兩種禽白血病診斷試劑的比對研究

姜同泉 朱紹輝 齊艷君 行鵬 王小偉 柏程昊 肖發(fā)沂

摘 要：本研究同時采用禽白血病ELISA檢測試劑盒和禽白血病乳膠微球檢測試紙條對已確診的278份禽白血病臨床樣品進行檢測，比較兩種診斷試劑檢測結(jié)果的差異。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，禽白血病ELISA檢測試劑盒敏感性為94.74%，特異性為99.61%，與確診結(jié)果間的Kappa值為0.94;禽白血病乳膠微球檢測試紙條敏感性為94.74%，特異性為100%，與確診結(jié)果間的Kappa值為0.97，兩種診斷試劑的重復(fù)性試驗結(jié)果均一致。試驗結(jié)果證明，禽白血病乳膠微球檢測試紙條和禽白血病ELISA檢測試劑盒都能滿足禽白血病的檢測需求;由于禽白血病乳膠微球檢測試紙條的經(jīng)濟、儲存、運輸和操作的便捷性，更適用于禽白血病凈化。

關(guān)鍵詞：禽白血病;ELISA檢測試劑盒;試紙條;比對

中圖分類號：S858.3 文獻標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2022）05-0005-05

禽白血?。ˋvian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一種免疫抑制性腫瘤病[1-3]，依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原性差異、病毒干擾試驗、宿主范圍和基因組的特性，禽白血病病毒已分類至10個亞群，命名為A～J亞群[4]。ALV的自然宿主主要是雞，以A、B、C、D、E和J亞群為主，感染率高，發(fā)病率低，但雞群感染 ALV 后會造成生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一[5]。

目前，該病還沒有切實可行的預(yù)防和治療方法，也沒有有效的疫苗，實施種禽ALV凈化是控制該病的最根本方法。疫病凈化離不開抗原抗體的檢測，因此，控制禽白血病的最佳方式是采用準確、快速、適用的檢測方法來檢測和篩選感染雞群，從而培育無ALV感染的種雞群。目前，禽白血病的檢測方法較多，臨床實踐中應(yīng)用比較多的主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫層析試紙條、PCR等，各種方法有其自身的優(yōu)點和劣勢[6-7]。ELISA法因其具有敏感高、簡便快捷、適用于大規(guī)模檢測的特點備受青睞。近年來，乳膠微球檢測試紙條也因其快速、便捷、成本低、較膠體金檢測試紙條靈敏度高等優(yōu)勢受到廣大診斷研究和研發(fā)單位的關(guān)注，其靈敏性、特異性和可重復(fù)性決定了其最終應(yīng)用前景。本研究旨在通過3種商品化禽白血病ELISA檢測試劑盒與禽白血病乳膠微球檢測試紙條在檢測ALV方面的靈敏度和特異性[8-9]，比較兩種診斷試劑檢測結(jié)果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

3種商品化禽白血病ELISA抗原檢測試劑盒均為商品化產(chǎn)品，禽白血病乳膠微球檢測試紙條為山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院研制和提供;278份臨床樣品（包括68份抗凝血樣品、210份血清樣品）均為臨床采集的病料。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品的確診 采用GB/T 26436-2010禽白血病診斷技術(shù)中規(guī)定的熒光定量PCR方法操作規(guī)程對278份臨床樣品進行檢測和判定結(jié)果。

1.2.2 兩種診斷試劑敏感性和特異性比對 將1.2.1中確診的278份臨床樣品同時采用禽白血病乳膠微球檢測試紙條和禽白血病ELISA檢測試劑盒進行檢測、比對。均按照各自的說明書操作和判定結(jié)果，并按公式：敏感性 Se=a/（a+c），特異性Sp=d/（b+d）[9-11]，假陽性率=b/（b+d），假陰性率=c/（a+c），計算兩種檢測試劑的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率（表1）。按照公式 Kappa=2（ad-bc）/（p1q2+p2q1），計算兩種試劑與SAT結(jié)果間的Kappa值，比較其符合程度。Kappa值為0.81～1.00時，判定兩種方法完全符合;為0.61～0.80時，判定兩種方法高度符合;為0.41～0.60時，判定兩種方法中度符合;為0.21～0.40時，判定兩種方法比較符合;0.20以下為輕度符合;0以下為不符合[12]。

1.2.3 兩種診斷試劑重復(fù)性比對 隨機選取經(jīng)熒光定量PCR方法確診的禽白血病樣品（編號P1～P10）和陰性樣品（編號N1～N10）各10份，采用禽白血病乳膠微球檢測試紙條和禽白血病ELISA檢測試劑盒同時進行重復(fù)性試驗，比對兩者的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品的確診結(jié)果

采用GB/T 26436-2010禽白血病診斷技術(shù)中規(guī)定的熒光定量PCR方法操作規(guī)程對278份臨床樣品進行檢測和判定結(jié)果。結(jié)果確診19份禽白血病陽性樣品（包括10份抗凝血樣品，9份血清樣品）和259份禽白血病陰性樣品（包括59份抗凝血樣品和200份血清樣品）。

2.2 敏感性、特異性比對

采用禽白血病乳膠微球檢測試紙條檢測2.1中已確診的278份臨床樣品，共檢出18份陽性樣品、259份陰性樣品，敏感性為94.74%（18/19），特異性為100%（259/259），假陽性率為0（0/19），假陰性率為5.26%（1/19），與熒光PCR方法的Kappa值為0.97;采用禽白血病ELISA檢測試劑盒檢測2.1中已確診的278份臨床樣品，共檢出18份陽性樣品、258份陰性樣品，敏感性為94.74%（18/19），特異性為99.61%（258/259），假陽性率為0.39%（1/259），假陰性率為5.26%（1/19），與熒光PCR方法的Kappa值為0.94，如表2所示。

2.3 重復(fù)性比對

隨機選取確診的禽白血病樣品（編號P1～P3）和陰性樣品（編號N1～N3）各5次，采用禽白血病乳膠微球檢測試紙條和禽白血病ELISA檢測試劑盒同時進行重復(fù)性試驗，比對兩者的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，兩種診斷試劑的檢測結(jié)果均一致，即兩種診斷試劑的重復(fù)性良好，如表3所示。

3 討論

ALV不同亞群能夠誘發(fā)不同種類的白血病，是雞腫瘤性疾病最主要的病原體[13]，也是目前已知的唯一擁有外源性和內(nèi)源性重復(fù)活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒[14]，是最先被人們關(guān)注并研究的禽的三大腫瘤性疾病之一。雞感染ALV后的診斷可以根據(jù)流行病學(xué)及器官和組織的典型病理學(xué)變化進行初步判定，實驗室病原的檢測作為確診依據(jù)。實驗室診斷主要包括病毒的分離鑒定、間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、核酸檢測、膠體金試紙條等[15]。1FAB15F2-9EBA-480A-9E5E-ABB40618407E

ALV分離鑒定可采用的樣品豐富，包括全血、血清、血漿、泄殖腔拭子及組織器官等，方法可靠，特異性高，能夠排除內(nèi)源性ALV的干擾，是國際公認的金標(biāo)準，但病毒分離后需要接種于細胞上進行培養(yǎng)鑒定，操作較繁瑣，技術(shù)性較高，全過程耗時較長，大約需要10 d時間，不適用于大規(guī)模的快速檢測[16]。間接免疫熒光也具有較高的靈敏度和特異性，然而對于間接免疫熒光的結(jié)果判定存在一定的主觀性，如一些非特異性或者微量熒光的判定結(jié)果常常因人而異[15]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和核酸檢測目前在臨床中應(yīng)用較多，具有較強的特異性和靈敏度，但是易出現(xiàn)內(nèi)源性ALV假陽性，并且對設(shè)備要求高，需要與檢測相適應(yīng)的操作環(huán)境和人員，在基層診斷中使用難度較大。禽白血病基層的臨床診斷需要一種特異性強、敏感度高、在操作上簡便快捷以及對人員、設(shè)備、環(huán)境等要求低、更適用基層診斷的方法，而免疫層析試紙條具備便捷、快速、成本低的特點，且隨著技術(shù)的進步，特異性和敏感性不斷提高，在動物疫病檢測中應(yīng)用廣泛[17-18]，日益受到基層診斷工作者的接受。

目前，市面上只有膠體金檢測試紙條，但膠體金檢測試紙條存在靈敏度偏低、穩(wěn)定性較差的缺點，而乳膠微球檢測試紙條由于采用的標(biāo)記載體是乳膠微球，這就克服了膠體金燒制過程中容易出現(xiàn)的顆粒不均勻、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、均一性差的問題，并且微球親水表面且基團含量豐富，使得蛋白結(jié)合能力更高、靈敏度更高，是膠體金的理想替代品。從本研究結(jié)果也可以看出，禽白血病乳膠微球檢測試紙條與禽白血病ELISA抗原檢測試劑盒敏感性、特異性和重復(fù)性均較好，均可以用于養(yǎng)禽場禽白血病的凈化，但乳膠微球檢測試紙條因其使用便捷、快速、成本低廉，因而更適于基層養(yǎng)殖場應(yīng)用。

參考文獻：

[1] 辛朝安.禽病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：114.

[2] Bai，J.，Howes，K.，Payne，L.N.，Skinner，M.A.，.Sequence of host- range determinants in the env gene of a full-length， infectious proviral clone of exogenous avian leukosis virus HPRS- 103 confirms that it represents a new subgroup （designated J） [J]. J. Gen. Virol，1995，76（1）：181-187.

[3] 趙振華.禽白血病 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：108.

[4] 韋平，秦愛建.重要動物病毒分子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[5] B.W.卡爾尼克.禽病學(xué)（第10版）[M].高福等，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：529.

[6] 劉紅，朱朝輝.淺談禽白血病的檢測方法[J].中國獸醫(yī)雜志，2011，47（9）：70-71.

[7] 王廣龍，王皓然，王勇，等。ELISA檢測方法在禽白血病凈化中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2017，194（1）：67-68.

[8] 崔賀，孟凡峰，常爽.抗原ELISA檢測試劑盒和膠體金試紙條用于禽白血病病毒檢測時的比較[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，38（03）：453-457.

[9] 董雅琴，劉爽，鄭輝，等.三種偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較[J].中國動物檢疫，2017，34（11）：79-81.

[10] 葉爾江·色爾哈孜，賽力克·庫魯西，努爾蘭·木合買提，等.烏魯木齊市駱駝養(yǎng)殖現(xiàn)狀與發(fā)展建議[J].新疆畜牧業(yè)，2016（8）：10-14.

[11] 陳文賢，范玉芳.駱駝注射口蹄疫O型-亞洲I型二價滅活疫苗免疫抗體消長檢測報告[J].中國動物檢疫，2010，17（1）：54-55.

[12] 王志剛.駱駝注射口蹄疫疫苗后不良反應(yīng)的處置[J].當(dāng)代畜牧，2009（12）：18-20.

[13] Mason A S，Lund A R，Hocking P M，et al.Identification and characterisation of endogenous Avian leukosis virus subgroup E （ ALVE） insertions in chicken whole genome sequencing data[J].Mobile DNA，2020，1（1）：1-30.

[14] Mason A S，Miedzinska K，Kebede A，et al.Diversity of endogenous Avian leukosis virus subgroup E （ALVE） insertions in indigenous chickens[J].Genetics selection evolution，2020，52（1）：1-7.

[15] 劉艷敏.雞白血病檢測與防治[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2019（19）：101-102.

[16] 沈習(xí).抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的研制與不同試劑盒臨床檢測差異性分析[D].揚州：揚州大學(xué)，2019.

[17] 房超，張泉，易海華，等.檢測犬瘟熱病毒的單克隆抗體膠體金試紙條的制備[J].中國動物傳染病學(xué)報，2011，19（2）：26-30.

[18] 邱榮超，韓占兵，劉永祥，等.豬偽狂犬病gB抗體快速檢測試紙條的研制和評價[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2017，37（8）：1463-1467.1FAB15F2-9EBA-480A-9E5E-ABB40618407E