陰道微生態(tài)與高危型HPV陽性子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的相關(guān)性及臨床預(yù)測模型建立

郭 靈，孫瀟瀟，2，成佳景,3

(1.南京醫(yī)科大學，南京 211166；2.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072；3.同濟大學附屬上海市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200081)

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，目前已明確了高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)持續(xù)感染是引起宮頸癌及子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion,SIL)的病因，其中，HPV16及HPV18具有強致癌性[1]。但HPV陽性的患者中，約90%可通過自身免疫自然清除，僅少部分人會發(fā)生持續(xù)感染，進而發(fā)展為可檢出的SIL甚至子宮頸癌[2-3]，這一過程通常需要數(shù)年[4]，提示宮頸病變的發(fā)展除了高危型HPV感染外還有其他協(xié)同因素。隨著微生態(tài)組學的發(fā)展，陰道微生態(tài)作為女性特有的微生態(tài)系統(tǒng)也開始受到廣泛關(guān)注。健康的陰道微生態(tài)有參與人體物質(zhì)代謝、形成黏膜屏障、調(diào)控免疫等重要功能，而失衡的陰道微生態(tài)如陰道菌群異常、陰道pH值異常、過氧化氫缺乏等，可導致陰道對病原體的抵御能力下降，易繼發(fā)生殖道感染性疾病[5-6]。許多研究認為，SIL的發(fā)生發(fā)展與子宮頸所處局部陰道微生態(tài)環(huán)境改變有關(guān)[7-8]。SIL是高危型HPV持續(xù)感染進展到子宮頸癌的中間階段，如在此階段使疾病得到逆轉(zhuǎn)，將大大改善SIL患者的結(jié)局。本研究分析某些類型的陰道微生態(tài)變化，探究其與高危型HPV感染、不同級別SIL之間的關(guān)聯(lián)，探討這些陰道微生態(tài)檢測指標是否能作為SIL發(fā)生發(fā)展的生物標志以區(qū)分可能消退和具有癌變潛能的病變，并進一步研究改善陰道微生態(tài)環(huán)境等對SIL的診療和預(yù)防的臨床意義，從而幫助更有效預(yù)防、治療宮頸疾病及擬定風險評估方案。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2019年4月—2021年4月于同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦科就診的高危型HPV(HPV16、18等)陽性且子宮頸液基薄層細胞學檢測(thin prep cytologic test，TCT)結(jié)果≤高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)的患者，對HPV16/18型陽性患者及HPV other型陽性且TCT≥意義不明的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US)的患者做陰道微生態(tài)檢測后行陰道鏡檢查、宮頸組織活檢，或根據(jù)陰道鏡活檢結(jié)果進一步行LEEP術(shù)以明確宮頸病理結(jié)果。排除急性子宮頸炎、盆腔炎患者；1周內(nèi)口服抗生素者；3 d內(nèi)有性生活/陰道沖洗者；處于妊娠期、哺乳期者；免疫抑制性疾病或使用糖皮質(zhì)激素者；子宮切除史、宮頸癌個人史或合并其他惡性腫瘤史者。最終收集患者757例，年齡18～68歲，根據(jù)宮頸組織的病理結(jié)果將患者分為子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組(SIL組)347例和宮頸組織病理良性改變組(對照組)410例。

1.2 樣本采集方法

受檢者安躺于婦科檢查臺上，取膀胱截石位，將無菌陰道窺器以無菌石蠟棉球潤滑后置入受檢者陰道內(nèi)，充分露出宮頸部，用陰道微生態(tài)檢測專用無菌棉拭子采集陰道分泌物，自陰道上1/3側(cè)壁處旋轉(zhuǎn)棉拭子10～20 s，以能清晰看到分泌物附著為準，將其放入專用無菌檢測試管中，常溫干燥保存，并在取材后30 min內(nèi)送至檢驗科由專業(yè)檢驗醫(yī)師進行檢測。之后，將HPV聯(lián)合TCT檢測的標本采樣器毛刷的刷面插入子宮頸管內(nèi)1 cm左右，順時針旋轉(zhuǎn)標本采樣毛刷5圈，待刷取足量子宮頸上皮細胞后，將標本采樣器刷頭放入裝有液基細胞保存試劑的專用無菌采樣瓶中。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 HPV、子宮頸液基細胞學檢測及判斷標準 使用羅氏HPV檢測平臺進行樣本檢測并導出結(jié)果，結(jié)果分為HPV16型、18型、other型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)陽性。采用液基分離并濾掉標本中的黏液、血液、炎癥組織，全自動Tripath染色、制片。由專業(yè)病理醫(yī)師根據(jù)TBS(The Bethesda system)系統(tǒng)進行細胞學判讀。

1.3.2 子宮頸組織病理學診斷方法及診斷標準 依據(jù)陰道鏡操作規(guī)范采用光電一體陰道鏡對HPV16/18型陽性或HPV other型陽性且TCT≥ASC-US的患者進行宮頸組織活檢。必要時，按照LEEP刀標準操作流程對患者進行LEEP術(shù)。宮頸組織標本送病理科，由專業(yè)病理醫(yī)師閱片，根據(jù)組織細胞異型性的程度和范圍參考WHO的診斷標準及分類進行組織學診斷。

1.3.3 陰道微生態(tài)檢測 本研究中的陰道微生態(tài)檢測為臨床檢測方法，由專業(yè)檢驗科醫(yī)師按照陰道微生態(tài)檢測系統(tǒng)操作規(guī)程進行。

(1) 形態(tài)學檢測：陰道分泌物涂片，干燥、固定后行革蘭染色，在10倍目鏡×100倍油鏡下觀察陰道菌群密集度、菌群多樣性、優(yōu)勢菌(革蘭陽性桿菌大多為乳桿菌，革蘭陽性球菌多為鏈球菌，以及革蘭陰性短桿菌如加德納菌，革蘭陰性短桿菌如普雷沃菌、動彎桿菌)，病原微生物(真菌、滴蟲)，Nugent評分。

(2) 功能學檢測：使用山東仕達思生物產(chǎn)業(yè)有限公司的陰道微生態(tài)檢測儀Unit-500對檢測陰道分泌物pH值，H2O2濃度，白細胞酯酶、唾液酸苷酶活性。

正常陰道微生態(tài)的定義為：陰道菌群的密集度為Ⅱ～Ⅲ級、多樣性為Ⅱ～Ⅲ級、優(yōu)勢菌為乳桿菌、未見病原微生物、陰道pH值為3.8～4.5、乳桿菌功能正常(H2O2濃度正常)、唾液酸苷酶、白細胞酯酶等陰性。若其中任何1項發(fā)生異常，即診斷為陰道微生態(tài)失調(diào)[9]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用IBM SPSS 26.0和StataSE 15.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)及作圖。計數(shù)資料用頻率百分比(%)表示，組間比較用χ2檢驗。進行多因素Logistic回歸分析建立診斷臨床預(yù)測模型，采用向后LR法篩選預(yù)測因子并計算其比值比(OR)與95%CI，并制作列線圖(nomogram)。通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)、ho-smer-lemeshow(HL)和臨床決策曲線分析(decision curve analysis,DCA)分別評估模型的區(qū)分度、校準度和臨床實用度價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 相關(guān)臨床因素及陰道微生態(tài)檢測結(jié)果比較

本研究共納入患者757例，其中對照組410例，SIL組347例。兩組相關(guān)臨床因素比較顯示，患者不同孕次及高危型HPV陽性情況差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而年齡、產(chǎn)次差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組陰道微生態(tài)檢測結(jié)果比較顯示，菌群多樣性、H2O2、細菌性陰道病(bacterial vaginitis,BV)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而菌群密集度、優(yōu)勢菌、pH值、唾液酸苷酶、白細胞酯酶、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)、滴蟲陰道炎(trichomonas vaginitis,TV)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者相關(guān)臨床因素及陰道微生態(tài)檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison of clinical factors and vaginal microecology test results of patients [n(%)]

2.2 危險因素的篩選及多因素Logistic回歸臨床預(yù)測模型的建立

將相關(guān)臨床因素及陰道微生態(tài)檢測結(jié)果納入多因素Logistic回歸分析，采用向后LR法篩選預(yù)測因子，結(jié)果提示與HPV other型陽性相比，HPV16/18單一型陽性、HPV16/18+other混合型陽性均是SIL發(fā)生的危險因素(P<0.05)，此外，菌群多樣性增加、BV感染均是SIL發(fā)生的危險因素，而正常H2O2濃度是SIL發(fā)生的保護因素，見表2。上述篩選出的預(yù)測因子對SIL預(yù)測的相對重要性由Wald卡方值減去預(yù)測因子自由度(χ2-df)反映[10]，可見HPV分型是最主要的危險因素，其次是BV感染，見圖1。根據(jù)該模型的預(yù)測因子構(gòu)建列線圖，見圖2。

圖2 基于4個預(yù)測因子建立的臨床預(yù)測模型列線圖Fig.2 Nomogram of clinical prediction model based on four predictors

表2 多因素Logistic回歸分析結(jié)果Tab.2 Results of multivariate Logistic regression analysis

圖1 預(yù)測因子在模型中的相對重要性Fig.1 Related importance of the predictors in the model

2.3 臨床預(yù)測模型的驗證

2.3.1 模型的預(yù)測性能評估 經(jīng)過ROC分析，預(yù)測概率曲線下面積 (area under the curve,AUC)為0.677(95%CI：0.632～0.723)，表明該診斷臨床預(yù)測模型對HPV陽性的子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者和宮頸組織病理良性改變患者之間的區(qū)分能力較好，見圖3。HL檢驗P>0.05，表明此模型的擬合優(yōu)度較高，校準曲線均為斜率接近于1的直線，表明SIL實際發(fā)生率和預(yù)測概率之間有很好的相關(guān)性，見圖4。

圖3 臨床預(yù)測模型的ROC曲線及AUCFig.3 ROC curve and AUC of clinical prediction model

圖4 臨床預(yù)測模型的校準度曲線Fig.4 Calibration curve of clinical prediction model

2.3.2 模型的臨床決策曲線分析 應(yīng)用臨床決策曲線分析評價該模型的臨床實用度，當使用該模型的預(yù)測率為0.65以下時，采取治療措施有凈獲益，見圖5。

圖5 臨床預(yù)測模型的決策曲線分析Fig.5 Decision curve analysis of clinical prediction model

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生率、死亡率都居于婦科惡性腫瘤的第4位[11]。大量研究表明，SIL及宮頸癌與高危型HPV持續(xù)感染、多個性伴侶、多產(chǎn)等因素密切相關(guān)[12]，可見惡性腫瘤的發(fā)生是一個多步驟、多因素參與調(diào)控的復(fù)雜生物學過程。晚期宮頸癌主要依靠手術(shù)和/或放化療等治療方法，預(yù)后較差[12-13]。而SIL是HPV持續(xù)感染進展到子宮頸癌的中間階段，其自然病程在很大程度上是不可預(yù)測的，目前的組織病理學檢查無法區(qū)分哪些病變可以消退，哪些可能繼續(xù)進展甚至發(fā)生癌變。在本研究中，SIL組患者與對照組相比，孕次較多、HPV16型及HPV18型陽性率高，差異具有統(tǒng)計學意義。舒慧敏等[14]發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)宮頸病變患者的HPV陽性分型多為HPV16、18、33、52、31型，檢出率總和高達90%，且HPV16、18與子宮頸病變嚴重程度顯著相關(guān)，這一結(jié)果與本研究結(jié)果相似，提示有性生活的女性定期行HPV篩查，并對HPV16型及HPV18型感染的患者更進一步行宮頸檢查對早期發(fā)現(xiàn)宮頸病變的重要性。大部分發(fā)生HPV感染的女性可通過自身免疫自然清除，僅少數(shù)患者會發(fā)生HPV持續(xù)感染，并進一步發(fā)生宮頸病變[15]，導致這些現(xiàn)象的原因也是目前研究的熱點。有研究認為陰道微生態(tài)失衡通過直接和間接的機制，導致包括炎癥狀態(tài)、陰道黏膜上皮屏障破壞、代謝失調(diào)等，增加HPV持續(xù)感染風險，參與子宮頸病變的發(fā)生發(fā)展[16-17]，但對于此類研究結(jié)果目前尚存爭議，其具體機制也有待于進一步研究。

正常陰道pH值為3.5～4.5，呈弱酸狀態(tài)，陰道微生態(tài)以低度菌群多樣性為特點，乳酸桿菌為其中的優(yōu)勢菌群。陰道乳酸桿菌通過競爭性黏附在陰道黏膜上形成抵抗致病性感染的屏障，激活補體系統(tǒng)和局部免疫反應(yīng)，提供廣譜保護，H2O2是乳酸桿菌分解的代謝產(chǎn)物，代表陰道內(nèi)乳酸桿菌是否發(fā)揮正常功能抑制其他細菌的增長，其在陰道內(nèi)的含量反映乳酸桿菌功能，具有控制病原微生物生長及抗病毒的作用[18]；而當陰道內(nèi)乳酸桿菌減少，非乳酸桿菌多樣性增加并占優(yōu)勢時，陰道pH值升高，H2O2含量降低，這種陰道微生態(tài)環(huán)境往往與陰道疾病狀態(tài)相關(guān)[19-20]。Clarke等[21]發(fā)現(xiàn)陰道pH值升高會導致HPV感染風險增加。Brotman等[22]及Mitra等[23]的團隊都證明了宮頸病變的持續(xù)存在或升高與陰道菌群多樣性增加及乳酸桿菌的減少有關(guān)，對以乳酸桿菌為陰道優(yōu)勢菌群的患者來說，其宮頸病變更易消退。近年來，細菌預(yù)成酶譜(唾液酸苷酶、白細胞酯酶等)檢測技術(shù)也已在陰道微生態(tài)評價體系中得到廣泛應(yīng)用。白細胞酯酶是白細胞破裂時釋放的炎性反應(yīng)的指標，標志陰道黏膜受損或炎性反應(yīng)，通常認為陰道黏膜受損的情況下病毒更易侵襲宿主細胞[24]，Li等[25]發(fā)現(xiàn)白細胞酯酶異?？稍黾親PV16型陽性患者發(fā)生SIL的風險。目前已有很多研究證實了BV與HPV感染之間具有相關(guān)性，但BV與SIL之間是否存在相關(guān)性仍不明確。Usyk等[26]認為陰道內(nèi)存在加德納菌是持續(xù)性高危型HPV感染及宮頸病變進展的相關(guān)風險因素。Di Paola等[27]的研究顯示陰道微生態(tài)菌群中含有與BV相關(guān)的厭氧菌群的患者，其高危HPV感染的持續(xù)時間較長，發(fā)生宮頸病變的風險更高。一些BV相關(guān)致病菌可產(chǎn)生蛋白毒素，誘導陰道上皮細胞溶解并對上皮細胞的免疫功能產(chǎn)生影響[28]，BV相關(guān)菌群通過激活免疫信號通路，產(chǎn)生細胞溶解素，可破壞陰道黏膜、降解陰道保護性黏蛋白[29-30]，此外，BV相關(guān)的厭氧菌可釋放具有致癌性的胺類化學物質(zhì)，而亞硝胺長期在局部積蓄可使子宮頸上皮細胞發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化[31]。

考慮到宮頸癌患者的陰道微生態(tài)檢測結(jié)果可能受到惡性腫瘤的壞死組織及滲出物繼發(fā)的陰道病原菌感染影響[32]，且此前已有較多針對陰道微生態(tài)與宮頸癌的相關(guān)研究，但對陰道微生態(tài)與SIL關(guān)系的文獻報道較少[33]，因此本研究著重于陰道微生態(tài)與SIL的相關(guān)性。本研究通過組間比較發(fā)現(xiàn)，高危型HPV陽性SIL組患者的陰道微生態(tài)與對照組患者相比，菌群多樣性增加，BV感染率升高，陰道內(nèi)H2O2減少提示了宮頸病變患者陰道乳酸桿菌功能可能受到影響，這些觀察指標的差異均有統(tǒng)計學意義，但兩組之間的pH值、優(yōu)勢菌未見明顯差異，后續(xù)可能需要進一步擴大樣本量探究其是否可作為宮頸病變的預(yù)警指標。本結(jié)論與既往研究發(fā)現(xiàn)基本相符，提示在以上因素的影響下，各種病原體及HPV病毒更易黏附、侵襲發(fā)育不良的轉(zhuǎn)化區(qū)鱗狀上皮使宮頸對HPV的易感性增加，進而發(fā)生病變。

本研究通過Logistic回歸分析相關(guān)臨床因素及陰道微生態(tài)檢測指標，使用向后LR法獲得HPV陽性情況、菌群多樣性、BV、H2O2作為預(yù)測因子，且這些指標在既往研究中作為危險因素是被廣泛認可的。并以此制作列線圖實現(xiàn)對疾病發(fā)生風險的圖形展示及個體化預(yù)測，患者可根據(jù)列線圖對每個預(yù)測因子亞組的賦值計算得到的總分計算結(jié)局事件的發(fā)生概率。建立模型后，通過ROC曲線、校準曲線、臨床決策曲線分析三個層面對模型進行了驗證，結(jié)果顯示該模型的AUC為0.677(>0.7)，表明該模型對于疾病發(fā)生率的判別能力較強；校準曲線圖也顯示預(yù)測風險與實際風險具有較好的一致性；決策曲線分析可以評估基于該模型的決策是否能提高患者的預(yù)后，該方法建立在閾值概率的基礎(chǔ)上，以觀察臨床適用性并平衡凈效益。需要指出的是，該模型中未包括的因素并不表明其與SIL無關(guān)。本研究也存在一定的局限性：首先本研究為回顧性分析，存在一定程度的選擇偏差；其次為單中心研究，雖然內(nèi)部驗證試驗表明本研究所建立的預(yù)測模型是可靠的，但仍有待于進一步的外部驗證。

綜上所述，本研究認為，高危型HPV感染，尤其是16、18型HPV感染與SIL密切相關(guān)，而從HPV感染到發(fā)生SIL，該過程也受包括多孕、陰道微生態(tài)失衡如陰道菌群多樣性增加、乳酸桿菌功能下降、合并BV感染等多種因素的影響。本研究采用Logistic回歸分析篩選SIL發(fā)生的預(yù)測因子，建立診斷臨床預(yù)測模型并從多角度對其進行驗證。該模型有利于臨床對高危型HPV患者的客觀性評估及觀察隨訪，并提示對于此類患者，改善陰道微環(huán)境，應(yīng)用陰道乳酸桿菌制劑等用以補充陰道內(nèi)功能下降的乳酸桿菌；合并BV感染者，積極治療BV等方式，或可成為宮頸病變防治的輔助策略。