昆蟲dsRNA吸收機(jī)理研究現(xiàn)狀與展望

張建珍 ，史學(xué)凱，李帥，楊霖，柴林，朱坤炎

（1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；3.堪薩斯州立大學(xué)，美國(guó) 曼哈頓 堪薩斯州 66506）

0 引言

1990年，Napoli和Jorgensen在研究植物花色過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcrip?tional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象［1］。Fire等在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elagans）及真菌中相繼報(bào)道這一現(xiàn)象，并將此現(xiàn)象定義為RNA干擾（RNA interference，RNAi）［2-3］，是指雙鏈 RNA 特異性降解靶標(biāo)基因mRNA序列的過(guò)程［3］。

RNAi主要包含三種通路，分別為short/small interfering RNAs（siRNAs）介導(dǎo)的siRNA通路、microRNAs（miRNAs）介導(dǎo)的miRNA通路和P-element induced wimpy tesis（Piwi）-interacting RNAs（PiRNAs）介導(dǎo)的piRNA通路。其中，siRNA介導(dǎo)的基因沉默在昆蟲基因功能研究及害蟲防治中都起著舉足輕重的作用，其作用機(jī)制為外源或內(nèi)源產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈dsRNA進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中核酸內(nèi)切酶Dicer2的作用及R2D2和Loqs的輔助下，切割成大小為21 nt～23 nt的雙鏈siRNA，其中5′端含有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3′端含有一個(gè)羥基并突出2 nt懸垂，這種結(jié)構(gòu)是提高 RNAi效 應(yīng) 所 必 需 的［4-5］。 siRNA 與 Ago?naute2（Ago2），以及用于形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）的相關(guān)蛋白（RISC-associated proteins，RP）結(jié)合，形成RISC。在ATP供能的條件下，RISC將雙鏈siRNA解開，正義鏈被迅速降解，反義鏈siRNA與Ago2等蛋白結(jié)合形成有活性的RISC，在反義鏈的引導(dǎo)下，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶標(biāo)mRNA序列，在Ago2的作用下裂解靶標(biāo)mRNA，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的快速及持續(xù)性沉默［6］。siRNA的作用過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 siRNA介導(dǎo)的RNAi通路示意圖Fig.1 Model of siRNA-mediated RNAi pathway

由于RNAi技術(shù)的特異性、高效性、對(duì)環(huán)境無(wú)污染及相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，引起生物學(xué)家廣泛關(guān)注，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，該技術(shù)迅速向基因治療及害蟲防治領(lǐng)域拓展［7-8］。目前，科學(xué)家們致力于研發(fā)更多靶向害蟲防治的dsRNA生物制劑，并將基于RNAi的害蟲防治生物制劑稱為“第四代殺蟲劑”。

1 dsRNA吸收機(jī)制

外源dsRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的首要環(huán)節(jié)是被組織細(xì)胞吸收，昆蟲細(xì)胞吸收dsRNA的效率是決定RNAi效率的關(guān)鍵限速步驟［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)昆蟲體內(nèi)dsRNA吸收存在兩大類信號(hào)通路，分別為SID跨膜通道蛋白介導(dǎo)的通路和真核細(xì)胞的胞吞作用途徑（圖2和圖3）。

圖2 SID跨膜通道介導(dǎo)的dsRNA吸收示意圖Fig.2 Model of SID mediated dsRNAuptake pathways

圖3 胞吞介導(dǎo)的dsRNA吸收示意圖Fig.3 Model of endocytosis mediated dsRNAuptake pathways

1.1 SID跨膜通道介導(dǎo)的吸收

Winston等在線蟲中發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性RNA干擾缺陷基因1（systemic RNA interference defective 1，sid?1），該基因是體內(nèi)細(xì)胞輸入RNAi沉默信號(hào)及組織間傳遞所必需的［11］。隨后，陸續(xù)在線蟲中發(fā)現(xiàn) sid?2、sid?3、sid?5。sid?2在線蟲腸腔膜上特異表達(dá)，介導(dǎo)dsRNA內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞［12］；sid?3作為一種酪氨酸激酶，負(fù)責(zé)磷酸化dsRNA吸收通路相關(guān)蛋白，有助于dsRNA的吸收［13］；sid?5主要定位于內(nèi)體，負(fù)責(zé)RNAi沉默信號(hào)的輸出［14］。

近年來(lái)，科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)昆蟲中也存在sid?1同源基因（被稱為sid?1 like基因），并對(duì)其功能展開研究，研究發(fā)現(xiàn)不同昆蟲sid?1 like基因功能存在差異。例如鞘翅目馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）和玉米根螢葉甲（Di?abrotica virgifera virgifera），半翅目褐飛虱（Nilaparvata lugens）和 豌 豆 蚜（Acyrthosiphon pisum），膜翅目西方蜜蜂（Apis mellifera）中均存在sid?1 like基因，在dsRNA吸收過(guò)程中發(fā)揮作用；相反，雖然鞘翅目赤擬谷盜（Tribolium casta?neum），直翅目沙漠蝗（Schistocerca gregaria），鱗翅目家蠶（Bombyx mori）體內(nèi)可表達(dá) sid?1 like基因，但其并不參與dsRNA吸收［14-21］。果蠅（Drosophila sp.）中并不存在 sid?1 like基因，但將果蠅S2細(xì)胞浸泡于含有dsRNA的培養(yǎng)基中，仍能引起 S2細(xì)胞 RNAi效應(yīng)［22］，這表明，昆蟲體內(nèi)可能存在另一種dsRNA吸收機(jī)制。

1.2 胞吞作用

胞吞作用是真核細(xì)胞的正常生理過(guò)程，負(fù)責(zé)將胞外物質(zhì)吞入胞內(nèi)，主要參與生物體免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織代謝平衡等，對(duì)生物正?；顒?dòng)起重要作用［23］。研究表明，dsRNA可通過(guò)細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入昆蟲細(xì)胞［21］。細(xì)胞中存在多途徑的胞吞方式，依據(jù)其胞吞囊泡大小及作用蛋白不同，可大致分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞、大型胞飲依賴的內(nèi)吞、吞噬作用依賴的內(nèi)吞及其他類型的內(nèi)吞通路（表1）。

表1 細(xì)胞不同內(nèi)吞通路特征及相關(guān)抑制劑Table 1 Characteristics of different endocytosis pathways and related inhibitors

1.2.1 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路研究得最為深入，該通路負(fù)責(zé)內(nèi)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗原、生長(zhǎng)因子、可溶性大分子和病毒等［24］。參與該途徑的作用蛋白主要為網(wǎng)格蛋白和其輔助蛋白（adap?tor protein 2（AP2）和 β-arrestin）等，其內(nèi)吞過(guò)程中形成網(wǎng)格蛋白有被小窩（clathrin-coated pit，CCP），直徑約100 nm，隨后形成網(wǎng)格蛋白有被小泡（clathrin-coated vesicle，CCV），將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。

氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）可阻斷網(wǎng)格蛋白在細(xì)胞膜處的組裝，特異性抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路。Saleh等通過(guò)基因組篩選，生化手段及藥理實(shí)驗(yàn)（CPZ處理）發(fā)現(xiàn)果蠅S2細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式吸收外源dsRNA［22］。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者利用藥理手段和RNAi of RNAi技術(shù)，分別發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜，馬鈴薯甲蟲，沙漠蝗，豌豆蚜和埃及伊蚊（Aedes ae?gypti）等昆蟲類群可同樣利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)化外源 dsRNA［17，21，25-27］。

1.2.2 小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞

小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞中研究得較為透徹，該途徑主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)體、納米顆粒及血清蛋白等［28-29］。參與該途徑的作用蛋白主要為小窩蛋白。此外，脂筏對(duì)其內(nèi)吞通路的形成至關(guān)重要。在內(nèi)吞過(guò)程中，胞外配體與細(xì)胞膜處受體結(jié)合，在小窩蛋白作用下質(zhì)膜內(nèi)陷形成直徑約50 nm～100 nm的小窩結(jié)構(gòu)；小窩形成后，從質(zhì)膜處分離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［29］。

染料木素（genistein）、甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）、非律平（filipin）和制霉菌素（nystatin）是該通路較為常用的抑制劑，這些抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或移除細(xì)胞膜表面的膽固醇，破壞細(xì)胞膜上小窩的形成，從而阻斷內(nèi)吞路徑。在赤擬谷盜和埃及伊蚊中，內(nèi)化dsRNA均不依賴小窩/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞［25，30］，dsRNA 是否可通過(guò)該途徑內(nèi)化進(jìn)入昆蟲細(xì)胞尚有待進(jìn)一步研究。

1.2.3 大型胞飲依賴的內(nèi)吞

大型胞飲是真核細(xì)胞最古老的內(nèi)吞方式，主要在轉(zhuǎn)運(yùn)體積較大的液泡時(shí)發(fā)揮作用，肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞分裂周期蛋白（Cdc42）和Pak-1等調(diào)節(jié)因子參與其中。在胞飲過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)膜延伸擴(kuò)張，將胞外液體包裹，形成直徑大于0.2 μm的囊泡，隨后形成約5 μm～10 μm的大型胞飲體，與質(zhì)膜分離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［31］。

5-（N-乙基-N-丙基）阿米洛利（5-（N-ethyI-N-isopropyI）amiloride，EIPA），Ly294002和細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，CCD）可有效抑制大型胞飲依賴的內(nèi)吞。EIPA通過(guò)阻斷細(xì)胞膜處的Na+/H+交換過(guò)程，可有效抑制大型胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程［32］；PI3K是完成大型胞飲作用所必需的，LY294002可通過(guò)阻斷PI3K活性來(lái)減弱大型胞飲依賴的內(nèi)吞［33］；CCD可破壞肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效抑制大型胞飲的發(fā)生［25］。Gillet等通過(guò)熒光Cy3標(biāo)記dsRNA，并與嵌合蛋白PTD-DRBD結(jié)合，形成核糖核蛋白粒子（ribonucleoprotein particle，RNP），利用熒光顯微追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，核糖核蛋白粒子通過(guò)大型胞飲依賴的內(nèi)吞作用進(jìn)入棉鈴象甲（Anthonomus grandis）中腸細(xì)胞［34］。

1.2.4 吞噬作用

吞噬作用主要存在于免疫組織中，通過(guò)吸收胞外大于0.5 μm的大顆粒物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)降解，從而對(duì)細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格蛋白和肌動(dòng)蛋白等因子在吞噬過(guò)程起重要作用。類似于其他內(nèi)吞路徑，胞外配體與吞噬作用相關(guān)膜受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜處一系列內(nèi)化信號(hào)，轉(zhuǎn)運(yùn)胞外物質(zhì)進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)吞噬體［35］。

氯喹（chloroquine，CLQ）通過(guò)降低溶酶體酸性從而抑制吞噬作用的發(fā)生，是該途徑的抑制劑之一，該抑制劑在病毒侵染細(xì)胞的研究中廣為應(yīng)用［36］，但在昆蟲dsRNA吸收機(jī)制研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。Rocha等使用大腸桿菌表達(dá)dsRNA，利用RNAi of RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌表達(dá)dsRNA依賴吞噬作用進(jìn)入果蠅S2細(xì)胞［37］。

1.2.5 其他內(nèi)吞通路

細(xì)胞中還存在其他內(nèi)吞通路，如flotillin依賴的內(nèi)吞、Arf6依賴的內(nèi)吞、GRAF1依賴的內(nèi)吞和RhoA依賴的內(nèi)吞。這幾種細(xì)胞內(nèi)吞路徑的研究報(bào)道較少，其吸收機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。迄今為止，dsRNA是否可利用這些內(nèi)吞方式入胞尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 不同昆蟲吸收dsRNA機(jī)制存在差異

不同昆蟲類群間dsRNA吸收機(jī)制存在差異，且同一種昆蟲存在多種內(nèi)化dsRNA的途徑（表2）。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用較為常見(jiàn)，SID介導(dǎo)的吸收機(jī)制也有報(bào)道，但研究手段較為單一，主要是通過(guò)RNAi of RNAi技術(shù)。不同種昆蟲RNAi效率存在較大差異，例如鞘翅目（如玉米根螢葉甲，馬鈴薯甲蟲）和直翅目（如飛蝗Locusta migratoria）等昆蟲，RNAi效率較高，相反，雙翅目（如果蠅）和鱗翅目（如歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis，斜紋夜蛾Spodoptera litu?ra）等昆蟲 RNAi效率卻很低［39-44］。是否昆蟲間RNAi效率差異與dsRNA吸收機(jī)制差異存在關(guān)聯(lián)？這些問(wèn)題饒有興趣，值得深入探究。

表2 昆蟲dsRNA吸收通路研究概覽Table 2 Overview of dsRNAuptake pathways in insects

3 影響昆蟲dsRNA吸收效率的制約因素及應(yīng)對(duì)策略

不同種昆蟲RNAi敏感性不同，揭示影響dsRNA吸收的關(guān)鍵因素，從而提出相應(yīng)解決對(duì)策，有望改善昆蟲細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收效率，從而提高RNAi效率，加速dsRNA生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。

3.1 影響昆蟲dsRNA吸收效率的因素

3.1.1 dsRNA片段長(zhǎng)度對(duì)吸收效率的影響

dsRNA片段長(zhǎng)度可以影響細(xì)胞吸收效率。Shale等選用不同長(zhǎng)度dsRNA（21 bp～592 bp）處理果蠅S2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度dsRNA對(duì)靶基因RNAi效率存在顯著差異，dsRNA片段越長(zhǎng)RNAi效率越高［22］，肖達(dá)等也研究了不同長(zhǎng)度dsRNA（50 bp～799 bp）對(duì)赤擬谷盜靶標(biāo)基因沉默效率的影響，發(fā)現(xiàn)片段較長(zhǎng)的dsRNA（799，396，200 bp）沉 默 效 率 顯 著 高 于 50 bp的dsRNA，因此認(rèn)為長(zhǎng)片段dsRNA吸收效率高于短片段dsRNA［45］。韓召軍等通過(guò)體外培養(yǎng)赤擬谷盜中腸，孵育一定不同長(zhǎng)度的dsRNA，隨后定量檢測(cè)中腸細(xì)胞內(nèi)不同長(zhǎng)度dsRNA（21 bp～480 bp）的含量，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度dsRNA吸收效率由高到低依次為480 bp>240 bp>120 bp=60 bp>21 bp［46］，結(jié) 果 與 前 者 一 致 。 這 表 明dsRNA片段越長(zhǎng)，越容易被細(xì)胞吸收，吸收效率越高。

3.1.2 dsRNA結(jié)構(gòu)對(duì)吸收效率的影響

隨著對(duì)dsRNA吸收機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)設(shè)計(jì)dsRNA結(jié)構(gòu)可有效提高dsRNA的穩(wěn)定性及RNAi效率。Abbasi等設(shè)計(jì)了一個(gè)新型的 paperclip dsRNA（23 bp），paperclip dsRNA 的兩端均設(shè)計(jì)有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，但這個(gè)閉環(huán)并不是共價(jià)偶聯(lián)。paperclip dsRNA可通過(guò)不依賴于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入埃及伊蚊細(xì)胞內(nèi)，RNAi效率顯著提高［30］。在昆蟲中（例如果蠅，玉米根螢葉甲，赤擬谷盜等），片段較短的dsRNA（短于 50 bp）不能被細(xì)胞吸收［22，46-47］；然而，埃及伊蚊細(xì)胞可高效吸收帶有環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的dsRNA（23 bp），并發(fā)揮RNAi作用。這種環(huán)狀dsRNA進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

3.1.3 昆蟲腸液及血腔的pH環(huán)境及核酸酶對(duì)吸收效率的影響

研究表明，dsRNA在昆蟲腸液或血腔的持續(xù)性和穩(wěn)定性與細(xì)胞吸收dsRNA數(shù)量密切相關(guān)。不同昆蟲類群血淋巴pH維持在6.4～7.5之間，然而腸液pH卻存在很大差異。鱗翅目昆蟲腸液pH為11～12，由于dsRNA在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，導(dǎo)致其在腸液中被水解，腸上皮細(xì)胞無(wú)法有效吸收完整的dsRNA，這是鱗翅目昆蟲對(duì)RNAi不敏感的關(guān)鍵因素之一［48］。

另外，多種昆蟲（例如棉鈴象甲，飛蝗，家蠶，斜紋夜蛾，沙漠蝗，煙粉虱（Bemisia tabaci）和玉米螟等）體內(nèi)存在dsRNA降解酶（dsRNA-degrading enzymes，dsRNases）和核酸酶 REase，均可快速降解腸液或血腔中的dsRNA，導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞無(wú)法攝入完整的dsRNA，導(dǎo)致RNAi效率極低［41，49-54］。

3.2 提高昆蟲dsRNA吸收效率的策略

細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收效率是影響RNAi效率的主要限速步驟，提高dsRNA在昆蟲體內(nèi)的完整性及細(xì)胞吸收效率可有效提高RNAi效率。

3.2.1 納米材料介導(dǎo)dsRNA遞送

部分納米顆粒通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的核酸進(jìn)行結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，可免受昆蟲腸液和血液的降解，并通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入昆蟲細(xì)胞。例如Zhang等利用殼聚糖包裹dsRNA，形成殼聚糖-dsRNA復(fù)合物，有效提高岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）對(duì)dsRNA的吸收，RNAi效率顯著提升［55］。另外，Xu等報(bào)道苝酰亞胺（perylene diimides，PDI）熒光納米載體包裹dsRNA可迅速進(jìn)入離體培養(yǎng)的棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）活體組織，顯示出較高的組織吸收率［56］；沈杰等利用陽(yáng)離子核-殼熒光納米材料（FNP）遞送dsRNA，隨后噴灑于蚜蟲（Aphis glycines）表皮處，納米載體在1 h內(nèi)迅速通過(guò)表皮進(jìn)入血腔［57］。納米材料在dsRNA遞送過(guò)程的成功應(yīng)用，促進(jìn)了dsRNA核酸農(nóng)藥在RNAi不敏感昆蟲中的基因功能研究及田間蟲害防控。

3.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)dsRNA遞送

除納米材料外，脂質(zhì)體由于其無(wú)毒性及易降解性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究學(xué)者的青睞。脂質(zhì)體可攜帶dsRNA穿透昆蟲細(xì)胞膜磷脂雙分子層，在昆蟲基因功能研究中被廣泛應(yīng)用。Taning等發(fā)現(xiàn)Lipofectamine 2000可有效遞送dsRNA，導(dǎo)致櫻桃果蠅（Drosophila suzukii）靶基因沉默，死亡率顯著提高［58］；Zhang等選用3種脂質(zhì)體（Li?pofectamine 2000，DMRIE-C 和 Cellfectin）遞 送dsRNA，發(fā)現(xiàn)鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haema?physaloides）RNAi效率顯著提高，用帶有熒光信號(hào)的dsRNA可視化觀察其吸收情況，結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹的dsRNA可快速穿透蜱蟲表皮進(jìn)入體內(nèi)，體內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)；相反，裸露的dsRNA熒光信號(hào)微弱，說(shuō)明脂質(zhì)體可高效遞送dsRNA［59］。由于脂質(zhì)體成本較高，尚未在田間應(yīng)用。

3.2.3 微生物介導(dǎo)dsRNA遞送

常見(jiàn)的微生物遞送dsRNA載體包括病毒、細(xì)菌、真菌、共生菌和酵母。研究表明，微生物介導(dǎo)dsRNA遞送系統(tǒng)可有效促進(jìn)昆蟲細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收，提高RNAi效率。例如橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）、煙粉虱和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）均可通過(guò)細(xì)菌表達(dá)dsRNA系統(tǒng)，致使靶基因沉默效率大幅提升，蟲體死亡 率顯 著 提 高［60-62］；家蠶 對(duì) RNAi不 敏感 ，Uhlirova等選用病毒介導(dǎo)dsRNA侵染家蠶，成功導(dǎo)致靶基因的表達(dá)顯著下調(diào)，造成化蛹異常，成蟲形態(tài)缺陷［63］；夏玉先等通過(guò)真菌表達(dá)dsRNA處理飛蝗，致其死亡率可顯著提高［64］；Dyson等報(bào)道共生菌表達(dá)dsRNA，處理西花薊馬（Frankliniella occidentalis）和長(zhǎng)紅錐蝽（Rhod?nius prolixus），導(dǎo)致這兩種昆蟲死亡率顯著提高［65］；Mysore等對(duì)岡比亞按蚊喂食表達(dá)有shR?NA的釀酒酵母，其幼蟲靶基因顯著下調(diào)，出現(xiàn)100%死亡率［66］。由于微生物介導(dǎo)dsRNA遞送系統(tǒng)成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，植物保護(hù)領(lǐng)域?qū)W者已著手將其應(yīng)用于農(nóng)田害蟲防治，可以預(yù)期，該技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景。

3.2.4 設(shè)計(jì)dsRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)原有dsRNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可有效提高其在蟲體內(nèi)穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞吸收dsRNA。僅有Abbasi等報(bào)道對(duì)dsRNA結(jié)構(gòu)的改造，埃及伊蚊細(xì)胞可高效吸收帶有環(huán)狀的dsRNA，RNAi效率顯著提高［30］。關(guān)于dsRNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步的探究。

4 結(jié)論與展望

農(nóng)田害蟲對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性日趨嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留、病蟲害防效下降給食品安全、生態(tài)環(huán)境和人類健康造成重大影響，同時(shí)給作物優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。采用RNAi技術(shù)制備核酸農(nóng)藥，是植保領(lǐng)域新興顛覆性前沿技術(shù)和重要發(fā)展方向，是國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥行業(yè)的前沿?zé)狳c(diǎn)，有望成為“第四代新型殺蟲劑”。然而，昆蟲吸收dsRNA效率制約RNAi技術(shù)的應(yīng)用，成為害蟲防治的一大障礙。因此，揭示不同昆蟲dsRNA吸收機(jī)制，靶向設(shè)計(jì)dsRNA遞送載體，提高dsRNA在蟲體的穩(wěn)定性，克服昆蟲細(xì)胞吸收dsRNA瓶頸，高效遞送dsRNA進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，將大大促進(jìn)核酸農(nóng)藥在農(nóng)田中的廣泛應(yīng)用。