一例商品肉鴨脾臟壞死、病毒性肝炎與傳染性漿膜炎三重感染的診斷

徐安衡 鄭義 李超 郁春

肉鴨養(yǎng)殖生產(chǎn)是我國的特色畜牧產(chǎn)業(yè)，當(dāng)前年出欄量已達(dá)到40億只左右，在鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了重要作用。但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各類疫病的發(fā)生也日益嚴(yán)重，為肉鴨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了較大影響。其中，脾臟壞死、病毒性肝炎和傳染性漿膜炎是肉鴨養(yǎng)殖中較為常見的疾病，一旦發(fā)病，常會給養(yǎng)殖場造成較大經(jīng)濟(jì)損失。如果發(fā)生混合感染，損失往往會更加嚴(yán)重。今年2月份，華東地區(qū)某商品肉鴨養(yǎng)殖場從7日齡左右即出現(xiàn)脾臟壞死病例，25日齡后病鴨又出現(xiàn)了肝臟出血、心包炎、氣囊炎等癥狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確診為呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和鴨疫里默氏桿菌三重混合感染，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 病料處理與細(xì)菌分離

發(fā)病鴨來自華東地區(qū)某肉鴨養(yǎng)殖場，該場前后送來兩次病料，第一次在鴨群7日齡左右，死淘率上升至2%～3%，死亡鴨剖檢可見明顯脾臟出血，肝臟點(diǎn)狀壞死;第二次在鴨群25日齡左右，死亡率每天達(dá)到1%～2%，剖檢可見氣囊炎、心包炎和肝周炎，脾臟呈大理石樣，腎臟出血，肝臟腫脹、淤血。分別采集不同日齡病死鴨肝臟、脾臟、腎臟等作為病料，其中從肝臟劃線接種血清平板，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)菌進(jìn)行常見病原菌PCR鑒定;另外將采集的以上病料混合后以1：5比例加入生理鹽水，勻漿形成組織混懸液，置-80 ℃凍融3次，4 ℃離心15 min，取上清進(jìn)行病原PCR檢測。

1.2 PCR檢測

1.2.1 核酸提取 分離細(xì)菌及處理后的病料上清按照試劑盒（Axygen）說明書提取核酸，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR方法 利用本中心實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的針對禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨肝炎病毒1型和3型（DHV-1，DHV-3）、鴨呼腸孤病毒（DReoV）、鴨細(xì)小病毒（DPV）、鴨星狀病毒（DastV）和鴨圓環(huán)病毒（DCV）等常見病毒的引物，以及鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌等常見細(xì)菌的引物，通過PCR或RT-PCR方法進(jìn)行病毒核酸檢測。

PCR反應(yīng)體系25 μL：2 ×Taq PCR StarMix 12.5 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2 μL，超純水9.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min;94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

RT-PCR反應(yīng)體系20 μL：2 × One Step Mix 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，超純水5 μL，RNA模板3 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃ 預(yù)變性2 min;94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病理解剖與病變觀察

7日齡病死雛鴨剖檢可見脾臟出血（圖1），有的肝臟表面分布有白色壞死點(diǎn)（圖2）;25日齡病死鴨剖檢可見明顯氣囊炎、心包炎和肝周炎，肝臟腫大、淤血（圖3），脾臟呈大理石樣病變（圖4），部分病例表現(xiàn)脾臟壞死、萎縮（圖5）。

2.2 細(xì)菌分離與染色鏡檢

細(xì)菌分離接種血清平板，經(jīng)5% CO2 37 ℃過夜培養(yǎng)后，可見有整齊、凸起、細(xì)小的白色菌落生長。取典型菌落，涂布載玻片，經(jīng)革蘭氏染色在100X顯微鏡下觀察，可見革蘭氏陰性、無芽孢、短桿狀形態(tài)細(xì)菌。

2.3 病原PCR檢測

病原核酸PCR檢測結(jié)果顯示，7日齡病料中鴨新型呼腸孤病毒檢測結(jié)果為陽性，擴(kuò)增片段大小為230 bp;25日齡病料中鴨新型呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒3型和鴨疫里默氏桿菌檢測結(jié)果均為陽性，擴(kuò)增片段大小分別為230、250、670 bp;分離細(xì)菌PCR檢測結(jié)果為鴨疫里默氏桿菌陽性，擴(kuò)增片段大小為670 bp。結(jié)果見圖6～8。

結(jié)合鴨群發(fā)病癥狀、剖檢病變及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，判斷該病例在7日齡前感染鴨新型呼腸孤病毒，在25日齡前又混合感染鴨肝炎病毒3型和鴨疫里默氏桿菌導(dǎo)致發(fā)病。

3 討論

近十年來隨著我國肉鴨養(yǎng)殖的快速發(fā)展，肉鴨養(yǎng)殖的數(shù)量和密度不斷增加，各類疫病的發(fā)生日益增多，發(fā)病情況也日趨復(fù)雜。由于新發(fā)病原的不斷出現(xiàn)、變異加快以及養(yǎng)殖模式相對落后等原因，導(dǎo)致不同病原的混合感染比較常見，成為造成生產(chǎn)損失的重要原因[1-4]。楊晶等[3]針對肉鴨7種病毒性病原進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)二重混合感染比例為32.3%，甚至超過單一感染比例28.3%，而三重感染和四重感染的比例分別為22%和5.4%，說明混合感染已經(jīng)成為鴨病發(fā)生的主流。

自2005年以來鴨新型呼腸孤病毒感染開始在我國福建、廣東等地出現(xiàn)[5]，主要造成3～25日齡雛鴨發(fā)生肝臟、脾臟的出血和壞死。該病毒水平傳播和垂直傳播能力均較強(qiáng)，致死率一般不高，但感染后能夠引起免疫抑制，非常容易引起其他病原的繼發(fā)感染[4， 6-9]。呼腸孤病毒致病性并不強(qiáng)，不過一旦與其他病原形成混合感染，往往發(fā)病率和死亡率會大幅上升。鴨病毒性肝炎是肉鴨生產(chǎn)中最常見的疫病之一，目前病原包括鴨肝炎病毒1型和3型兩種。該病對1周齡以內(nèi)的雛鴨致病性最強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%以上。由于肉鴨養(yǎng)殖中普遍在1日齡注射卵黃抗體用來預(yù)防本病，生產(chǎn)中已經(jīng)很少見到低日齡肉鴨發(fā)病，反而在20～30日齡之間發(fā)病更加常見，但發(fā)病率和死亡率大幅下降，一般在10%～20%左右。漿膜炎則是商品鴨養(yǎng)殖中最常見的細(xì)菌類疾病，病原為鴨疫里默氏桿菌。根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，該菌血清型至少有21種，國內(nèi)當(dāng)前流行的以1/2/6/7/10型為主，其中2/6/7型菌株致病性較強(qiáng)，鴨群感染后常造成重大損失。

鴨新型呼腸孤病毒由于損傷脾臟造成免疫抑制，感染后期常引起其他病原的繼發(fā)感染，最常見的是大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌類病原。本病例中，在7日齡左右發(fā)病時(shí)僅檢測到呼腸孤病毒，而25日齡后則同時(shí)檢測到呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒3型和鴨疫里默氏桿菌，推測是早期感染呼腸孤病毒，之后由于管理不當(dāng)又感染了鴨肝炎病毒和鴨疫里默氏桿菌，形成了三重感染導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重。對于這種情況而言，前期感染呼腸孤病毒后的飼養(yǎng)管理較為關(guān)鍵，應(yīng)密切關(guān)注鴨舍溫度、通風(fēng)和衛(wèi)生狀況，避免應(yīng)激因素造成其他疫病繼發(fā)。目前針對鴨病毒性肝炎已經(jīng)有商品化的卵黃抗體可供使用，發(fā)病后及時(shí)注射能起到較好的治療效果。傳染性漿膜炎常發(fā)于3周齡以后，而且一旦感染高致病力菌株，鴨群的死亡數(shù)量會迅速上升。由于“限抗”的原因，這個(gè)階段可供選用的藥物非常有限，在漿膜炎多發(fā)的地區(qū)，建議在5～7日齡免疫多價(jià)鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防。

由于肉鴨養(yǎng)殖飼養(yǎng)周期較短，用于疫苗免疫和藥物防控的時(shí)間較少，因此應(yīng)該把重點(diǎn)放在飼養(yǎng)管理方面，從鴨苗質(zhì)量、飼料品質(zhì)以及環(huán)境控制等各個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化提高，尤其是將現(xiàn)有的傳統(tǒng)簡陋的飼養(yǎng)方式升級為規(guī)?；?、智能化的生產(chǎn)模式，才能促進(jìn)肉鴨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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