大白菜KCS基因家族鑒定及在蠟粉近等基因系中表達(dá)分析

王榮花 王樹(shù)彬 張志剛 趙智中 李巧云 王立華 劉栓桃

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心 山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站（山東），濟(jì)南 250100）

超長(zhǎng)鏈脂肪酸（very long chain fatty acids，VLCFAs）是植物表皮蠟質(zhì)生物合成的直接前體物質(zhì)，它是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多酶復(fù)合體-脂肪酸延長(zhǎng)酶（multienzyme-fatty acid elongase，F(xiàn)AE）經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)反應(yīng)催化生成［1］。FAE多酶復(fù)合體包括4種酶：β-酮脂酰輔酶A合成酶（β-ketoacyl-CoA synthase，KCS）、β-酮脂?；o酶A還原酶（β-ketoacyl-CoA reductase，KCR）、β-羥?；o酶A水解酶（β-hydroxyacyl-CoA dehydratase，HCD）和烯?；o酶A還原酶（enoyl-CoA reductase，ECR）［2］。其中，KCS 是 VLCFA 合成中的限速酶，具有嚴(yán)格的底物特異性和碳鏈長(zhǎng)度特異性，它的類型決定了循環(huán)反應(yīng)的速度和最終的?；o酶A產(chǎn)物的?；滈L(zhǎng)度［3］。

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的21個(gè)KCS基因中，AtKCS18/FAR1是第一個(gè)被克隆得到的KCS基因，該基因僅在種子中表達(dá)，其表達(dá)與種子的發(fā)育時(shí)期相關(guān)［4］。與AtKCS18/FAR1屬于同一亞屬的 5個(gè) 基 因，AtKCS4、AtKCS8、AtKCS9、AtKCS16和AtKCS17均沒(méi)有內(nèi)含子，其中AtKCS8僅在葉片中表達(dá)，AtKCS17只在花和角果中表達(dá)［5］。此外，有8個(gè)基因包括AtKCS1、AtKCS2/DAISY、AtKCS5/CER60、AtKCS6/CER6/CUT1、AtKCS9、AtKCS10/FDH、AtKCS13/HIC和AtKCS20被報(bào)道參與蠟質(zhì)中VLCFA的合成［6-13］。AtKCS1在擬南芥植株的各個(gè)部位中均有表達(dá)，其突變體導(dǎo)致蠟質(zhì)中C26和C30的脂肪醇和脂肪醛含量下降［6，14］。AtKCS2/DAISY和AtKCS20都參與C20-C22的延伸，在表皮蠟質(zhì)合成和根中木栓質(zhì)的合成過(guò)程具有重要作用［7，13］。AtKCS5/CER60和AtKCS6/CER6/CUT1序列高度相似，參與C24以上的脂肪酸合成，影響植物表皮蠟質(zhì)含量［8-9］。AtKCS6最初被克隆出來(lái)被稱為CUT1，是蠟質(zhì)合成基因［15］，CER6基因被克隆后通過(guò)序列分析顯示，與CUT1是同一個(gè)基因［16］。擬南芥cer6突變體的莖、果實(shí)和花粉的表皮蠟質(zhì)嚴(yán)重缺失，且影響柱頭識(shí)別花粉，導(dǎo)致花粉育性降低［9，16］。AtKCS9在擬南芥的地上部分器官中表達(dá)顯著，kcs9突變體表現(xiàn)出C24的VLCFA顯著減少，C20和C22的VLCFA含量增加［10］。AtKCS10/FDH主要在花和嫩葉中表達(dá)，參與表皮蠟質(zhì)的合成，影響植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和脅迫響應(yīng)［5，11］。AtKCS13/HIC參與氣孔的生長(zhǎng)發(fā)育［12］，其在棉花中超量表達(dá)可使棉花的纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)［17］，編碼產(chǎn)物也參與VLCFAs的合成。此外，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中發(fā)現(xiàn)MtKCS12控制種皮中超長(zhǎng)鏈脂質(zhì)種類的產(chǎn)生對(duì)于保持種子物理休眠至關(guān)重要［18］。柑橘屬（Citrus）KCS基因家族的綜合分析，揭示了CsKCS2和CsKCS11參與果實(shí)成熟時(shí)表皮蠟的合成［19］。

大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）屬于十字花科蕓薹屬，是我國(guó)重要的十字花科蔬菜。基于越來(lái)越多的物種已完成基因組測(cè)序，KCS家族成員已在擬南芥［5］、油菜［20］、辣椒［21］、黃麻［22］等物種中被鑒定，KCS家族成員在不同物種間存在較大差異。本研究以大白菜Chiifu基因組數(shù)據(jù)作參考，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定大白菜KCS基因家族成員，分析該家族成員的基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、組織特異性及在蠟粉近等基因系的表達(dá)分析，為深入研究大白菜KCS家族基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以大白菜06-247（無(wú)蠟粉）為母本，He102（無(wú)蠟粉）為父本雜交，構(gòu)建了一個(gè)F2-7重組自交 系 群 體（recombinant inbred line，RIL）， 在 F7中RIL065是一個(gè)花莖表皮有蠟粉/無(wú)蠟粉雜合系，稱其為剩余雜合系（residual heterozygous line，RHL）即RHL065，繼續(xù)自交在F8代獲得了有蠟粉純系 RHL065_1 與無(wú)蠟粉純系 RHL065_2［23-24］。RHL065_1與RHL065_2的種子催芽后，播于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所核心試驗(yàn)基地。選取RHL065_1與RHL065_2單株各3個(gè)為一組樣品，分別取其成熟葉片和花莖，每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品迅速用液氮冷凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 大白菜KCS基因家族的鑒定、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和蛋白特征分析 從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.arabidopsis.org/）下載了擬南芥KCS基因家族蛋白序列共計(jì) 21（AtKCS1 - AtKCS21）條［25］。在 BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/）［26-27］下載大白菜（V3.0版本）和甘藍(lán)（Braol JZS_V2.0版本）全基因組蛋白序列文件和gff3文件構(gòu)建本地BLASTP數(shù)據(jù)庫(kù)，將擬南芥（At）KCS基因家族的蛋白序列通過(guò)本地BLASTP比對(duì)出大白菜（Br）KCS和甘藍(lán)（Bo）KCS的基因成員。BrKCS和BoKCS基因的命名根據(jù)其與AtKCS1 - AtKCS21序列的同源性及共線性關(guān)系并添加后綴（a、b......等）來(lái)命名。

利 用MEGA 7.0對(duì)BrKCS、AtKCS和BoKCS蛋白質(zhì)序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用最大似然法（maximum-likelihood）， 設(shè) 置 Bootstrap值 為 1 000，其他參數(shù)保持默認(rèn)值［28］。利用在線ExPaSy（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)獲得的BrKCS蛋白質(zhì)序列分子量、理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析［29］。

1.2.2 大白菜KCS基因的染色體分布和共線性分析 根據(jù)BrKCS基因在染色體上的物理位置，使用TBtools［30］對(duì)BrKCS基因進(jìn)行染色體定位。利用BRAD（http://brassicadb.org/brad/searchSyntenytPCK.php）數(shù)據(jù)庫(kù)分析大白菜、甘藍(lán)和擬南芥之間的親緣關(guān)系，利用TBtools［30］繪制共線性圖。

1.2.3 大白菜KCS基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守域結(jié)構(gòu)分析 利 用 Gene Structure Display Server（GSDS 2.0，http://gsds.gao-lab.org/）根據(jù)每個(gè)BrKCS基因組序列和相應(yīng)的CDS序列繪制基因結(jié)構(gòu)圖［31］。使用模體分析工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/）對(duì)BrKCS蛋白進(jìn)行保守基序分析，其中最適基序?qū)挾仍O(shè)置為6-50，最大基序設(shè)置為10，其他為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4 大白菜KCS基因在不同器官/組織以及不同材料中的表達(dá)模式分析 為了分析大白菜不同器官/組織中BrKCS基因的表達(dá)水平，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載大白菜不同器官/組織（愈傷組織、根、莖、葉、花和角果）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號(hào)：GSE43245）， 以 BrKCS基 因 的 Log2（FPKM）（fragments per kilobase per million mapped reads）值來(lái)表示BrKCSs在不同器官/組織中的表達(dá)水平，并繪制熱圖。

前期構(gòu)建了大白菜花莖有蠟粉組（RHL065_1_T1、T2、T3）與無(wú)蠟粉組（RHL065_2_T1、T2、T3）兩組cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)后應(yīng)用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序［23］。根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)中獲取的每個(gè)BrKCS基因的Log2（FPKM）值來(lái)繪制熱圖。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）利用來(lái)源于高代自交系的有蠟粉植株Waxy1（W1）和無(wú)蠟粉植株Glossy1（G1）及RIL群體中有蠟粉植株W2和無(wú)蠟粉植株G2為試驗(yàn)材料，采用Trizol法（Invitrogen，USA）提取兩組樣品花莖表皮的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（TaKaRa，中國(guó)）試劑盒、在ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（G6PD）作為內(nèi)標(biāo)基因，按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS Version 21.0軟件進(jìn)行，依據(jù)Duncan’s multiple range test法計(jì)算P＜ 0.05水平顯著性。各基因引物序列如表1所示。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis

2 結(jié)果

2.1 大白菜KCS基因家族的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和蛋白特征分析

通過(guò)對(duì)全基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定和結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，在大白菜和甘藍(lán)基因組中分別鑒定到32個(gè)BrKCS和36個(gè)BoKCS蛋白。根據(jù)命名規(guī)則，將這些蛋白分別命名為BrKCS1 - BrKCS21和BoKCS1 -BoKCS21。將大白菜、甘藍(lán)和擬南芥的KCS蛋白序列構(gòu)建了無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。這些KCS蛋白成員根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近被分為4個(gè)不同的亞組（Group A-D）。亞組Group A、B、C和D分別包含10、10、9和3個(gè)KCS成員。其中亞組Group A包括 BrKCS1a、BrKCS1b、BrKCS2a、BrKCS2b、BrKC-S10a、BrKCS10b、BrKCS13、BrKCS15、BrKCS20 a 和BrKCS20b，亞組 Group B 包括 BrKCS4a、BrKCS4b、BrKCS8、BrKCS9a、BrKCS9b、BrKCS9c、BrKCS16a、BrKCS16b、BrKCS17和 BrKCS18，亞組 Group C包括 BrKCS3a、BrKCS3b、BrKCS7a、BrKCS7b、BrKCS12a、BrKCS12b、BrKCS19a、BrKCS19b和BrKCS21，亞組Group D是成員最少的，包括BrKCS5、BrKCS6a和 BrKCS6b。

圖1 大白菜（Br）、甘藍(lán)（Bo）、擬南芥（At）KCS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of KCS proteins in Brassica rapa（Br），Brassica oleracea（Bo）and Arabidopsis thaliana（At）

通過(guò)在線ProtParam工具預(yù)測(cè)了BrKCS蛋白的物理和化學(xué)特征（表2）。BrKCS蛋白的氨基酸長(zhǎng)度范圍為181-755 aa。BrKCS蛋白的分子量范圍為20.54-84.83 kD，理論等電點(diǎn)范圍為8.01-9.40。

表2 大白菜和擬南芥KCS基因?qū)?yīng)關(guān)系及大白菜KCS基因基本信息Table 2 Corresponding relationship between B.rapa and A.thaliana KCS genes and basic information of KCS genes in B.rapa

2.2 大白菜KCS基因的染色體分布和共線性分析

在本研究中，BrKCS基因家族的32個(gè)成員分布在3個(gè)亞基因組上，其中LF亞基因組有13個(gè)BrKCS基因，MF1有10個(gè)BrKCS基因，MF2有9個(gè)BrKCS基因（表1）。與擬南芥AtKCS基因相比，大白菜的BrKCS基因在全基因組三倍化的過(guò)程中，BrKCS11和BrKCS14被丟失。在進(jìn)化壓的作用下，總共有7個(gè)BrKCS基因（BrKCS5、BrKCS8、BrKCS13、BrKCS15、BrKCS17、BrKCS18和 BrKCS21）保留了單拷貝，有11個(gè)BrKCS基因（BrKCS1、BrKCS2、BrKCS3等）均保留了雙拷貝。只有BrKCS9在進(jìn)化到白菜的三倍化過(guò)程中保留了三拷貝。本研究共有32個(gè)BrKCS基因分別被定位在10條染色體上，并分析了BrKCS基因在大白菜染色體上的物理定位。BrKCS16a定位于染色體A01上，BrKCS6a、BrKCS7a、BrKCS19b、BrKCS20b和BrKCS21位于染色體A02上，BrKCS9c、BrKCS15和BrKCS16b位于染色體A03上，BrKCS10b和BrKCS12b位于染色體A04上，BrKCS13定位于染色體A05上，BrKCS3a、BrKCS4a和BrKCS20a定位于染色體A06上，BrKCS6b、BrKCS7b、BrKCS8、BrKCS9a和BrKCS12a定位于染色體A07上，BrKCS2b、BrKCS3b、BrKCS17和 BrKCS18定位于染色體A08上，BrKCS1b、BrKCS4b、BrKCS5、BrKCS9b和BrKCS10a定位于染色體A09上，BrKCS1a、BrKCS2a和BrKCS19a定位于染色體A10上（圖2）。

圖2 大白菜KCS基因在10條染色體上的定位分布Fig.2 Distribution of KCS gene in B.rapa on 10 chromosomes

此外，將鑒定到的直系和旁系同源KCS基因用于分析BrKCS和AtKCS基因間的共線性。結(jié)果共鑒定到大白菜之間14對(duì)旁系同源基因、大白菜和擬南芥之間32對(duì)直系同源基因（圖3）。

圖3 大白菜（Br）和擬南芥（At）KCS基因的共線性關(guān)系Fig.3 Collinear relationship of KCS genes in B.rapa（Br）and A.thaliana（At）

2.3 大白菜KCS基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)BrKCS基因家族成員的CDS和DNA序列，繪制BrKCS基因結(jié)構(gòu)圖（圖4）。結(jié)果顯示，BrKCS基因家族成員之間的外顯子數(shù)量差異不大（1-7個(gè)）。其中BrKCS7b含有7個(gè)外顯子，BrKCS3、BrKCS4和BrKCS5a含有3個(gè)外顯子，BrKCS1b、BrKCS2a、BrKCS3b、BrKCS5、BrKCS6a、BrKCS6b、BrKCS13、BrKCS20a和BrKCS20b含有2個(gè)外顯子，其余19個(gè)BrKCS基因均含有1個(gè)外顯子。

圖4 大白菜KCS基因家族外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of exon-intron structure of KCS gene family in B.rapa

2.4 大白菜KCS蛋白保守域結(jié)構(gòu)分析

利用MEME在線分析工具對(duì)BrKCS家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（圖5），獲得10個(gè)保守基序，分別命名為motif 1-motif 10。結(jié)果顯示，在32個(gè)BrKCS家族成員中，有22個(gè)成員含有motif 1-motif 10保守基序。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BrKCS1b、BrKCS12b和BrKCS19a含有9個(gè)保守基序，其中BrKCS1b中沒(méi)有motif 4，BrKCS12b和BrKCS19a中沒(méi)有motif 5。BrKCS3a、BrKCS12a、BrKCS15和 BrKCS19b含有8個(gè)保守基序，其中BrKCS3a、BrKCS12a和BrKCS19b中都缺失motif 5和motif 8，而B(niǎo)rKCS15中缺失motif 6和motif 9。BrKCS3b含有7個(gè)保守基序，缺失motif 2、motif 5和motif 8。BrKCS2b中只有3個(gè)保守基序分別是motif 1、motif 4和motif 9，BrKCS6a中只有4個(gè)保守基序分別是motif 2、motif 3、motif 5和 motif 7。

圖5 大白菜KCS基因家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Analysis of protein conserved domains of KCS gene family members in B.rapa

2.5 大白菜KCS家族基因轉(zhuǎn)錄組分析

2.5.1 大白菜KCS基因組織特異性表達(dá)分析 本研究分析了29個(gè)BrKCS基因家族成員在大白菜不同器官/組織中的表達(dá)，另外有3個(gè)成員（BrKCS2b、BrKCS6a和BrKCS21）在大白菜不同器官/組織轉(zhuǎn)錄組中不表達(dá)。大多數(shù)BrKCS在大白菜花中高表達(dá)，其次是角果、莖、葉、根和愈傷組織（圖6）。其中，BrKCS10b和BrKCS5在各個(gè)器官/組織中整體表達(dá)量最高。在花中表達(dá)量由高到低依次是BrKCS5、BrKCS10b和BrKCS6b；在角果中表達(dá)量由高到低依次是BrKCS10b、BrKCS6b和BrKCS19a；在莖中表達(dá)量由高到低依次是BrKCS10b、BrKCS4b和BrKCS19b；在葉中表達(dá)量由高到低依次是BrKCS10b、BrKCS4b和 BrKCS20b。

圖6 大白菜KCS基因在不同組織/器官中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of KCS gene in B.rapa on different tissues/organs

2.5.2 大白菜KCS基因在蠟粉近等基因系中的表達(dá)分析 本研究分析了28個(gè)BrKCS基因在蠟粉近等基因系中的表達(dá)模式，另外4個(gè)BrKCS基因（BrKCS6a、BrKCS9c、BrKCS17和 BrKCS18） 在 大白菜蠟粉近等基因系轉(zhuǎn)錄組中不表達(dá)。如圖7所示，共計(jì)17個(gè)BrKCS基因在有蠟粉大白菜中的表達(dá)量高于無(wú)蠟粉大白菜；BrKCS2b、BrKCS4a、BrKCS4b、BrKCS7a、BrKCS7b、BrKCS8、BrKCS9b、BrKCS12a、BrKCS16a、BrKCS19b和BrKCS20b共計(jì)11個(gè)基因在有蠟粉大白菜中的表達(dá)量低于無(wú)蠟粉大白菜。其中，BrKCS5、BrKCS9a、BrKCS10b和BrKCS13整體表達(dá)水平相對(duì)較高。

11對(duì)BrKCS基因具有雙拷貝，其中5對(duì)（BrKCS1、BrKCS2、BrKCS6、BrKCS7、BrKCS10） 部 分 同 源拷貝在兩近等基因系中均存在表達(dá)差異。如圖7，BrKCS1a，BrKCS2a，BrKCS6b，BrKCS7b，BrKCS10b相較另一個(gè)部分同源拷貝具有較高表達(dá)量，特別是BrKCS2b，BrKCS6a，BrKCS7a三個(gè)基因幾乎或完全沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。6對(duì)BrKCS基因（BrKCS3、BrKCS4、BrKCS12、BrKCS16、BrKCS19、BrKCS20）兩個(gè)部分同源拷貝在兩近等基因系中表達(dá)差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。BrKCS9是唯一一個(gè)具有3個(gè)部分同源拷貝的大白菜KCS編碼基因，拷貝BrKCS9c在兩近等基因系轉(zhuǎn)錄組分析中均未檢測(cè)到表達(dá)，BrKCS9a總體表達(dá)量較高，BrKCS9b相對(duì)表達(dá)量較低。

圖7 大白菜KCS基因在大白菜蠟粉近等基因系中的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of BrKCS gene in waxy nearisogenic line of B.rapa

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

利用qRT-PCR驗(yàn)證了14個(gè)BrKCS基因在有/無(wú)蠟粉高代自交系及蠟粉近等基因系表皮中的表達(dá)情況，其中2個(gè)BrKCS基因（BrKCS6a和BrKCS9a） 不 表 達(dá)（ 圖8）。BrKCS1a、BrKCS2a、BrKCS5、BrKCS6b、BrKCS9c、BrKCS10b、BrKCS13和BrKCS20a共計(jì)8個(gè)基因在RIL群體中有蠟粉大白菜中的表達(dá)量高于無(wú)蠟粉大白菜。其中，BrKCS5、BrKCS6b、BrKCS9c、BrKCS10b和BrKCS20a整體表達(dá)水平相對(duì)較高。BrKCS7a、BrKCS7b、BrKCS9b和BrKCS10a共計(jì)4個(gè)基因在RIL群體中有蠟粉大白菜中的表達(dá)量低于無(wú)蠟粉大白菜。以上分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致。此外，14個(gè)BrKCS基因在沒(méi)有親緣關(guān)系的有/無(wú)蠟粉高代自交系中的表達(dá)模式與蠟粉近等基因系中的表達(dá)模式相一致。

圖8 大白菜KCS基因在大白菜有/無(wú)蠟粉高代自交系及近等基因系表皮中的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of BrKCS gene in waxy/non-waxy high-generation inbred lines and near-isogenic lines of B.rapa

3 討論

基因組多倍化廣泛存在于眾多物種進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)基因擴(kuò)張或部分同源基因功能分化為新基因產(chǎn)生和物種進(jìn)化提供了重要途徑。本研究在大白菜中鑒定到32個(gè)KCS家族成員，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析和基因組共線性分析，展示了大白菜基因組三倍化事件對(duì)該基因家族擴(kuò)張和分化的影響。大白菜32個(gè)BrKCS分為19個(gè)部分同源基因，其中12個(gè)（約63%）隨基因組三倍化進(jìn)行了擴(kuò)展，但僅1個(gè)基因具有3個(gè)部分同源基因，說(shuō)明三倍化事件后產(chǎn)生了較高頻率偏性基因丟失［26］。另外，我們發(fā)現(xiàn)BrKCS7的兩個(gè)部分同源拷貝間基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式存在巨大差異，BrKCS7b比旁系同源基因BrKCS7a多出2 015 bp對(duì)應(yīng)6個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，BrKCS7a在不同器官/組織和蠟粉近等基因系中的表達(dá)模式與BrKCS7b差異顯著，這可能使兩者在功能上產(chǎn)生了分化。

KCS家族基因是超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其調(diào)控合成的C20 - C30的超長(zhǎng)鏈脂肪酸是植物表皮蠟質(zhì)合成的前體物質(zhì)［1-3］。植物表皮蠟粉主要分布在植物莖、葉和莢果等器官的表面，在植物抗干旱、抵御病害等生物與非生物脅迫方面起著重要作用［5，14］。同時(shí)對(duì)于大白菜等葉用蔬菜作物特別是白菜薹品種，蠟粉是重要的商品性狀［32］。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的植物全基因組序列已經(jīng)完成測(cè)定，更多的KCS基因家族成員被分離鑒定［1，15］。擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 21 個(gè) KCS 基因［5］，其中有 8個(gè)基因（AtKCS1、AtKCS2/DAISY、AtKCS5/CER60、AtKCS6/CER6/CUT1、AtKCS9、AtKCS10/FDH、AtKCS13/HIC和AtKCS20）已被報(bào)道參與蠟質(zhì)中VLCFA的合成［6-13］。本研究對(duì)大白菜不同器官/組織和蠟粉近等基因系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析并繪制表達(dá)熱圖，結(jié)果顯示BrKCS基因具有不同的組織表達(dá)模式，部分同源基因之間以及同一分組的基因之間的組織表達(dá)模式有較大差異。此外，利用qRT-PCR驗(yàn)證了BrKCS基因在蠟粉近等基因系表皮中的表達(dá)情況，證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。擬南芥突變cer6植株莖和角果的蠟質(zhì)嚴(yán)重缺失［16］，而且C24的蠟質(zhì)衍生物大量積累［9，16］，在油菜（Brassica napus）中BnKCS6在花蕾和30 d種子中表達(dá)量較高［20］，而大白菜中BrKCS6a在不同器官/組織的轉(zhuǎn)錄組、蠟粉近等基因系和高代自交系中都沒(méi)有表達(dá)，BrKCS6b在花和角果中高表達(dá)，并且有蠟粉大白菜中的表達(dá)量顯著高于無(wú)蠟粉。KCS5與KCS6同源性最高，油菜BnKCS5在葉片和柱頭中的表達(dá)量較高［20］，而白菜BrKCS5僅在花中表達(dá)量很高，并且在有蠟粉大白菜中的表達(dá)量顯著高于無(wú)蠟粉大白菜。AtKCS10/FDH主要在花和嫩葉中表達(dá)，BnKCS10在花蕾和柱頭的表達(dá)量較高，BrKCS10b整體表達(dá)量高，特別是角果和花，而B(niǎo)rKCS10a在大白菜不同器官/組織、蠟粉近等基因系和高代自交系中表達(dá)量都很低。以上線索表明BrKCS5、BrKCS6b與BrKCS10b可能是參與大白菜蠟粉合成的關(guān)鍵KCS基因，值得進(jìn)一步開(kāi)展功能驗(yàn)證工作。

本研究中對(duì)大白菜KCS基因家族進(jìn)行鑒定及分析，根據(jù)與擬南芥的同源性比較，推測(cè)該家族中高表達(dá)量的BrKCS5、BrKCS6b與BrKCS10b是超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸所必需的，這為今后開(kāi)展BrKCS5、BrKCS6b與BrKCS10b基因在控制大白菜蠟質(zhì)性狀中的具體功能研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在大白菜全基因組中共鑒定到32個(gè)BrKCS基因家族成員，可分為4個(gè)亞族，不均勻地分布在10條染色體。在大白菜各個(gè)器官/組織中，BrKCS5、BrKCS6b與BrKCS10b表達(dá)量高且在有蠟粉大白菜中的表達(dá)量顯著高于無(wú)蠟粉大白菜，這些證據(jù)表明其可能參與大白菜蠟粉的合成。