硫普羅寧修飾的銀納米簇應(yīng)用于苦味酸的檢測

張彥，康晶晶，高鵬飛，蘇艷，伍建林

（1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.澳門科技大學(xué) 中醫(yī)藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門）

0 引言

苦味酸（2，4，6-三硝基苯酚，PA）是一種常見的有毒、有刺激性氣味、不能降解的硝基化合物。幾十年來被廣泛用于制藥、皮革、工業(yè)爆破、煙花行業(yè)和染料行業(yè)中［1-2］，在其生產(chǎn)和使用過程中不可避免的被釋放到空氣、土壤和地下水中，帶來一系列的環(huán)境污染問題［3］。而且，在生物系統(tǒng)中苦味酸的鄰位硝基被還原為氨基，苦味酸被轉(zhuǎn)化為2-氨基-4，6-二硝基苯酚，表現(xiàn)出比苦味酸更強(qiáng)的誘變活性［4］。因此，快速、靈敏地檢測苦味酸對于保護(hù)人類健康和監(jiān)測環(huán)境污染是非常必要的。

近年來，基于苦味酸的檢測方法有質(zhì)譜法［5］、電化學(xué)法［6］、氣相色譜法［7］等，但這些方法成本高、耗時長或樣品前處理比較復(fù)雜、干擾大，因而其實(shí)際應(yīng)用受到限制。熒光光譜法成本低廉、響應(yīng)時間快、操作簡單、選擇性高。銀納米簇作為一種新型的熒光材料，具有較大的斯托克斯位移、優(yōu)越的生物相容性以及獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)［8-9］，在生物傳感、新型催化劑、生物標(biāo)記、熒光成像等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［10］?；瘜W(xué)還原法的操作簡單、反應(yīng)速率快，因此通常采用化學(xué)還原法來制備銀納米簇［11］。銀納米團(tuán)簇的粒徑、穩(wěn)定性、熒光特性等性質(zhì)與配體有很大的關(guān)系，通過引入不同配體，不僅可以實(shí)現(xiàn)更好的穩(wěn)定性，而且也可以增強(qiáng)團(tuán)簇的發(fā)光性能。硫醇是含有巰基的生物小分子化合物，由于巰基和金屬原子的親和力較強(qiáng)，硫醇保護(hù)的銀納米簇不僅具有較高的穩(wěn)定性，還具有良好的生物相容性［12］。硫普羅寧（N-（2-巰基丙酰基）甘氨酸，Tiopronin）是一種生物相容性優(yōu)良的巰基藥物，能夠與金屬形成很強(qiáng)的金屬-硫鍵，常用作金屬納米粒子的穩(wěn)定劑［13-14］。

本文以硝酸銀為原料，硫普羅寧為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉為還原劑，在室溫下成功合成了發(fā)綠色熒光的銀納米簇。基于PA可使AgNCs熒光發(fā)生猝滅，建立了檢測PA含量的熒光分析方法，可快速檢測水體環(huán)境中的苦味酸。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

硝酸銀、硫普羅寧（TP）、硼氫化鈉、苦味酸等均為分析純。BR（Britton-Robinson Buffer So?lution）緩沖溶液用0.04 mol/L磷酸（H3PO4）、硼酸（H3BO3）、醋 酸（CH3COOH）和 0.2 mol/L NaOH溶液配制。紫外可見分光光度（Hitachi，U-2910）；愛丁堡穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（FLS920）；紅外光譜儀（珀金埃爾默儀器有限公司，Paragon 1000）；納米粒徑電位分析儀（馬爾文，NanoZS90）；透射電子顯微鏡（JEOL有限公司，JEM-2100）；暗箱式自動紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠，ZF-2C）；pH酸度計（上海梅特勒-托利多儀器公司，F(xiàn)E20）；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，KQ-500）。

1.2 銀納米簇的制備

在潔凈的圓底燒瓶，依次加入5 mL 0.06 mol/L硫普羅寧（TP），5 mL 0.01 mol/L AgNO3溶液混和均勻，有白色絮狀物生成。室溫下攪拌30 min后，將500 μL 1 mol/L的硼氫化鈉水溶液迅速加入到混合溶液中反應(yīng)5 h，溶液從黑棕色變?yōu)辄S棕色。將制得的銀納米簇保存在4℃的冰箱中備用。

1.3 苦味酸濃度的測定

將120 μL AgNCs溶液分散于pH=5.0的BR緩沖溶液中，測量熒光光譜。然后，將不同濃度的PA溶液依次加入到上述溶液中，室溫孵育1 min后在激發(fā)波長為376 nm，發(fā)射波長為520 nm下記錄其熒光光譜。同上述條件下，AgNCs溶液中加入1.8×10-3mol/L的干擾物，包括有：Na+、K+、Ni2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Ba2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Zn2+、Cd2+、Fe3+、Cr3+、Co2+、Mn2+、Cl-、Br-、Ac-、S2-、CO32-、SO42-、ClO4-、BrO3-、NB（硝基苯）、PHE（苯酚）、IPA（間苯二甲酸）、o-NP（鄰硝基酚）、m-NP（間硝基酚）、p-NP（對硝基酚）、o-DHB（鄰苯二酚）、p-DHB（對苯二酚）、o-phen（鄰菲羅啉）、2-DNP（2-硝基苯酚）、2，4，6-三硝基甲苯（TNT），掃描且記錄其熒光變化；最后，摻入干擾物的混合溶液中加入9.0×10-5mol/L的PA溶液，測定熒光強(qiáng)度。

1.4 實(shí)際樣品的檢測

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對實(shí)際水樣中PA的含量進(jìn)行測定，實(shí)際水樣取自山西大學(xué)令德湖水和實(shí)驗(yàn)室自來水。使用過濾器將水樣過濾，再以10 000 r·min-1離心10 min，除去水中雜質(zhì)。將1 mL水樣、120 μL的AgNCs和BR緩沖溶液混合，測定熒光光譜，并將不同濃度PA溶液加入上述溶液中，測其熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNCs的性能表征

通過多種分析手段來表征AgNCs的形貌、尺寸、結(jié)構(gòu)和熒光性質(zhì)。透射電子顯微鏡（圖1（a））顯示，AgNCs的粒徑較均勻、分散性較好，平均粒徑為2.96 nm。如紅外光譜（圖1（b））所示，1 752 cm-1附近為TP中游離羧基中的羰基伸縮振動，而在AgNCs中該處的吸收峰峰強(qiáng)度明顯降低，說明羰基與銀配位附著至AgNCs的表面；比較AgNCs和TP的紅外光譜曲線可以發(fā) 現(xiàn) ，TP的 S?H 拉 伸 帶（2 540 cm-1）在AgNCs的光譜中消失，說明了Ag與TP分子形成了硫醇鹽，進(jìn)一步證明了AgNCs的成功合成［10］。XPS 結(jié)果顯示，S 2p能譜中有 162.4（S?Ag），163.6（S?H），164.8（S 2p1/2）三個特征吸收峰（圖 1（c））。Ag 3d5/2峰和 Ag 3d3/2峰的結(jié)合能分別位于367.9 eV和374.08 eV處（ 圖 1（d）），367.9 eV 處 的 峰 介 于 Ag（I）（367.5 eV）和純Ag（0）（368.2 eV）之間，進(jìn)一步證明了硫普羅寧包覆的銀納米團(tuán)簇已經(jīng)被成功合成。

圖1 （a）AgNCs的TEM圖像和粒徑分布直方圖；（b）TP和AgNCs的紅外光譜圖；AgNCs的高分辨X射線光電子能譜圖（c）S 2p；（d）Ag 3dFig.1 (a)TEM image and particle size distribution ofAgNCs.(b)Infrared spectra of TP andAgNCs.High resolution X-ray pho‐toelectron spectroscopies ofAgNCs(c)S 2p,(d)Ag 3d

通過紫外可見吸收光譜可得AgNCs在376 nm附近表現(xiàn)出明顯的吸收峰（圖2（a）），歸因于其表面的n→π*躍遷。熒光光譜顯示AgNCs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為376 nm和520 nm。從插圖上可以看到AgNCs在日光燈下為黃棕色，而在365 nm紫外燈照射下發(fā)出綠色熒光。如圖2（b）所示，使用376 nm波長的光照射40 min后，AgNCs的熒光強(qiáng)度仍能保持在95%以上，說明該納米簇具有良好的抗光漂白性。此外，AgNCs的Zeta電位為?16.4 mV，表明該納米簇帶負(fù)電性，在水溶液中有良好的穩(wěn)定性。當(dāng)在4℃下保存5個月后，AgNCs的熒光強(qiáng)度仍能保持相對穩(wěn)定（圖2（c））。

圖2 （a）AgNCs、AgNO3和TP的紫外可見吸收光譜圖，AgNCs熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖，插圖：AgNCs在可見光和365 nm的紫外光下的照片；（b）在AgNCs的熒光強(qiáng)度與紫外燈照射時間的關(guān)系圖；（c）在4℃下保存5個月AgNCs的熒光強(qiáng)度圖Fig.2 (a)UV-visible absorption spectra ofAgNCs,AgNO3and TP.Fluorescence excitation(red lines)and emission spectra(blue lines)ofAgNCs.Inset:pictures ofAgNCs under visible light and ultraviolet light of 365 nm.(b)Relationship between fluorescence intensity ofAgNCs and exposure time of ultraviolet lamp.(c)The fluorescence intensity ofAgNCs stored at 4℃for 5 months

2.2 探究PA的最佳檢測條件

考察了孵育時間、AgNCs的用量、pH值對苦味酸檢測的影響。將PA加入到AgNCs中，熒光強(qiáng)度在1 min內(nèi)快速下降，并在接下來的20 min內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3（a）），因此，AgNCs對PA有較快的響應(yīng)。當(dāng)AgNCs用量為120 μL時，熒光強(qiáng)度降低值F0-F值最大（圖3（b）），因此，選用120 μL AgNCs作為檢測苦味酸的最佳濃度。如圖3（c）所示，pH值對加入PA后熒光強(qiáng)度的降低值F0-F基本無太大影響，但當(dāng)pH>5.0時，AgNCs自身的熒光強(qiáng)度F0降低（圖3（c）插圖），所以選擇pH=5.0的BR緩沖液進(jìn)行后續(xù)的檢測實(shí)驗(yàn)。

圖3 （a）孵育時間對AgNCs熒光強(qiáng)度的影響；（b）AgNCs的用量對檢測PA的影響；（c）pH值對AgNCs傳感PA的影響，插圖為pH值F0和F值的影響。F0和F分別是不加入PA和加入PA時AgNCs的熒光強(qiáng)度值Fig.3 （a）Effect of incubation time on fluorescence intensity ofAgNCs.（b）The effect of various dosages ofAgNCs on the detection of PA.（c）The influence of pH value on the detection of PA.Inset：The effect of pH on F0and F

2.3 測定苦味酸的選擇性和抗干擾性

為了探索AgNCs對PA的熒光傳感方法是否可用于實(shí)際樣品中PA的特異性檢測，考察了水體系中可能存在的陽離子、陰離子和不同硝基酚類化合物等潛在干擾物質(zhì)對AgNCs和加入PA后AgNCs的熒光響應(yīng)情況。如圖4所示，常見干擾物和其他硝基化合物的存在對AgNCs的熒光強(qiáng)度只產(chǎn)生輕微的干擾。只有加入PA后，AgNCs的熒光強(qiáng)度才會發(fā)生明顯降低。這說明本文構(gòu)建的熒光檢測方法對PA具有較好的選擇性，可用于實(shí)際樣品中PA的檢測。

圖4 AgNCs對PA與常見干擾物和其他硝基酚類化合物等潛在干擾物質(zhì)的選擇性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Selectivity ofAgNCs for the coexistence of PAwith common interferents and other nitrophenols

2.4 對PA檢測的靈敏度

如圖5所示，當(dāng)PA的濃度從0增加到138 μmol/L時，AgNCs的熒光幾乎完全猝滅，而且相對熒光強(qiáng)度與PA濃度呈現(xiàn)兩段良好的線性關(guān)系：PA 濃度在 3.99×10-7mol/L～4.69×10-6mol/L范圍內(nèi)，線性方程為 log（F0∶F）=0.039［PA］（μmol/L）+0.006，線性相關(guān)系數(shù) R2=0.993；PA濃度在范圍內(nèi)4.69×10-6mol/L～1.38×10-4mol/L，線性方程為 log（F0∶F）=0.004［PA］（μmol/L）+0.205，R2=0.999，檢 出 限 為 0.045 μmol/L。該方法的檢出限低于國家環(huán)境保護(hù)總局（GB3838-2002）規(guī)定的地表水生產(chǎn)飲用水中PA的最低允許濃度（2.2 μmol/L）。將本文的PA檢測方法與已報道的基于發(fā)光納米材料的方法進(jìn)行了比較，如表1所示。與其他方法相比，本文中AgNCs的合成不需加熱，僅需室溫下制備，合成步驟和反應(yīng)時間也基本與文獻(xiàn)報道相當(dāng)，而且對PA的檢測具有較高的靈敏度。

圖5 不同濃度的PA對AgNCs的熒光響應(yīng)圖（a）及相對熒光強(qiáng)度與PA濃度的線性關(guān)系，見（b）和（c）Fig.5 Fluorescence response diagram ofAgNCs in different concentrations of PA（a）,and the linear relationship between relative fluorescence intensity and concentrations of PA,see（b）and（c）

表1 AgNCs與其他熒光納米材料測定PA的比較Table 1 Comparison between theAgNCs and other fluorescent nanomaterials for the determination of PA

2.5 檢測苦味酸機(jī)理的探究

苦味酸即為2，4，6-三硝基苯酚，其結(jié)構(gòu)式如圖6（a）所示，三個硝基有很強(qiáng)的吸電子作用，使酚羥基電子云密度降低，氫原子容易解離從而表現(xiàn)強(qiáng)酸性質(zhì)（pKa=0.25）［4］。AgNCs中的TP配體上的胺基和羧基因去質(zhì)子化后表現(xiàn)出堿的性質(zhì)，因此PA可能通過酸堿相互作用與AgNCs中的TP結(jié)合，同時電子云從富電子的AgNCs向吸電子的PA中偏移，進(jìn)而導(dǎo)致熒光猝滅［15］。熒光壽命測試結(jié)果（圖6（b））顯示AgNCs的平均壽命為2.99 ns，加入苦味酸后的熒光壽命為2.65 ns。加入苦味酸前后AgNCs的熒光壽命變化可以忽略，進(jìn)一步證實(shí)了PA與AgNCs進(jìn)行了結(jié)合，通過酸堿誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移使AgNCs的熒光發(fā)生了猝滅，該檢測機(jī)理與已報道的研究工作一致［2］。此外，如圖6（c）所示，AgNCs的激發(fā)光譜與PA的紫外-可見吸收光譜有很大程度的重疊，這表明PA誘導(dǎo)AgNCs的熒光猝滅還有可能源于內(nèi)濾效應(yīng)?；贏gNCs的PA檢測方法在3.99×10-7mol/L至1.38×10-4mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)兩段良好的線性關(guān)系（圖5），說明酸堿誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移和內(nèi)濾效應(yīng)同時存在于AgNCs的猝滅過程。在PA的濃度較高并大于4.69×10-6mol/L時，空間位阻效應(yīng)增強(qiáng)，酸堿作用誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的作用減弱，內(nèi)濾效應(yīng)成為主導(dǎo)因素，PA對AgNCs的猝滅程度亦有所減緩。

圖6 （a）AgNCs與PA相互作用示意圖；（b）不加入和加入PA的AgNCs熒光壽命譜圖；（c）PA的紫外可見吸收光譜（黑色線）和AgNCs的熒光激發(fā)光譜（紅色線）Fig.6 (a)Schematic of interaction betweenAgNCs and PA.(b)The fluorescence lifetime spectra ofAgNCs without and with PA.(c)The UV-visible absorption spectrum of PA(black line)and the fluorescence excitation spectrum ofAgNCs(red line)

2.6 對PA檢測的精密度

精密度對于分析檢測方法是非常重要的參數(shù)之一，本文探討了AgNCs在日內(nèi)和日間對不同濃度PA檢測的精密度RSD，重復(fù)檢測次數(shù)為6 次，進(jìn)樣的濃度分別為 0.8 μmol/L、2.5 μmol/L、10.4 μmol/L、50.0 μmol/L、100.0 μmol/L，如表2所示，日內(nèi)分析的RSD值在0.31%～1.55%之間，日間分析的RSD值在1.03%～2.67%之間。這些結(jié)果有力地證明了基于銀納米簇檢測PA的方法重現(xiàn)性較好，可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測。

表2 在日內(nèi)和日間對不同濃度PA檢測結(jié)果的精密度Table 2 The results of precision assessment for different levels of PAin intra-day and inter-day,respectively

2.7 實(shí)際樣品分析

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法將建立的熒光檢測方法應(yīng)用于令德湖和實(shí)驗(yàn)室自來水中PA的含量測定。將濃度為2.37、5.07、10.43 μmol/L的PA溶液分別加入到實(shí)際水樣中，表3檢測結(jié)果顯示，PA的回收率在96.1%～108.3%之間，說明將此方法應(yīng)用于檢測實(shí)際樣品中苦味酸有良好的可靠性。

表3 AgNCs熒光傳感體系檢測實(shí)際水樣中的PATable 3 Fluorescence sensing system ofAgNCs for the detec‐tion of PAin water samples

3 結(jié)論

以硫普羅寧為配體，硼氫化鈉為還原劑，在室溫下通過一鍋法制備出具有綠色熒光的AgNCs?；赑A對AgNCs熒光的猝滅作用，構(gòu)建了檢測PA的熒光傳感方法。該方法靈敏度較高，響應(yīng)迅速，具有良好的選擇性和重現(xiàn)性，已成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中的PA的檢測，說明AgNCs對PA的檢測具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值。