神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌生物標志物與治療靶點研究進展

周 振，馮立明，姚旭東，葉 林,

(1.南京醫(yī)科大學上海十院臨床醫(yī)學院泌尿外科，南京 211166；2.新疆沙灣市人民醫(yī)院普外泌尿科，新疆 沙灣 832100；3.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200072)

前列腺癌是全球男性最常見的惡性腫瘤之一，位居美國男性發(fā)病率第1位、死亡率第2位[1]，近年我國前列腺癌發(fā)病率也持續(xù)上升。盡管幾乎所有的轉(zhuǎn)移性前列腺癌初期都對內(nèi)分泌治療敏感，然而經(jīng)過12～18個月的治療，患者都不可避免地發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)，最終導致疾病的復發(fā)和進展[2]。

盡管近年來晚期前列腺癌的治療手段發(fā)展迅速，但還有較多問題需要解決，且耐藥性成為了目前的主要難題。前列腺癌的耐藥機制多種多樣，通常發(fā)生在激活的雄激素受體(androgen receptor,AR)信號轉(zhuǎn)導的背景下。雖然AR是前列腺癌開始和進展的主要驅(qū)動因素，但部分前列腺癌類型初始相對獨立于AR，甚至在疾病過程中始終不依賴于AR的調(diào)控。

神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)多發(fā)生于長期ADT后，也稱治療誘導的NEPC，是一種預后極差的CRPC類型[3]。譜系可塑性和向小細胞NEPC的組織學轉(zhuǎn)化是晚期前列腺癌治療耐藥性的機制之一，這也逐漸被學術(shù)界廣泛認可。神經(jīng)內(nèi)分泌細胞在生理上分散于前列腺所有解剖區(qū)域的腺體上皮內(nèi)。光鏡下可見于分泌細胞之間的基底層含有多種肽激素，如嗜鉻粒A(chromogranin A,CgA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、血清素、組胺、降鈣素、神經(jīng)肽Y、血管活性腸肽、胃泌素、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白等。近年來，研究已經(jīng)確定了NEPC基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化，將NEPC與常規(guī)前列腺腺癌區(qū)分，指出了其新的機制和治療靶點。NEPC是在疾病進展過程中從前列腺腺癌中克隆產(chǎn)生的，早期基因組變異序列相似，并獲得新的分子特征，所有這些導致腫瘤細胞脫離雄激素受體活性進行增殖，最終證明了從腔內(nèi)前列腺癌表型到小細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的譜系轉(zhuǎn)換。識別最易受譜系可塑性影響的前列腺腫瘤亞群，制定有效的策略來早期檢測NEPC患者并加以干預治療，二者最終將大大改善前列腺癌患者的預后。鑒于臨床上NEPC診斷與治療的困難性，本文回顧了NEPC近些年新出現(xiàn)的治療靶點，并討論了可能對未來臨床研究設計有幫助的生物標志物。

1 新興的生物標志物

一些基于腫瘤組織和動物模型的研究已經(jīng)確定了去勢抵抗性前列腺腺癌和NEPC之間的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳之間的差異[4]。雖然這些研究促進了機制研究和新靶點的驗證，但在臨床工作中獲得轉(zhuǎn)移性組織來進行廣泛的分子檢測是一個主要挑戰(zhàn)。在評估NEPC時，活檢通常是小范圍的，并優(yōu)先用于臨床確診(腫瘤形態(tài)、免疫組化)和靶向基因組分析，以便于確定目前已批準上市的藥物治療[如奧拉帕尼(Olaparib)、魯卡帕尼(Rucaparib)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)]的靶點。經(jīng)典神經(jīng)內(nèi)分泌標志物的免疫組化染色在臨床上經(jīng)常進行，并且可能與其他可以原位測量的NEPC相關(guān)標志物一起進行改進，如對RB1、DLL3、ASCL1、SWI/SNF復合物家族的免疫組化染色。在NEPC患者以及具有侵襲亞類型臨床特征的患者中，經(jīng)常檢測到聯(lián)合腫瘤抑制因子(RB1、TP53、PTEN)表達下降，這可能有助于確定患者是否需要更積極的系統(tǒng)性治療方案，如鉑類基礎化療[5]。這些腫瘤抑制基因缺失發(fā)生的時期以及其他互作基因組和表觀基因組DNA改變在NEPC中的作用，尚未得到廣泛的研究。

盡管越來越多的CRPC患者向NEPC進展，但已發(fā)表的文獻中描述的樣本總數(shù)仍然很低，而且在診斷標準、檢測平臺和所使用的分析方法等方面存在差異。針對原發(fā)腫瘤的評估表明，大多數(shù)NEPC特征通常不能早期發(fā)現(xiàn)，如細胞形態(tài)、RB1缺失、DNA甲基化的狀態(tài)；但早期可能存在與AR獨立性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組變化[6-7]。這些轉(zhuǎn)錄組變化是否預示了早期腫瘤微環(huán)境中NEPC的未來發(fā)展和/或治療反應(如雄激素治療和化療療效比較)尚未得到報道。鑒于大多數(shù)在NEPC中發(fā)現(xiàn)的靶向性改變可能是在治療耐藥性期間獲得的，開發(fā)非侵入性生物標志物(如體液活檢、分子成像)來檢測與NEPC相關(guān)的分子變化是一個很有前景的方法。由于單一病灶轉(zhuǎn)移性活檢并不總是反映單個患者的病理異質(zhì)性，因而非侵入性生物標志物能更準確地反映復合腫瘤負荷和腫瘤異質(zhì)性。

1.1 游離DNA

在轉(zhuǎn)移性前列腺癌等異質(zhì)性疾病方面，漿細胞游離DNA(cell free DNA,cfDNA)研究在基因組和表觀基因組水平上提供了有價值的參考。最近國外有團隊分析了去勢抵抗性前列腺腺癌和NEPC以及與之匹配的cfDNA[8]。他們通過全外顯子和全基因組重亞硫酸鹽測序發(fā)現(xiàn)：(1) cfDNA基因組學概述了關(guān)鍵驅(qū)動因素對NEPC的貢獻(包括TP53、RB1和PTEN的缺失，MYC、MYCN和AR的擴增)；(2) 連 續(xù)取樣可以跟蹤某些亞克隆改變的發(fā)生；(3) 與NEPC相比，去勢抵抗性前列腺腺癌患者的基因組異質(zhì)性水平更高；(4) cfDNA的甲基化水平可以識別NEPC的特異性特征。此外，通過系列樣本分析，他們發(fā)現(xiàn)在臨床確診NEPC之前，循環(huán)體液中可以檢測到NEPC相關(guān)的DNA變化。并且他們發(fā)現(xiàn)針對不同患者以及不同轉(zhuǎn)移部位，與NEPC相關(guān)的cfDNA改變通常是保守的，因此cfDNA的檢測結(jié)果并不是由轉(zhuǎn)移部位決定。目前有關(guān)cfDN檢測的平臺日趨成熟，這就給明確診斷NEPC創(chuàng)造了更多的機會。

雖然cfDNA測序提供了基因組負荷、突變負荷、特定體細胞DNA存在和DNA甲基化狀態(tài)的信息，但對轉(zhuǎn)錄譜和關(guān)鍵靶點表達的非侵入性評估更具挑戰(zhàn)性。Ulz等[9]提出了一種通過cfDNA評估轉(zhuǎn)錄因子活性的方法。具體來說，通過cfDNA全基因組測序和核小體足跡分析，并根據(jù)DNA片段模式推斷轉(zhuǎn)錄因子可及性。研究顯示AR、REST、HOXB13、NKX3-1和GRHL2結(jié)合位點的可及性差異能夠區(qū)分NEPC和前列腺腺癌。將這種新方法與cfDNA甲基化、cfDNA的CHIP-seq或其他技術(shù)相結(jié)合，將為NEPC的表觀遺傳圖景提供更全面的解讀，并有能力跟蹤治療期間的動態(tài)和功能變化。

1.2 循環(huán)腫瘤細胞

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)不僅可以檢測腫瘤負荷，也可以通過mRNA或蛋白分析檢測NEPC和腺癌細胞之間的形態(tài)學差異，以及其他藥物靶點和耐藥機制。利用Epic CTC平臺，Beltran等[10]發(fā)現(xiàn)，與去勢抵抗性前列腺腺癌患者相比，NEPC患者CTCs中更常見的是低或不表達AR、低細胞角蛋白表達，并具有較小的形態(tài)和細胞簇。在接受AR靶向治療的CRPC患者中，CTCs異質(zhì)性與不良預后相關(guān)[11]。最近國外的一項多中心前瞻性研究對107名未接受阿比特龍或恩雜魯胺治療的NEPC患者進行CTC評估[12]，發(fā)現(xiàn)其中8.7%的CTCs具有由細胞形態(tài)和大小確定的NEPC特征，它們的存在以及染色體不穩(wěn)定均與患者不良預后相關(guān)。除了提供預后價值，CTCs還能夠檢測其他腫瘤特征，如AR-V7、SLFN11和DLL3的表達[13]。

1.3 細胞外囊泡

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)包括微囊泡和外泌體，其可以在CRPC患者的循環(huán)體液中檢測到，包括那些CTC陰性但可能攜帶可被定量和連續(xù)跟蹤的腫瘤相關(guān)蛋白的患者[14]。EVs作為NEPC檢測譜系可塑性的生物標志物具有廣泛的研究前景[15]。最新的研究結(jié)果表明，EVs具有重新編碼細胞的能力，它們可能在驅(qū)動譜系可塑性方面發(fā)揮作用。例如，來自表達整合素αVβ3的前列腺癌細胞的EVs能夠刺激腫瘤生長，并在腫瘤模型中驅(qū)動腫瘤神經(jīng)內(nèi)分泌分化[16]。

近年來，外泌體作為新興的非侵入性檢查標志物逐漸走進了大眾視野，有關(guān)其研究得到了越來越廣泛地關(guān)注，但是對于NRPC的探索仍舊十分有限。Lin等[17]發(fā)現(xiàn)，外泌體中的脂肪細胞分化相關(guān)蛋白可以促進前列腺癌向神經(jīng)內(nèi)分泌表型分化。δ-Catenin是β-Catenin超家族中的一種黏附結(jié)合蛋白，有研究報道在NEPC患者尿液來源的外泌體中δ-Catenin含量顯著升高[18]。δ-Catenin可以促進Caveolin-1在前列腺癌來源的外泌體中聚集，而Caveolin-1可以通過NF-κB信號通路促進前列腺向神經(jīng)內(nèi)分泌表型的轉(zhuǎn)化，這或許提示δ-Catenin對NEPC具有重要作用。

1.4 分子成像

分子成像是CRPC另一個新興的非侵入性生物標志物。最近的研究集中于通過正電子發(fā)射斷層掃描-計算機斷層掃描(PET-CT)成像來檢測腫瘤中前列腺特異性膜抗原(PSMA)的表達，以及通過放射性核素靶向治療(如Lu-PSMA-617)[19]。有一部分CRPC在疾病后期表達PSMA水平較低或PSMA表達缺失，也可通過PSMA PET-CT和同時用氟脫氧葡萄糖(fludeoxyglucose,FDG)PET-CT確診的代謝依賴性病變檢測到[20]。PET成像上PSMA陰性或PSMA/FDG不一致與侵襲性疾病和不良預后相關(guān)。當腫瘤失去AR表達時(如在NEPC中所見)，PSMA表達也可能失去。PSMA/FDG成像是否可以用于改善NEPC的檢測是一個十分有價值的研究領(lǐng)域。使用Ga-68-DOTATOC PET/CT通過檢測生長抑素受體表達來研究NEPC的結(jié)果各不相同，與胃腸道或肺的高分化神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相比，NEPC中生長抑素的總體表達較低[21]。

2 靶點與治療方式的選擇

2.1 化療

NEPC和小細胞肺癌在臨床、病理和分子生物學方面較為相似，因此被證實為NEPC或者具有侵襲性變異特征的CRPC(AVPC)患者通常采用小細胞肺癌的治療方案[22]。在國外，對于具有侵襲性變異特征或不利基因組學變異(PTEN、TP53和RB1中至少兩個功能缺失)的患者，卡鉑聯(lián)合紫杉醇化療目前得到了NCCN指南的支持。

2.1.1 紫杉烷+鉑類藥物 在mCRPC患者中，多西他賽是一種標準的治療方式[23]。在Ⅱ期試驗中，多西他賽對小細胞肺癌也顯示出適度的活性，并被認為適合用于聯(lián)合方案的評估。由于以鉑為基礎的化療在神經(jīng)內(nèi)分泌分化的CRPC亞群中具有一定的活性，因此與多西他賽聯(lián)合使用是改善NEPC患者群體療效的合理嘗試。

Culine等[24]對41例血清NSE和/或CgA升高的mCRPC患者進行了Ⅱ期研究，研究對象為順鉑聯(lián)合多西他賽。幾乎一半的患者有前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)反應(即PSA下降≥50%)，12例(41%)有客觀部分反應。中位OS為12個月。聯(lián)合治療的安全性較差，91%的患者出現(xiàn)3～4級中性粒細胞減少，1例患者死于敗血癥。

為了提高安全性，Aparicio等[25]研究了卡鉑/多西他賽聯(lián)合應用于120例臨床AVPC的mCRPC患者，隨后采用依托泊苷/順鉑的挽救療法。給與4個周期的卡鉑/多西他賽后，47%的患者在第二個療程中達到了PSA反應，34%的患者達到了可測量疾病的客觀反應?？ㄣK/多西他賽組的中位無進展生存期為5.1個月，中位OS為16個月。毒性總體上是相當可控的，最常見的3級事件是感染(n=8)和發(fā)熱性中性粒細胞減少(n=3)。4級事件包括血栓形成(n=2)和血小板減少(n=1)。1例毒性相關(guān)死亡(依托泊苷/順鉑治療期間敗血癥)。

基于這些結(jié)果，Corn等[26]在存在AVPC(每組約55%)的mCRPC患者中進行了卡巴他賽vs卡巴他賽聯(lián)合卡鉑的Ⅱ期隨機試驗。以鉑為基礎的聯(lián)合治療顯示出了更好的療效，特別是在AVPC亞組。更具體地說，聯(lián)合組的中位無進展生存期比單純卡巴他賽組得到改善(7.3個月vs4.5個月)。對AVPC分子特征的影響進行后續(xù)分析，發(fā)現(xiàn)RB1、Tp53和/或PTEN的兩個或多個改變。

2.1.2 依托泊苷+鉑類藥物 為了提高傳統(tǒng)順鉑/依托泊苷方案對前列腺癌的療效，Papandreou等[27]在一項Ⅱ期臨床試驗中研究了順鉑/依托泊苷和阿霉素聯(lián)合治療38例NEPC患者。結(jié)果顯示，三聯(lián)用藥的獲益-風險比被認為是不利的，因此不建議臨床應用中在順鉑/依托泊苷的基礎上增加阿霉素。

卡鉑被認為是一種可接受的順鉑替代品，在mCRPC中作為單藥具有中等活性。在mCRPC患者的Ⅱ期試驗中，其被證實可與依托泊苷聯(lián)合作為多西他賽后的二線治療，且該組合的耐受性相當好[28]。但是，卡鉑/依托泊苷用血清CgA和/或NSE升高的CRPC患者[29]，結(jié)果顯示客觀緩解率為9%，4名患者(7%)出現(xiàn)發(fā)熱性中性粒細胞減少癥，1名患者毒性相關(guān)死亡。因此這種組合的收益風險比并不理想。值得注意的是，這兩項研究當中的卡鉑/依托泊苷使用劑量和應用方式各不相同，這些不同可能造成了二者研究結(jié)果的差異。

2.2 靶向治療

隨著精確醫(yī)學的興起，胚系和體細胞檢測常被強烈推薦用于高風險的局部晚期和轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者。盡管與NEPC有關(guān)的通路研究很多，但是已證實存在與治療相關(guān)的選擇卻十分有限。由于相關(guān)的預后和治療影響，檢測DNA損傷修復(DNA damagerepair,DDR)基因缺陷包括同源重組修復(homologous recombination repair,HRR)基因突變和錯配修復(mismatch repair,MMR)基因突變以及由此產(chǎn)生的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)應當包含在內(nèi)。陽性結(jié)果可用于指導治療決策，且這些結(jié)果可能與總體預后較差、替代治療選擇有限的NEPC患者特別相關(guān)。

2.2.1 免疫治療 導致表型MSI和/或MMR缺陷的MMR基因突變包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的體細胞生長系改變，并可能與Lynch綜合征有關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，3%～5%的前列腺癌患者存在MSI高/中或MMR不足的改變，<1%有Lynch綜合征。了解這些分子改變的存在至關(guān)重要，因為它們可能是免疫檢查點抑制劑如帕博利珠單抗(pembrolizumab)的靶點。帕博利珠單抗是一種抗程序化細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)抗體，該抗體于2017年被批準作為MSI高/MMR缺陷晚期實體腫瘤的二線療法或后續(xù)一線治療方法。2020年，美國FDA批準帕博利珠單抗可用于治療高腫瘤突變負荷的腫瘤。目前，有關(guān)帕博利珠單抗在治療晚期/轉(zhuǎn)移性NEPC的Ⅱ期臨床試驗正在開展。

在AVPC患者中，MSI高/MMR缺陷腫瘤的確切發(fā)病率以及隨后帕博利珠單抗適應證在NEPC中的臨床相關(guān)性還有待了解。在NEPC患者中，盡管Aggarwal等[30]報道MMR基因MLH1、MSH2、MLH3和MSH6的體細胞突變幾乎完全是相互排斥的(在8個患者中有7個)，但其他人報告了相反的結(jié)果。此外，文獻中也報道了一些NE組織學分化和MSI/MMR缺乏的個例患者[31]。值得注意的是，隨著時間的推移和基因組改變的出現(xiàn)，微衛(wèi)星狀態(tài)可能會改變?yōu)镸SI?？傊瑧膭顚VPC患者進行MSI/MMR缺陷檢測，并且應根據(jù)需要在這些患者中提供帕博利珠單抗作為二線或后線治療。

無論MSI/MMR狀態(tài)如何，一項隨機、雙盲Ⅲ期研究顯示，在標準化療(卡鉑/依托泊苷)基礎上加入抗PDL1抗體阿特珠單抗(atezolizumab)治療的小細胞肺癌患者可獲得良好的效益。這一結(jié)果表明患有其他神經(jīng)內(nèi)分泌分化的腫瘤患者(如NEPC)，也可能從檢查點抑制中獲益。為了回答這個問題，后續(xù)或許可以進行關(guān)于單獨使用檢查點抑制劑或聯(lián)合使用藥物治療NEPC患者的研究。

2.2.2 DNA損傷反應通路 轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者在DDR基因中表現(xiàn)出相對較高的種系突變率,這些突變包括BRCA2、ATM、CHEK2、BRCA1、RAD51D和PALB2的改變(按頻率降序排列)[30]。DDR基因的體細胞突變存在于23%的晚期mCRPC中，最常見的突變基因是BRCA2，占12.7%[32]。由于DDR尤其是BRCA2突變的前列腺腫瘤對聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制劑有反應，所以了解患者的生殖系和體細胞DDR狀態(tài)十分重要。目前兩種藥物(奧拉帕尼、魯卡帕利)已在mCRPC中批準使用。NEPC中DDR改變的普遍性是有爭議的，因為它們與Aggarwal等[30]的系列研究中的小細胞組織學幾乎完全相互排斥，而其他人報告了相互矛盾的結(jié)果。此外，無論DDR狀態(tài)如何，鉑類化療都被認為是小細胞前列腺癌的標準一線治療選擇?？傊?，在這一點上，DDR突變作為NEPC治療靶點的相關(guān)性仍然有待研究。

2.2.3 Notch信號通路 Notch信號通路中的DLL3蛋白過表達與NEPC的侵襲相關(guān)。Rovalpi-tuzumabtesirine(Rova-T)是一種針對DLL3的靶向藥物，現(xiàn)有Ⅱ期臨床試驗證實其在小細胞肺癌當中有著適度的臨床活性，但療效并不十分理想[33]。

2.3 靶向放射性核素療法

靶向放射性核素治療(targeted radionuclide therapy,TRNT)的特點是全身給與藥放射性藥物標記，從而靶向腫瘤細胞上表達的特定分子改變。帶有α或β的放射性核素標記的小分子可將輻射直接傳送到腫瘤部位。使用標有正電子或發(fā)射γ的放射性核素的相同藥物，通過預處理成像來可視化目標的全身生物分布，完成了治療診斷的概念?；谏L抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)的TRNT，亦稱為肽受體放射性核素療法(peptide receptor radionuclide therapy,PRRT)，是治療神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的重要治療方式。

現(xiàn)有的研究表明，腫瘤細胞表面的SSTR過表達，通過使用68GA-DOTA偶聯(lián)的奧曲肽(octreotide)激動劑(如68GA-DOTA-TATE)進行PET/CT成像得到最佳證明和定量，是確定特定患者PRRT適宜性的基本要求[34]。這些治療在胃腸胰等部位的神經(jīng)內(nèi)分泌分化腫瘤當中得到較好的驗證。國外兩項Ⅱ期臨床試驗已證實177Lu-PSMA-617在mCRPC中的應用價值，并表明其可能是mCRPC中卡巴他賽的潛在替代品[35]?？上У氖?，目前暫無有關(guān)TRNT在NEPC中的報道。但是，在法國正在開展一項有關(guān)TRNT在甲狀腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌治療價值的前瞻性臨床研究，并有希望得出一些對臨床診療有指導意義的結(jié)果。

3 展 望

NEPC是前列腺癌的一種侵襲性變異，是晚期前列腺癌耐藥的重要原因。鉑類化療藥物(如卡鉑聯(lián)合卡巴他賽)已得到NCCN指南的認可，但二線及以后的治療措施是目前面臨的主要臨床挑戰(zhàn)。雖然NEPC在最初診斷時可能存在某些分子特征，并且這些特征可能有助于未來譜系可塑性或AR獨立性的發(fā)展，但大多數(shù)NEPC的改變是后來發(fā)生的?；蚪M突變(如RB1、TP53丟失)促進了NEPC的可塑性，且NEPC具有明顯的表觀遺傳變化。針對NEPC中出現(xiàn)的關(guān)鍵基因/通路的試驗需要對入組患者進行仔細地選擇。轉(zhuǎn)移性活檢具有侵襲性，甚至在個別患者中也存在病理異質(zhì)性，因而將非侵入性生物標志物(液體活檢、分子成像)檢測NEPC的分子特征納入前列腺癌的臨床研究是必要的。