汾豆105上升幅度最小，上升239.29%（圖3）。

圖3 鹽脅迫下各大豆品種苗期不同組織中Cl-含量分析Fig.3 Analysis of Cl- content in different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.3.2 NaCl脅迫對Na+分布的影響 植物細胞中的Na+離子過多時，它會取代原細胞膜上的鈣離子，使膜產(chǎn)生滲漏現(xiàn)象，使核酸和蛋白質(zhì)的合成分解平衡受到破壞，從而影響著植物的生長與發(fā)育。本研究中，鹽脅迫后大豆不同品種的不同組織中Na+均有不同程度的上升。在根中耐鹽品種Lee68和汾豆105的上升幅度最大，分別上升了323.31%和200.51%；晉大70的上升幅度次之；敏鹽品種陜西八月黃和Jackson上升幅度最小，分別上升了112.80%和121.58%。在莖中不同組織的Na+的變化趨勢與在根中的變化趨勢相似，上升幅度較根大。在葉中，Na+的上升幅度的變化規(guī)律與根和莖相反，耐鹽品種Lee68和汾豆105的上升幅度最小，晉大70次之，敏鹽品種Jackson和陜西八月黃的上升幅度最大，分別上升了403.34%和592.02%（圖4）。

圖4 鹽脅迫下各大豆品種苗期不同組織中Na+含量分析Fig.4 Analysis of Na+ content in the different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.3.3 NaCl脅迫對K+分布的影響 植株K+可以提高其抵御鹽脅迫的能力，充足的K+可以維持較高K+/Na+，對于避免鹽脅迫植物生長受到抑制具有重要意義。在本研究中，鹽脅迫后大豆的根和莖組織的K+含量相較于對照而言均有不同程度的下降。其中在根組織中除Lee68與對照呈不顯著關(guān)系（P＜0.05），其它均顯著降低，其中高度耐鹽品種汾豆105下降了27.93%、中度耐鹽品種晉大70下降了29.80%、敏鹽品種陜西八月黃下降了30.18%，Jackson下降了52.75%；在莖中，敏鹽品種陜西八月黃、Jackson，以及中度耐鹽品種K+含量均下降，耐鹽品種汾豆105和Lee68均有不同程度的上升其中汾豆105與對照呈顯著關(guān)系（P＜0.05），Lee68上升不顯著；在葉中，除高度耐鹽品種汾豆105的K+上升不顯著其余均顯著上升（圖5）。

圖5 鹽脅迫下各大豆品種苗期不同組織中K+含量分析Fig.5 Analysis of K+ content in different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.4 鹽脅迫對不同品種大豆葉片光合特性的影響

在150 mmol/L NaCl脅迫處理后，不同大豆品種相較于對照，SPAD均有顯著性的變化（表3）。其中陜西八月黃和Jackson在鹽脅迫后，SPAD值分別為20.56和27.37，相比對照分別下降了31.29%和17.94%；而晉大70、汾豆105和Lee68的SPAD值相較對照均上升，分別上升1.80%、7.60%和15.89%。表明耐鹽品種在鹽脅迫下SPAD值上升幅度大，中等耐鹽品種表現(xiàn)出SPAD值小幅上升，而敏鹽品種表現(xiàn)出SPAD值下降。

表3 NaCl脅迫對不同大豆品種光合指標的影響Table 3 Effects of NaCl stress on photosynthetic indices of different soybean varieties

不同品種的大豆葉片凈光合速率（Pn）在鹽脅迫后均顯著低于對照，相較于對照而言，Lee68和汾豆105下降幅度最低，分別下降了37.19%和49.21%。Jackson和陜西八月黃下降幅度最高，分別為96.66%和80.06%。除Jackson外，其他品種的胞間CO2濃度（Ci）相較于對照均顯著下降。不同大豆品種葉片蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）相較于對照均顯著降低，其中Lee68的下降幅度最低，其次是汾豆105，其他3個品種下降幅度較高，均高于80%。

3 討論

3.1 致死濃度鑒定的可靠性

大豆耐鹽種質(zhì)篩選和大豆耐鹽生理研究對于實踐生產(chǎn)具有重要的意義。國內(nèi)外學(xué)者采用了不同的方法對大豆苗期的耐鹽性進行了評價鑒定。邵桂花等［21］通過抽取地下咸水和地上的淡水配置成灌溉用的鹽水，建立了以葉片鹽害癥狀評定大豆耐鹽性的田間鑒定方法。該方法方便快捷，適用于大批量的種質(zhì)鑒定。但田間灌溉會導(dǎo)致鹽分分布不均勻，而且容易受氣溫、地力、降水、日照和風(fēng)力的影響。羅慶云等［22］利用水培的方法對大豆苗期的品種進行耐鹽性鑒定。該研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫降低了種子的出苗速率，影響了幼苗的正生長，但是需要多次的更換營養(yǎng)液，費時費力。本研究將蛭石作為基質(zhì)，致死濃度作為評價指標進行大豆耐鹽性篩選，在遮雨棚下利用自然光溫條件進行大豆種質(zhì)資源的耐鹽性鑒定。與田間鑒定法相比較，該方法不受地力、降水等影響。同時，蛭石吸水迅速，有利于保持土壤鹽分的相對穩(wěn)定，而且此種方法相較于水培法，更接近于大豆生長的實際環(huán)境情況，且鑒定方法較為簡便、經(jīng)濟、快速。就其鑒定結(jié)果而言，其中致死濃度最低是190 mmol/L，致死濃度最高為280 mmol/L，這與張玉梅等［23］報道相一致，即不同大豆品種之間的耐鹽性差異很大。在此基礎(chǔ)上，用表型性狀（干重、株高和根長）、生理指標（植株不同組織中Na+、K+、Cl-及葉片的相對電導(dǎo)率）以及光合指標（SPAD、Pn、Ci、Tr和Gs）為評價指標，對耐鹽級別不同的3個大豆品種陜西八月黃（敏鹽）、晉大70（中度耐鹽）、汾豆105（耐鹽）進行了進一步的鑒定。結(jié)果表明汾豆105較其余兩個有較強的耐鹽性，晉大70次之，陜西八月黃的耐鹽性最弱。上述鑒定結(jié)果與致死濃度鑒定結(jié)果一致，說明致死濃度作為大豆苗期耐鹽性鑒定評價指標是可靠的，可用其進行大批量大豆種質(zhì)耐鹽性篩選。

3.2 NaCl脅迫對大豆苗期離子含量的影響

鹽脅迫是通過離子毒害、滲透脅迫以及營養(yǎng)不平衡3個方面影響植株的生長［24］。其中離子毒害和滲透脅迫對植物傷害最為嚴重，不僅影響植物對離子的選擇性吸收，而且還會擾亂植物體內(nèi)離子平衡，導(dǎo)致植物生理紊亂。其中植物不同部位離子濃度的變化是其直接的表現(xiàn)［25］。有研究認為，耐鹽大豆拒Na+主要通過根部組織和莖部組織［26］。於丙軍等［27］得出耐鹽大豆的根部和莖部不僅拒Na+，而且還拒Cl-。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐鹽品種汾豆105、Lee68和晉大70的根組織對于Na+的吸收相對較多，通過莖運輸?shù)饺~片中較少，主要積累在根莖之中。莖和葉的Na+/K+值較低。對于敏鹽品種陜西八月黃和Jackson，其根部Na+的增幅較小，通過莖部組織在葉中積累較多，葉中的Na+/K+比較高。對于Cl-在不同組織中的分布規(guī)律與Na+相類似。敏鹽品種陜西八月黃和Jackson的Cl-在葉中增幅較大，而在根中Cl-的增較小，對于耐鹽品種而言與其相反。

3.3 NaCl脅迫對大豆苗期光合性能和SPAD的影響

植物光合作用對外界環(huán)境條件的改變非常敏感，它會隨著生長環(huán)境的變化而發(fā)生改變。NaCl脅迫對植物光合作用會產(chǎn)生很大的影響，當(dāng)植物受到鹽脅迫后，會導(dǎo)致葉片失水，氣孔關(guān)閉，二氧化碳供應(yīng)不足，進而導(dǎo)致光合反應(yīng)下降［28-29］。鹽脅迫對植物光合的影響主要是氣孔限制和非氣孔限制。但是氣孔限制還是非氣孔因素現(xiàn)在存在爭論［30］。一般認為，在鹽脅迫下植物的凈光合速率下降，氣孔導(dǎo)度下降，而胞間二氧化碳的濃度下降，這種情況視為氣孔限制。反之，如果葉肉細胞的光合能力下降，即使氣孔導(dǎo)度下降，胞間二氧化碳的濃度也會上升或者不變［31］。在本研究中，鹽脅迫下5個大豆品種的凈光合速率（Pn）、胞間二氧化碳濃度（Ci）、葉片蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）幾乎均有不同程度的下降。凈光合速率最能夠直接反映出植物單位葉面積的物質(zhì)生產(chǎn)能力［32］。敏鹽品種陜西八月黃和Jackson的凈光合速率下降幅度均大于耐鹽品種汾豆105、晉大70和Lee68。主要由于耐鹽品種較敏鹽品種更能夠有效的避免Na+和Cl-進入到葉片之中，以維持較高的光合特性，使耐鹽大豆植株能夠正常生長［33］。對于葉綠素（SPAD）而言，除陜西八月黃和Jackson相對于對照下降外，其余均小幅度的上升。可能是由于耐鹽品種Lee68、汾豆105和晉大70的根和莖阻拒了大量的Na+、Cl-，使流向葉片的離子減少，葉片受的影響較小，進而對植株的光合作用影響較小，而敏鹽品種Jackson和陜西八月黃的根阻滯能力較小，使大量的Na+和Cl-流向植株葉片，活性氧大量的積累導(dǎo)致氧化破壞，加快了葉綠素的降解［34］。綜上，說明不同耐鹽等級品種的不同組織離子積累情況，直接影響著植物的光合作用。

4 結(jié)論

以NaCl致死濃度為評價指標，從332份大豆種質(zhì)資源篩選出6份敏鹽材料和18份耐鹽材料。在150 mmol/L NaCl脅迫下，大豆植株的干重、株高和根長均下降，耐鹽品種較與敏鹽品相比下降幅度??；耐鹽品種植株根和莖對Na+和Cl-的積累較多，葉中積累較少，而敏鹽品種與其相反；耐鹽品種汾豆105、Lee68和晉大70的SPAD上升，而敏鹽品種Jackson和陜西八月黃的SPAD均下降；不同品種的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均顯著下降，其中敏鹽品種下降幅度大于耐鹽品種。