利用RNA-Seq鑒定調(diào)控甘藍(lán)型油菜葉片光合特性的低溫脅迫應(yīng)答基因

金姣姣 劉自剛 米文博 徐明霞 鄒婭 徐春梅 趙彩霞

（1.隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院 隴東旱地作物種質(zhì)改良及產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 甘肅省旱地冬小麥種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心，慶陽 745000；2.甘肅省共建干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，拉薩 860000）

低溫會引起大豆、玉米、水稻等播期推后，生育期延遲［1］，是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素［2-3］，油菜作為中國主要的油料作物之一，也深受低溫傷害［4］。長江中下游地區(qū)，甘藍(lán)型油菜開花期倒春寒頻發(fā)，光合作用被明顯抑制，光合產(chǎn)物供應(yīng)不足，造成落花落果，產(chǎn)量嚴(yán)重降低［5］。因此，研究甘藍(lán)型油菜低溫誘導(dǎo)光合特性，挖掘響應(yīng)低溫、調(diào)控光合作用的潛在基因，明確這些基因的分子功能和代謝途徑意義重大。

低溫主要是通過影響植物葉片、根系、生長點(diǎn)、花和果實［6-7］，從而引起滲透物質(zhì)、光合參數(shù)［8-9］、光合作用、呼吸作用及抗氧化酶系統(tǒng)等生理生化變化，造成植物發(fā)育不良、新陳代謝和分子功能障礙而，甚至死亡［10-11］。光合作用是植物營養(yǎng)器官構(gòu)成的主要途徑，低溫脅迫能引起小麥光合速率、蒸騰速率、葉片氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度的等光合參數(shù)下降［11-12］，抑制植物光合色素含量和光合作用等生理過程［13-16］。而葉綠體作為植物進(jìn)行光合作用的主要細(xì)胞器，低溫脅迫后，葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，通過降低葉綠素含量來降低葉片對光的捕捉利用能力［14］，基粒片層模糊，數(shù)目減少，嗜餓顆粒數(shù)目增加，淀粉顆粒含量下降甚至消失［15］。

近年，隨著分子生物技術(shù)的不斷提高，已經(jīng)成功分離出很多低溫脅迫響應(yīng)基因［16-18］和抗凍蛋白［19-20］，比如 RbohB［21］、COLD1［22］和 幾丁質(zhì)酶基 因（BnCHB4）［23］，COR［24］、ICE［25］、HSF［26］、CBF［27］等抗凍蛋白。目前，組學(xué)分析在甘藍(lán)型油菜上的研究比較成熟，但基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析響應(yīng)低溫脅迫的光合調(diào)控機(jī)制研究較少。

本研究通過測定葉片超顯微結(jié)構(gòu)和光合氣體參數(shù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，探究低溫脅迫下甘藍(lán)型油菜葉片光合調(diào)控途徑，揭示低溫脅迫下甘藍(lán)型油菜參與光合調(diào)控的關(guān)鍵候選基因，為解析甘藍(lán)型油菜光合特性對低溫脅迫的響應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜NF24和17NS來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜課題組選育的純合品系。品系17NS為耐寒品系；品系NF24為低溫敏感材料。

1.1.1 實驗設(shè)計 采用盆栽實驗。將飽滿干凈大小一致的種子置于以兩層濾紙為發(fā)芽床的培養(yǎng)皿中，人工氣候箱25℃（6 000 lx光照25℃/14 h和20℃/10 h）培養(yǎng)20 h，種子萌發(fā)后點(diǎn)播于營養(yǎng)基質(zhì)和蛭石以3∶1混合的花盆中，每個品系至少種6盆，每盆定苗3株。人工光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)生長，光照25℃/14 h和20℃/10 h，相對濕度40%，待幼苗長至5-6葉期，低溫-4℃光照培養(yǎng)箱開始低溫處理0和24 h，其中2盆用于拍照，兩盆用于測定光合指標(biāo)，其余兩盆用于取樣。

1.1.2 取樣 帶口罩和無菌無酶手套，采集照片、測定光合參數(shù)和取完全展開的新葉待測樣，滅菌的up水沖洗干凈后液氮速凍，于-70℃超低溫冰箱保存，用于測定試驗各個指標(biāo)。

1.2 測定指標(biāo)和方法

1.2.1 光合指標(biāo)測定 每份材料選取6片無遮陰、無損傷、無病蟲害、生長狀況良好的第4功能葉，掛小牌標(biāo)記，按照劉自剛［28］的方法，采用美國生產(chǎn)的LI-6400型便攜式光合儀測定低溫處理0、12和24 h的光合氣體交換參數(shù)變化（Gs、Ci、Tr、Pn），重復(fù)3次，設(shè)定光強(qiáng)為1 200 μmol/m2，葉室內(nèi)溫度為20℃。

1.2.2 葉綠素含量和相對電導(dǎo)率的測定 按照鄒琦［29］《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)方法》對葉綠素含量和相對電導(dǎo)率進(jìn)行測定。

1.2.3 透射電鏡 在低溫處理0和24 h幼苗完全展開的新葉上，用刀片小心避過葉脈切取2 mm2的長方形葉片，投于含有2 mL 3%戊二醛的固定液中。按照電鏡掃描的步驟，PB漂洗3次，15 min/次，餓酸固定4℃ 2 h，再用PB漂洗3次，15 min/次，按照50%、70%、80%、90%、100%、丙酮I和丙酮II梯度脫水，每次10 min。丙酮與樹脂包埋劑按1∶1在35℃烘箱包埋12 h，再移至60℃烘箱直至材料完全聚合。超薄切片機(jī)切片，固定到銅網(wǎng)上用2%的乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進(jìn)行雙染色。最后用日立JEM-1230投射電子顯微鏡進(jìn)行照相。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 利用耐寒品系17NS和低溫敏感品系NF24進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以-4℃低溫脅迫0 h為對照，-4℃低溫脅迫24 h為處理，分別取樣新鮮完整葉片，3個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存。

2個品系均分別處理0和24 h，共4個樣（17NS-0 h、17NS-24 h、NF24-0 h 和 NF24-24 h），由基迪奧公司對樣品提取總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其片段成為短片段，再以斷片后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)，加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeqTM進(jìn)行測序。對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到clean data后，將reads比對到參考基因組上，并利用Cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本，得到已知的轉(zhuǎn)錄本與新的轉(zhuǎn)錄本，然后對得到的基因進(jìn)行表達(dá)量分析與統(tǒng)計，并進(jìn)行差異表達(dá)分析和功能富集分析。

1.2.5 葉片總RNA提取 RNA提取按照Tiangen試劑盒（DP419）說明書提取17NS-0 h、17NS-24 h、NF24-0 h和NF24-24 h的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄按TaKaRa cDNA第一鏈合成試劑盒（RR036A）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA，Bio Mater5超微量紫外分光光度計檢測其濃度后置于-80℃冰箱保存、備用。

1.2.6 Real-time PCR 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋到50 ng/mol，用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，內(nèi)參基因為Bnactin，由上海生工合成引物（表1），采用SYBR Premix Ex Taq（寶生物工程有限公司，大連）定量試劑盒，兩步法擴(kuò)增，每個反應(yīng)均設(shè)置3個重復(fù)，反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。根據(jù)基因的擴(kuò)增效率E，修正2-△△Ct為E-△△Ct計算相對定量結(jié)果，利用Excel 2010和SPSS 22統(tǒng)計分析。

表1 qRT-PCR鑒定引物Table 1 qRT-PCR primers used in this study

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

1.2.7 生物信息學(xué)分析 通過NCBI尋找完整開放 閱 讀 框（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析，利用ProParam軟件進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析（https://web.expasy.org/protparam/）和氨基酸疏水性分析（https://web.expasy.org/protscale/）， 通 過 WoLF PSORT 在 線 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/），用TMHMM 軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)（https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html），使用SignalP 軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測（http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）， 利 用 NCBIConserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，經(jīng)SOPMA軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）， 采 用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）， 通 過 ExPASy-PROSITE預(yù)測蛋白質(zhì)活性中心（https://prosite.expasy.org/），通過DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對，通過MEGA 6.06軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫對甘藍(lán)型油菜植株形態(tài)及葉片發(fā)育的響應(yīng)

2.1.1 低溫脅迫對植株形態(tài)發(fā)育的影響 -4℃低溫處理甘藍(lán)型油菜24 h，觀察植株的形態(tài)（圖1），發(fā)現(xiàn)17NS和NF24 2個油菜品系葉片均發(fā)生萎蔫、下垂現(xiàn)象，其中敏感品系NF24葉片萎蔫現(xiàn)象明顯，耐寒品系17NS葉片萎蔫現(xiàn)象較輕；對低溫處理后的2個品系分別在室溫恢復(fù)24 h，發(fā)現(xiàn)敏感品系NF24的老葉全部枯死，新葉恢復(fù)生機(jī)，而耐寒品系17NS恢復(fù)24 h后，全部新葉和部分老葉均呈綠色恢復(fù)生機(jī)。

圖1 低溫脅迫下的甘藍(lán)型油菜形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of B.napus under low temperature stress

2.1.2 低溫脅迫對甘藍(lán)型油菜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對低溫脅迫下的油菜葉片進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫對葉片細(xì)胞中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和數(shù)量有較大影響，具體表現(xiàn)在葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)、嗜餓顆粒數(shù)量及淀粉粒等方面，抗寒性不同的品系，細(xì)胞器的變化程度不同。耐寒品系17NS低溫脅迫24 h后，基粒片層明顯彌散（圖2-A1和圖2-B1），淀粉粒數(shù)量增加（圖2-A2和圖2-B2），葉綠體數(shù)量和形態(tài)變化不明顯（圖2-A3和圖2-B3）。敏感品系NF24中，低溫脅迫前淀粉粒隱約可見（圖2-C1），低溫脅迫后消失，類囊體片層明顯減少（圖2-D1）；嗜餓顆粒數(shù)量增加，葉綠體由緊貼細(xì)胞壁的單凸形變成遠(yuǎn)離細(xì)胞壁的草履蟲形態(tài)，線粒體數(shù)量明顯增加（圖2-C2和圖2-D2），單個細(xì)胞的葉綠體數(shù)量有所減少（圖2-C3和圖2-D3）。

圖2 低溫脅迫下甘藍(lán)型油菜葉片超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 Ultrastructure of B.napus under low temperature stress

2.2 低溫脅迫對甘藍(lán)型油菜光合特性的影響

2.2.1 低溫脅迫對甘藍(lán)型油菜細(xì)胞膜的影響 植物組織受到逆境傷害時，低溫脅迫首先損傷的是細(xì)胞的膜體系，膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，透性增大，細(xì)胞內(nèi)的水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)將有不同程度的外滲。測定相對電導(dǎo)率，結(jié)果（圖3）表明，耐寒品系17NS和敏感品系NF24受到低溫脅迫前，相對電導(dǎo)率幾乎一樣，差異不顯著，受低溫脅迫后，相對電導(dǎo)率極顯著增大，其中，敏感品系NF24的相對電導(dǎo)率增加量為86.90%，17NS的相對電導(dǎo)率增加量為76.10%。

圖3 低溫脅迫對油菜葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.3 Influence of low temperature to conductivity in rapeseed leaves

2.2.2 低溫脅迫對光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率的影響 通過對0（CK）-12h-24h低溫脅迫下光合參數(shù)測定發(fā)現(xiàn)，低溫極顯著降低了葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr），提高了胞間CO2濃度（Ci）（圖4），其中耐寒品系17NS葉片的Pn、Gs和Tr均高于冷敏感品系NF24，Ci則相反。耐寒品系17NS在低溫脅迫0-12 h-24 h期間，葉片的Tr、Gs和Pn較對照極顯著降低，降低幅度分別是67.15%、71.25%和32.23%，Ci較對照極顯著增加，增幅為37.55%；冷敏感材料NF24在低溫脅迫0-12 h-24 h期間，葉片的Tr、Gs和Pn較對照也是極顯著降低，降低幅度分別是38.13%、58.33%和49.37%，Ci較對照極顯著增加，增幅為18.91%。

圖4 低溫脅迫下不同抗寒品系的光合特征參數(shù)變化Fig.4 Photosynthetic characteristics of cultivars with different cold-resistance levels

2.2.3 低溫對甘藍(lán)型油菜葉綠素含量的影響 低溫脅迫24 h后，不同甘藍(lán)型油菜功能葉中葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）含量均呈極顯著下降趨勢，類胡蘿卜素（Chlx）呈極顯著上升趨勢（P＜0.01）（圖5）。其中敏感品系NF24的葉綠素a含量下降了0.184 mg/g FW，葉綠素b含量下降了0.387 mg/g FW，類胡蘿卜素含量上升了0.224 mg/g FW；耐寒品系17NS的葉綠素a含量下降了0.076 mg/g FW，葉綠素b含量下降了0.175 mg/g FW，類胡蘿卜素含量上升了0.089 mg/g FW。

圖5 低溫脅迫對油菜葉片葉綠素含量的影響Fig.5 Influence of low temperature on chlorophyll content in rapeseed leaves

2.3 低溫脅迫下甘藍(lán)型油菜的差異表達(dá)基因篩選

根據(jù)低溫脅迫下甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用edgeR軟件對組間基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，利用FDR與log2FC來篩選差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR＜0.05且|log2FC|＞1，在2個抗寒性不同的品系中，NF24 t0-17NS t0成對比較得到遺傳背景差異基因共18 978個（表3），NF24 t-17NS t成對比較共得到22 019個差異基因，去除遺傳背景差異，得到低溫誘導(dǎo)顯著差異表達(dá)基因共3041個（739個上調(diào)表達(dá)，2 302個下調(diào)表達(dá)）。

表3 RNA-Seq鑒定出的所有顯著差異表達(dá)基因Table 3 All significantly differentially expressed genes identified by RNA-Seq

2.3.1 KEGG pathway分析 對差異基因進(jìn)行KEGG Pathway分析，選擇Q value≤0.05的通路為差異基因富集的通路。結(jié)果顯示，在所有差異表達(dá)基因中，低溫脅迫24 h后，NF24 t0-17NS t0和NF24 t-17NS t分別有4 229和4 675個差異表達(dá)基因，分別富集在131和132條通路中。通過P＜0.05分別篩選出20條最為顯著的通路作圖展示（圖6），其中核糖體蛋白（ribosome）和代謝通路（metabolic pathway）分別是低溫脅迫前、后品種間最為顯著的通路，均在亞麻酸代謝通路上（linolenic acid metabolism）富集量程度最高（綠色標(biāo)記處）。

2.3.2 光合調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因分析 對低溫脅迫后光合特性相關(guān)的2條顯著通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，主要是能量代謝中的光合作用（photosynthesis）和光合作用-天線蛋白通路（photosynthesis-antenna proteins），其中光合作用-天線蛋白在NF24 t-vs-17NS t比較組中排名在前20個（圖6-B：紅色橢圓標(biāo)記）。應(yīng)用Venny在線軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對低溫脅迫下不同品系差異表達(dá)基因進(jìn)行交集和并集分析（圖7），發(fā)現(xiàn)在這2條通路中，NF24 t0-17NS t0比較組得到的差異基因分別是50和12個，NF24 t-17NS t比較組得到的差異基因分別是69和30個。

圖6 低溫脅迫甘藍(lán)型油菜差異基因表達(dá)支路（TOP20）Fig.6 Branch of differential gene expression in B.napus under low temperature stress（TOP20）

圖7 光合調(diào)控相關(guān)通路上差異基因Venny圖Fig.7 Venny diagram of differential expressed genes in photosynthetic regulatory pathways

2.3.3 低溫脅迫誘導(dǎo)光合作用調(diào)控通路分析 在低溫脅迫后，與光合調(diào)控相關(guān)的光合作用和光合作用-天線蛋白兩條通路中，從NF24t-vs-17NSt的DEGs中去除與NF24t0-vs-17NSt0中重復(fù)的DEGs（遺傳背景差異表達(dá)基因），共得到64個顯著差異表達(dá)基因（圖8），其中光合作用通路中DEGs共有38個，上調(diào)表達(dá)7個，下調(diào)表達(dá)31個，光合作用-天線蛋白通路中DEGs共有26個，上調(diào)表達(dá)1個，下調(diào)表達(dá)25個（圖9-10）。

圖8 光合作用-天線蛋白通路中低溫誘導(dǎo)著差異表達(dá)基因Fig.8 Low temperature-induced the differential expressed genes in photosynthesis-antenna proteins pathways

圖9 甘藍(lán)型油菜光合相關(guān)顯著富集通路中特異表達(dá)基因熱圖Fig.9 Heat map of specific gene expression in photosynthetic- pathway significantly enriched in B.napus

2.3.4 特異表達(dá)基因的GO功能分類 通過GO功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖11），低溫脅迫下特異表達(dá)的差異基因中關(guān)于光合調(diào)控的64個基因大多數(shù)注釋到細(xì)胞組分過程和生物組分過程，在分子功能中的差異表達(dá)基因最少，主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

2.3.5 特異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證 圖11中的64個低溫誘導(dǎo)特異表達(dá)基因中，敏感品系NF24和耐寒品系17NS在低溫脅迫后大部分基因均下調(diào)表達(dá)，從光合作用通路中篩選上調(diào)表達(dá)的1個基因，下調(diào)表達(dá)的7個基因，在光合作用-天線蛋白通路中篩選出上調(diào)表達(dá)的1個基因和下調(diào)表達(dá)的8個基因進(jìn)行qRT-PCR驗證（表4），主要功能與光合系統(tǒng)Ⅰ、光合系統(tǒng)Ⅱ、放氧蛋白、鐵氧還蛋白-NADP還原酶、葉綠素蛋白和ATP合成酶等相關(guān)。檢測引物見表4。研究發(fā)現(xiàn)qRT-PCR的檢測結(jié)果與RNA-Seq分析結(jié)果一致（圖12），17個DEGs在qRT-PCR和RNA-Seq中的誘導(dǎo)表達(dá)變化趨勢相同，證實了RNASeq分析結(jié)果的可靠性。

表4 17個DEGs的基因信息Table 4 Genetic information of 17 differentially expressed genes

圖11 甘藍(lán)型油菜葉片冷脅迫應(yīng)答差異表達(dá)基因的GO分類Fig.11 GO categories of cold stress-responsive DEGs in leaves of B.napus

圖12 17個DEGs的qRT-PCR驗證Fig.12 Validaton of 17 differentially expressed genes by qRT-PCR

2.4 甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低溫脅迫調(diào)控光合作用的候選基因功能分析

根據(jù)qRT-PCR的檢測結(jié)果，重點(diǎn)關(guān)注17個DEGs中上調(diào)表達(dá)的2個基因：光合作用通路的LOC106350097基因和光合作用-天線蛋白通路中的LOC106440450基因，分別命名為BnFd1和BnCP26。

通過NCBI尋找開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)BnFd1（Gene ID：LOC106350097；protein_id="XP_022576355.1"）基因含有完整ORF，長度為447 bp，其產(chǎn)物是葉綠體上的鐵氧還蛋白1（Ferredoxin-1；BnFd1），蛋白理化性質(zhì)分析表明，BnFd1由148個氨基酸組成，不穩(wěn)定指數(shù)為54.66，蛋白親水性平均系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為 -0.117，屬于不穩(wěn)定親水蛋白（圖13-A）；亞細(xì)胞定位分析表明BnFd1蛋白定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，在第1-33個氨基酸位點(diǎn)存在一個信號肽（圖13-B），屬于PLNO3136超家族，在第1-148個氨基酸位點(diǎn)存在保守的Fd1結(jié)構(gòu)域（圖13-C）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，BnFd1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占25%，β-折疊占5.41%，無規(guī)卷曲占45.95%，延伸鏈占23.65%（圖13-D）。采用SWISS-MODEL在線軟件以4zho.1.A為模板進(jìn)行建模，預(yù)測BnFd1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，模型覆蓋度為82.98%（圖13-E）。

圖13 甘藍(lán)型冬油菜BnFd1蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.13 Bioinformatics analysis of BnFd1 protein in B.napus

圖10 低溫脅迫甘藍(lán)型油菜光合相關(guān)顯著富集通路差異表達(dá)基因數(shù)Fig.10 Number of differentially expressed genes in the photosynthetic pathways significantly enriched in B.napus under low temperature stress

通過NCBI尋找開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)BnCP26（Gene ID：LOC106440450；protein_id="XP_013737568.1”）基因含有完整ORF，長度為846 bp，其產(chǎn)物是類葉綠體上葉綠素a-b結(jié)合蛋白CP26（BnCP26）。蛋白理化性質(zhì)分析表明，BnCP26由281個氨基酸組成，不穩(wěn)定指數(shù)為24.80，蛋白親水性平均系數(shù)（GRAVY）值為-0.030，屬于穩(wěn)定親水蛋白（圖14-A），亞細(xì)胞定位分析表明BnCP26蛋白定位于葉綠體中，無信號肽（圖14-B），屬于葉綠素a_b結(jié)合超家族，在第18-266個氨基酸位點(diǎn)存在保守的葉綠素A-B結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（圖14-C）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，BnCP26蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占35.94%，β-折疊占4.27%，無規(guī)卷曲占51.60%，延伸鏈占8.19%（圖14-D）。采用SWISS-MODEL在線軟件以5mdx.1.7為模板進(jìn)行建模，預(yù)測BnCP26蛋白的三級結(jié)構(gòu)，模型覆蓋度為97.39%（圖14-E）。

圖14 甘藍(lán)型冬油菜BnCP26蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.14 Bioinformatics analysis of BnCP26 protein in B.napus

2.4.2 甘藍(lán)型油菜BnFd1蛋白和BnCP26蛋白的序列比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將甘藍(lán)型油菜中編碼BnFd1蛋白的氨基酸序列，與白菜型油菜（Brassica rapa）、甘藍(lán)（Brassica oleracea）、亞麻薺（Camelina sativa）、 薺 菜（Capsella rubella）、 萮 菜（Eutrema salsugineum）和蘿卜（Raphanus sativus）等6個物種進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列相似性達(dá)到87.55%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜中的BnFd1蛋白與白菜型油菜的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性達(dá)到98.65%，與薺菜的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，氨基酸序列相似性為77.03%（圖15）。

圖15 甘藍(lán)型冬油菜中BnFd1蛋白的氨基酸序列比對系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.15 Sequence alignment of amino acids and phylogenetic analysis of BnFd1 proteins sequence in B.napus

將甘藍(lán)型油菜中編碼BnCP26蛋白的氨基酸序列，與白菜型油菜（Brassica rapa）、甘藍(lán)（Brassica oleracea）、芥菜型油菜（Brassica juncea）、亞麻薺（Camelina sativa）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、萮菜（Eutrema salsugineum）、蘿卜（Raphanus sativus）、開心果（Pistacia vera）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）等9個物種進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列相似性達(dá)到91.57%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜中的BnCP26蛋白與甘藍(lán)的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性達(dá)到99.64%，與鷹嘴豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，氨基酸序列相似性為82.76%（圖16）。

圖16 甘藍(lán)型冬油菜中BnCP26蛋白序列的氨基酸序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.16 Sequence alignment of amino acids and phylogenetic analysis of BnCP26 proteins sequence in B.napus

3 討論

低溫是影響光合作用、呼吸作用和作物生長發(fā)育的最重要非生物脅迫之一。研究表明，CO2供應(yīng)和同化CO2能力受阻除了氣孔因素，還有非氣孔因素的影響［31-32］。該研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)低溫脅迫24 h能引起葉片變黃脫落，植株萎蔫，但是耐寒品系17NS的受損傷現(xiàn)象較輕，解除低溫脅迫恢復(fù)24 h時，耐寒品系17NS恢復(fù)生機(jī)表現(xiàn)明顯，這是因為耐寒材料在低溫逆境中保持較高的光能轉(zhuǎn)化、電子傳遞和弱光利用效率，亦可通過減少暗呼吸消耗和調(diào)整Gs降低幅度和速度來保持較高的光合速率，提高恢復(fù)能力，增強(qiáng)植株抗逆性［33］。低溫脅迫下，敏感品系NF24較耐寒品系17NS相對電導(dǎo)率急劇上升，甘藍(lán)型油菜葉片細(xì)胞膜的電解質(zhì)大量外滲，可能是敏感品系的耐寒性和適應(yīng)性較差，電解質(zhì)外滲量較大，而耐寒品系具有較強(qiáng)的維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的相對穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整性的能力，更能抵抗低溫傷害，說明植物可以通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解低溫?fù)p傷，這與前人研究結(jié)果一致［34-37］。低溫也能引物植物體內(nèi)代謝緩慢，葉綠體功能紊亂而解體［38］，合成葉綠素的原料受到抑制［39］，使得葉綠體數(shù)目減少，體積收縮，基粒片層模糊，嗜餓顆粒數(shù)目增加，葉綠素a和葉綠素b含量顯著降低，CO2同化能力受阻。小麥研究發(fā)現(xiàn)低溫會導(dǎo)致氣孔收縮，氣孔導(dǎo)出受蒸發(fā)效率影響，細(xì)胞間隙的Ci上升［40］，光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）顯著降低，光合作用受到抑制，說明低溫對光合速率的影響是由氣孔因素轉(zhuǎn)變?yōu)榉菤饪滓蛩氐摹Ｒ虼?，低溫不僅對油菜生理功能造成影響，也會對光合效率產(chǎn)生抑制作用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，得到2個顯著光合調(diào)控通路，分別是光合作用和光合作用-天線蛋白通路，共64個差異表達(dá)基因，大多數(shù)注釋到細(xì)胞組分過程和生物組分過程，說明低溫對甘藍(lán)型油菜生長發(fā)育的影響，其中主要集中在細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性方面，與本研究前期生理指標(biāo)分析的低溫影響細(xì)胞膜滲透率和光合作用等結(jié)論一致。通過qRT-PCR分析，鑒定出17個穩(wěn)定表達(dá)的光合調(diào)控候選基因，其中15個基因下調(diào)表達(dá)，2個基因上調(diào)表達(dá)（BnFd1和BnCP26），證實了低溫脅迫對光合作用的調(diào)控主要是通過抑制光合色素和光反應(yīng)系統(tǒng)來進(jìn)行的，反應(yīng)了低溫脅迫抑制了鐵氧還蛋白：輔酶ii還原酶、光系統(tǒng)I反應(yīng)、放氧蛋白、ATP合成酶、光系統(tǒng)II修復(fù)蛋白PSB27-H1、光系統(tǒng)I葉綠素a/b結(jié)合蛋白、葉綠素a-b結(jié)合蛋白等的表達(dá)，誘導(dǎo)了鐵氧還蛋白和葉綠素a-b結(jié)合蛋白CP26的表達(dá)，說明低溫是通過抑制光合色素和光反應(yīng)系統(tǒng)來抑制光合作用的。2個上調(diào)表達(dá)基因中，BnFd1基因基因?qū)儆诠夂献饔猛?，能響?yīng)低溫脅迫上調(diào)表達(dá)，編碼148個氨基，其產(chǎn)物是葉綠體上的鐵氧還蛋白1（Ferredoxin-1；Fd1），F(xiàn)d與光合作用關(guān)系密切，它不僅通過與Fd-NADP+氧化還原酶（FNR）作用形成NADPH參與線性光合電子傳遞鏈，而且通過PGR5-PGRL1和NDH復(fù)合體參與循環(huán)電子傳遞，參與氮代謝、氫代謝和呼吸作用［41］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BnFd1蛋白定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，屬于PLNO3136超家族，存在保守的Fd1結(jié)構(gòu)域，鐵氧還蛋白作為一個大的基因家族在植物中普遍存在，現(xiàn)已證實Fd基因可幫助水稻、煙草、擬南芥以及文心蘭在內(nèi)的許多植物獲得廣譜抗性［42］，與本研究中Fd1能響應(yīng)低溫脅迫作出抗寒應(yīng)答的結(jié)論一致。天線蛋白復(fù)合體是植物光合作用的關(guān)鍵組成部分，這一過程將光、二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為氧氣和糖［43］，PSII Lhcb5/CP26蛋白依賴的光參與調(diào)節(jié)葉黃素捕獲，CP26和CP29的缺失可以損傷光合效率和光保護(hù)［44］。BnCP26基因?qū)儆诠夂献饔?天線蛋白通路，能響應(yīng)低溫脅迫上調(diào)表達(dá)，編碼281個氨基酸，其產(chǎn)物是類囊體上葉綠素a-b結(jié)合蛋白CP26，定位于葉綠體中，屬于葉綠素a_b結(jié)合超家族，存在保守的葉綠素A-B結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域。關(guān)于候選基因的分子機(jī)理，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低溫脅迫可以誘導(dǎo)葉綠體上的鐵氧還蛋白1（BnFd1）和類囊體上的葉綠素a-b結(jié)合蛋白CP26（BnCP26）表達(dá)，BnFd1蛋白和BnCP26蛋白可能會通過某種分子調(diào)控機(jī)制來應(yīng)對低溫逆境，以此來減弱其對植株的生理傷害和對光合作用的抑制。因此，BnFd1蛋白和BnCP26蛋白是甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低溫脅迫時光合調(diào)控的關(guān)鍵候選基因。