尿液外泌體lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值

錢(qián)文暉，陳全兵，朱洪儒，陳 鵬，姜亞志，魏 勇,2

(1.南京市高淳人民醫(yī)院泌尿外科，南京 211300；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，南京 210029)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，以50歲以上中老年人多見(jiàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，膀胱癌的發(fā)病率在全身惡性腫瘤中約占3%左右，其中約70%為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～80%[1]。手術(shù)切除治療是臨床上治療非浸潤(rùn)性膀胱癌的主要治療方法，但術(shù)后患者復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，早期非浸潤(rùn)性膀胱癌患者的5年生存率超過(guò)95%，若出現(xiàn)肌層浸潤(rùn)患者的5年生存率明顯降低[2]。但由于早期非浸潤(rùn)性膀胱癌患者的臨床癥狀不明顯，而膀胱鏡檢查對(duì)患者造成的損傷較大，因此，尋找一種安全、簡(jiǎn)便、可靠的生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)協(xié)助臨床診斷、評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后具有重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，外泌體檢測(cè)逐漸受到醫(yī)學(xué)研究者們的關(guān)注。外泌體是一種存在于血液、尿液等多種體液中的一種脂質(zhì)雙層囊泡，能夠運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)等物質(zhì)從而介導(dǎo)細(xì)胞通信[3]。有學(xué)者證實(shí)腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體能夠促使腫瘤微環(huán)境的形成，促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non coding RNA,lncRNA)是一種不具有蛋白編碼能力的非編碼RNA，其能夠通過(guò)多種不同的方式來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)與蛋白的合成。有研究認(rèn)為，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[5]。據(jù)報(bào)道，外泌體中的RNA較體液總RNA穩(wěn)定性更高[6]。本組研究中對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌患者及健康受檢者中尿液外泌體長(zhǎng)鏈非編碼RNA前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(Long non coding RNA prostate cancer related transcript 1,lncRNA PCAT-1)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2015年1月—2016年3月在南京市高淳人民醫(yī)院進(jìn)行治療的非浸潤(rùn)性膀胱癌患者50例作為非浸潤(rùn)性膀胱癌組。入組標(biāo)準(zhǔn):(1) 所有患者均確診為膀胱癌且經(jīng)病理學(xué)檢查確診患者為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌；(2) 患者及其家屬同意進(jìn)行此試驗(yàn)；(3) 為首次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1) 經(jīng)手術(shù)或放化療治療；(2) 存在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。?3) 不能配合研究；(4) 參與研究前1周進(jìn)行過(guò)膀胱鏡檢查。選取同時(shí)期在本院進(jìn)行健康體檢的健康受檢者50例作為對(duì)照組。參與本研究的研究對(duì)象及其家屬均知情同意并簽訂知情同意書(shū)，同時(shí)本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)，均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為(同)2022-001-01。

1.2 主要儀器及試劑

透射電子顯微鏡(北京儀信網(wǎng)通科技有限公司，型號(hào):JEM-ARM300F2)；-80 ℃超低溫冰箱(北京愛(ài)立斯生物科技有限公司，型號(hào):DW-86L626)；電子天平(上海精密儀器儀表有限公司，型號(hào):JA2603)；低溫高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào):TG20KR-D)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定儀(深圳市三莉科技有限公司，型號(hào):TL988-IV)；異丙醇(武漢翔合億化工科技有限公司)；無(wú)水乙醇(東莞市萬(wàn)信精細(xì)化工有限公司)。

1.3 觀察指標(biāo)

所有研究對(duì)象均留取晨起中段尿150 mL，于留取后2 h內(nèi)進(jìn)行處理。收集非浸潤(rùn)性膀胱癌患者的臨床病理參數(shù)，包括性別、年齡、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)(高級(jí)別、低級(jí)別)及病理分期(Ta、T1)。取非浸潤(rùn)性膀胱癌患者與健康受檢者尿液并提取外泌體，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定非浸潤(rùn)性膀胱癌組與對(duì)照組尿液外泌體中l(wèi)ncRNA PCAT-1表達(dá)情況。取待檢尿液，離心，取上清液，加入Slurry B 1 200 μL，混勻，靜置，離心，去除上清液，加入Lysis Buffer A 200 μL充分裂解外泌體，加入適量異丙醇充分混勻，在室溫下靜置離心，去除上清液，加入Wash Solution A 300 μL，1 500×g,離心20 min，去除上清液，重復(fù)步驟3次；使用分光光度計(jì)測(cè)定提取物RNA水平；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，配制PCR反應(yīng)體系，待反應(yīng)完成后上機(jī)檢測(cè)。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算lncRNA PCAT-1表達(dá)水平。分析尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

隨訪:自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行緊密隨訪，隨訪形式包括門(mén)診隨訪、電話隨訪等。隨訪截止時(shí)間為2021年3月，每次門(mén)診隨訪均需行血清腫瘤標(biāo)志物、MRI檢查，如果懷疑腫瘤復(fù)發(fā)則可能需進(jìn)一步行病理檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。本組研究中計(jì)量資料兩兩比較釆用方差齊性檢驗(yàn)。尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷價(jià)值采用ROC曲線分析。建立ROC曲線，分析尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷價(jià)值。建立ROC曲線，分析尿液外泌體lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的價(jià)值。影響非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的相關(guān)因素采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與非浸潤(rùn)性膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存曲線分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 非浸潤(rùn)性膀胱癌患者臨床病理參數(shù)對(duì)比

50例非浸潤(rùn)性膀胱癌患者中以男性多見(jiàn)，病理分級(jí)及病理分期分別以高級(jí)別及T1期占比較高，而患者大多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，見(jiàn)表1。

表1 非浸潤(rùn)性膀胱癌患者臨床病理參數(shù)對(duì)比Tab.1 Clinicopathological parameters of 50 patients with non-invasive bladder cancer

2.2 兩組尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)情況

非浸潤(rùn)性膀胱癌組患者尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(5.76±2.23vs1.17±0.56,P<0.01),見(jiàn)圖1。

圖1 兩組尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)情況Fig.1 Expression of lncRNA PCAT-1 in urine exosomes of the two groups

2.3 尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與病理分期具有明顯相關(guān)性(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.2 Correlation of the expression of lncRNA PCAT-1 in urine exosomes and clinicopathological parameters of patients

2.4 尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷價(jià)值

建立ROC曲線，尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)的曲線下面積分別為0.833、0.620，敏感度分別為81.26%、24.52%，尿液外泌體lncRNA PCAT-1診斷非浸潤(rùn)性膀胱癌的曲線下面積明顯高于尿液脫落細(xì)胞學(xué)，見(jiàn)表3、圖2。

表3 尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷價(jià)值Tab.3 Diagnostic value of urinary exosomal lncRNA PCAT-1 and urine exfoliative cytology in non-invasive bladder cancer

圖2 尿液外泌體lncRNA PCAT-1與尿液脫落細(xì)胞學(xué)對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷價(jià)值Fig.2 ROC curve for urinary exosomal lncRNA PCAT-1 and urine exfoliative cytology in diagnosis of non-invasive bladder cancer

2.5 影響非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的相關(guān)因素

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)因素回歸模型分析，病理分期及l(fā)ncRNA PCAT-1均為影響非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4、5。

表4 影響非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)單因素分析Tab.4 Univariate analysis of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

表5 影響非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

2.6 尿液外泌體lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值

建立ROC曲線，lncRNA PCAT-1與病理分期的曲線下面積分別為0.763、0.634，lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值更高，見(jiàn)表6、圖3。

表6 尿液外泌體lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值Tab.6 Value of urinary exosomal lncRNA PCAT-1 in evaluating recurrence of non-invasive bladder cancer

圖3 尿液外泌體lncRNA PCAT-1評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的價(jià)值Fig.3 Urinary exosomal lncRNA PCAT-1 in assessment of recurrence in patients with non-invasive bladder cancer

2.7 尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與非浸潤(rùn)性膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

以尿液外泌體lncRNA PCAT-1相對(duì)表達(dá)量均值作為截?cái)嘀?，?0例患者分為高表達(dá)組(23例，>5.14±1.04)與低表達(dá)組(27例，≤5.14±1.04)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，lncRNA PCAT-1低表達(dá)量組生存期明顯高于lncRNA PCAT-1高表達(dá)組，見(jiàn)圖4。

圖4 尿液外泌體lncRNA PCAT-1表達(dá)與非浸潤(rùn)性膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Relationship between urinary exosomal lncRNA PCAT-1 expression and prognosis of non-invasive bladder cancer

3 討 論

膀胱癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)其是否侵入肌層分為非浸潤(rùn)性膀胱癌及浸潤(rùn)性膀胱癌，其中，非浸潤(rùn)性膀胱癌占膀胱癌的80%以上，具有多為點(diǎn)同時(shí)發(fā)生及復(fù)發(fā)率較高的特點(diǎn)。隨著醫(yī)療科技的進(jìn)步，人口老齡化趨勢(shì)的發(fā)展，非浸潤(rùn)性膀胱癌的發(fā)病率正逐年升高。目前，臨床上主要采用膀胱鏡檢查及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，但膀胱鏡檢查費(fèi)用較高，對(duì)患者造成的損傷較大；而尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)特異度較低[7-8]。因此，尋找準(zhǔn)確性及敏感度較高的的診斷方法對(duì)預(yù)防患者復(fù)發(fā)，提高患者治療效果，改善患者預(yù)后意義重大。

外泌體是一種廣泛存在于人體血液、尿液、唾液等多種體液中的雙層囊泡小體，其形成與細(xì)胞關(guān)系密切[9]。細(xì)胞作為人體的基本結(jié)構(gòu)，在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等，從而為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了有利條件[10]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為一種細(xì)胞外泌物，能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞間進(jìn)行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及信息的傳遞，外泌體可以作為一種重要的腫瘤標(biāo)志物[11]。近年來(lái)，對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌尿液外泌體內(nèi)容物的研究發(fā)現(xiàn)，非浸潤(rùn)性膀胱癌尿液外泌體中包裹的生物物質(zhì)，尤其是lncRNAs對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌的診斷及預(yù)后評(píng)估具有重要意義[12]。lncRNAs是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，大多數(shù)不具有蛋白質(zhì)編碼功能，其對(duì)細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤的發(fā)展起著重要作用[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNAs在區(qū)分腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞，反映腫瘤細(xì)胞的病理變化及病情程度方面扮演著重要角色。PCAT-1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，首先在前列腺癌中被發(fā)現(xiàn)。Guo等[15]的研究顯示，PCAT-1在非浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非浸潤(rùn)性膀胱癌患者尿液外泌體中l(wèi)ncRNA PCAT-1的表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)量與非浸潤(rùn)性膀胱癌病理分期明顯相關(guān)；此外，尿液外泌體lncRNA PCAT-1診斷非浸潤(rùn)性膀胱癌的曲線下面積明顯高于尿液脫落細(xì)胞學(xué)，這表明尿液外泌體lncRNA PCAT-1可以作為早期診斷非浸潤(rùn)性膀胱癌的重要指標(biāo)，其能夠直接反映非浸潤(rùn)性膀胱癌的病理學(xué)狀態(tài)。在本研究中，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型及Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，尿液外泌體lncRNA-PCAT-1是影響非浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且尿液外泌體lncRNA PCAT-1高表達(dá)與非浸潤(rùn)性膀胱癌患者的高復(fù)發(fā)率明顯相關(guān)。尿液外泌體lncRNA PCAT-1可以作為診斷非浸潤(rùn)性膀胱癌患者復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。

綜上所述，外泌體lncRNA PCAT-1在非浸潤(rùn)性膀胱癌患者尿液中的表達(dá)水平較健康受檢者明顯升高，且其表達(dá)水平與患者病理分期明顯相關(guān)。尿液外泌體lncRNA PCAT-1對(duì)評(píng)估非浸潤(rùn)性膀胱癌患者的復(fù)發(fā)具有重要作用。