Illumina MiSeq對熱帶環(huán)境血蜱屬成蜱內(nèi)共生真菌多樣性分析

蘆亞君，袁傳飛，解蕓蕓，夏 琪，夏乾峰

蜱是寄生于多種動物體表的專性吸血節(jié)肢動物，宿主廣泛，具有叮咬宿主吸血及更換宿主的習(xí)性。蜱是多種病原體的儲存宿主和傳播媒介[1]。蜱媒傳染病種類多、范圍廣，已逐漸成為全球倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，威脅人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。其中，血蜱屬是引起嚴(yán)重危害的重要蜱屬[3]。蜱媒病的傳播與蜱的地理分布、自然環(huán)境、宿主行為等因素密切相關(guān)。溫暖、潮濕的熱帶地區(qū)有蜱媒病逐步增加的趨勢[4-5]。

真菌和昆蟲都是物種極其繁多的類群。真菌廣泛存在于幾乎所有昆蟲的體內(nèi)，與昆蟲存在著共生關(guān)系[6]。昆蟲與真菌之間的共生關(guān)系包括雙方都受益的互惠共生關(guān)系、只有一方受益的片利共生關(guān)系、一方受益另外一方受損的寄生關(guān)系及雙方均受損的競爭關(guān)系[7]。真菌具有非常豐富的生物多樣性，這也決定了天然代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性[8]，揮發(fā)性和非揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物可為昆蟲宿主提供抵抗病原細(xì)菌的能力[9]。

昆蟲體內(nèi)的共生真菌群落組成具有高度動態(tài)變化特征，其相對豐度也隨著自然環(huán)境、氣候條件及昆蟲不同的發(fā)育階段轉(zhuǎn)換而發(fā)生變化[10-11]。昆蟲與內(nèi)共生真菌之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系體現(xiàn)在昆蟲為真菌提供物理防護(hù)、生長條件和營養(yǎng)來源等；真菌及其代謝產(chǎn)物可影響昆蟲攝食行為、提供營養(yǎng)元素，或者某些病原真菌可導(dǎo)致昆蟲受損、死亡等[12]。微生物組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)研究[13]有助于更清晰地揭示真菌-昆蟲互作的生物學(xué)現(xiàn)象及發(fā)生機(jī)制。本文以Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析海南熱帶環(huán)境中植被表面上血蜱屬成蜱的內(nèi)共生真菌的群落組成及多樣性，有助于探索蜱與真菌的互作關(guān)系及熱帶環(huán)境對蜱與真菌共進(jìn)化的生態(tài)驅(qū)動因素。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲采集 使用布旗法[14]于海南省?？谑薪紖^(qū)自然環(huán)境中的植被表面采集蜱，置于透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)保存。

1.2 形態(tài)學(xué)分類 采集后的蜱在尼康ECLIPSE Ni-E正置研究級顯微鏡下觀察，根據(jù)外部形態(tài)特征和典型結(jié)構(gòu)，篩選出血蜱屬成蜱作為本實(shí)驗(yàn)的研究對象[15]。

1.3 蜱蟲基因組DNA提取 取1只成蜱，用無菌生理鹽水清洗3次，置于1.5 mL無菌離心管中，加入100 μL動物組織直接PCR試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)中的 AB溶液和研磨珠，置于高效組織細(xì)胞破碎儀(湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司)中，5 000 r/min 研磨30 s，重復(fù)5次，加25 μL AD Buffer，室溫放置10 min后，95 ℃孵育5 min，加入100 μL AC溶液后即為蜱基因組DNA粗提物。

1.4 蜱蟲分子鑒定 擴(kuò)增COⅠ基因的上游引物COI-F：5′-GAGTCGGTAAAATGGCGCTAC-3′，下游引物COI-R：5′-GCTATCTTTAAGAGGGTAATA-3′[16](天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成)。PCR體系總體積為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上游引物、下游引物各0.8 μL，蟲體粗提物4 μL，dd H2O 4.4 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測序(華大基因科技有限公司)。所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。

1.5 Illumina高通量測序和數(shù)據(jù)分析 取20只成蜱，體表分別用75%乙醇和無菌生理鹽水各清洗3次，研磨后的蟲體組織以蛋白酶K裂解法提取基因組DNA。使用兩步PCR法構(gòu)建文庫。擴(kuò)增真菌ITS1基因的引物為ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS1-R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

一次PCR擴(kuò)增體系50 μL，含5×PCR Buffer 10 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，Phusion超保真DNA 聚合酶(南京諾唯贊生物科技有限公司) 0.5 μL，引物F(5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ R(5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) (10 μmol/L) 各1 μL，基因組DNA 1 μL，dd H2O 35.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min。取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)將目的片段進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。二次PCR擴(kuò)增體系40 μL，含5×PCR Buffer 8 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Phusion 超保真DNA 聚合酶0.4 μL，引物F(5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-ACAC-barcode-TCTTTCCCT-ACACGACGCTC-3′)/ R (5′-CAAGCAGAAGA-CGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′) (10 μmol/L) 各1 μL，模板DNA 5 μL，dd H2O 23.6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環(huán)8次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、進(jìn)行純化后構(gòu)建文庫。

以Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序(微基生物科技有限公司)，將測序得到的有效序列進(jìn)行質(zhì)控、過濾、拼接，得到優(yōu)化序列。優(yōu)化序列使用mothur V.1.39.5軟件進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類分析及alpha多樣性分析。

2 結(jié) 果

2.1 蜱分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 COⅠ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在650～750 bp之間有特異性條帶。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對結(jié)果顯示蜱蟲樣本為血蜱屬(Haemaphysalisspp.)，覆蓋度為100%，相似度為89.52%。

2.2 真菌OTU聚類分析 高通量測序后有效序列數(shù)是45 858，優(yōu)化序列數(shù)為44 073，堿基個(gè)數(shù)11 876 878，GC含量為49.02%，序列長度為183～433 bp，平均長度為269 bp(圖1A，圖1B)，聚類為245個(gè)OTU。在序列相似性為97%以上的OTU稀釋性曲線(rarefaction curves)顯示該組數(shù)據(jù)具有足夠的測序深度(圖1C)。豐度等級曲線(rank abundance curves)不平滑，表明245個(gè)OTU聚類的物種分布不均勻(圖1D)。

A：有效序列長度；B：優(yōu)化序列長度；C：稀釋性曲線；D：豐度等級曲線圖1 海南熱帶環(huán)境血蜱屬內(nèi)共生真菌OTU聚類分析Fig.1 OTU cluster analysis of the endosymbiotic fungi in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

2.3 真菌群落組成分析 血蜱屬成蜱體內(nèi)真菌群落組成(圖2)，在各個(gè)分類階元上具有明確分類信息，且按相對豐度排序，其群落構(gòu)成分布于3個(gè)門，分別是子囊菌門(Ascomycota)占80.56%、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占15.43%及接合菌門(Zygomycota)占0.37%。綱水平的群落組成分布于19個(gè)綱，排在前3位分別是座囊菌綱(Dothideomycetes)占52.48%、銀耳綱(Tremellomycetes)占9.34%及糞殼菌綱(Sordariomycetes)占7.94%；目水平的群落組成分布于12個(gè)目，排在前3位分別是煤炱目(Capnodiales)占35.84%、格孢腔菌目(Pleosporales)占14.62%及銀耳目(Tremellales)占8.71%；科水平的群落組成分布于20個(gè)科，排在前3位分別是球腔菌科(Mycosphaerellaceae)占18.49%、小戴衛(wèi)霉科(Davidiellaceae)占6.45%及畸球腔菌科(Teratosphaeriaceae)占3.11%；屬水平的群落組成分布于29個(gè)屬，排在前3位分別是平臍疣孢屬(Zasmidium)占8.99%、枝孢屬(Cladosporium)占6.45%及亞隔孢殼屬(Didymella)占4.31%；種水平的群落組成分布于22個(gè)種及未明確分類地位物種，排在前3位分別是Zasmidiumcitri-griseum占7.72%、皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)占6.43%及Pseudocercosporadovyalidis占3.76%。

A：門水平物種分布；B：綱水平物種分布；C：目水平物種分布；D：科水平物種分布；E：屬水平物種分布；F：種水平物種分布圖2 海南熱帶環(huán)境血蜱屬內(nèi)共生真菌群落組成Fig.2 Endosymbiotic fungal community composition in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

2.4 真菌Alpha多樣性分析 Alpha多樣性包括菌群多樣性指標(biāo)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)；以及菌群豐度指標(biāo)Chao指數(shù)和Ace指數(shù)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了群落中的生物多樣性，Shannon指數(shù)通常在0～5之間，大于1說明該群落具有較高的生物多樣性。Shannon指數(shù)為4.45(圖3A)，說明該樣本具有較高的真菌多樣性[17-18]。Simpson指數(shù)無限接近于0，表示群落中生物多樣性越高。Simpson指數(shù)為0.022 5(圖3B)，說明該樣本具有較高的真菌多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)一致說明本研究中的血蜱屬樣本體內(nèi)真菌具有較高的多樣性[19]。

Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度。在一定數(shù)量范圍內(nèi)，Chao指數(shù)和ACE指數(shù)的曲線迅速上升至245(圖3C，圖3D)，隨著序列數(shù)的增加，曲線平緩，趨于飽和，測序深度基本覆蓋所有物種[20-21]。

A：Shannon指數(shù)；B：Simpon指數(shù)；C：Chao指數(shù)；D：Ace指數(shù)圖3 海南熱帶環(huán)境血蜱屬內(nèi)共生真菌Alpha多樣性分析Fig.3 Alpha diversity analysis of the endosymbiotic fungi in Haemaphysalis spp. from tropical environments in Hainan

3 討 論

蜱媒病是影響人類健康的一個(gè)顯著危險(xiǎn)因素。蜱在溫帶地區(qū)具有季節(jié)消長，而在熱帶地區(qū)全年可見。全球變暖的氣候變化、寵物增加、畜牧業(yè)發(fā)展、戶外旅游和探險(xiǎn)活動增加，均導(dǎo)致蜱媒病感染呈上升趨勢[22]。海南省是我國熱帶省份，全年長夏無冬、植被茂密，非常適合蜱孳生、活動，具有蜱媒病傳播的自然條件。

蜱內(nèi)共生真菌報(bào)道極少，本文以熱帶環(huán)境植被表面上的游離血蜱為研究對象，以真菌ITS1基因進(jìn)行高通量測序，探討血蜱屬成蜱內(nèi)共生真菌的群落組成，分析其多樣性。來自熱帶環(huán)境植被表面的血蜱屬成蜱內(nèi)共生真菌聚類為245個(gè)OTU，且物種分布不均勻。在高階元分類水平上，優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)，其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。Alpha多樣性分析數(shù)據(jù)表明血蜱屬成蜱內(nèi)共生真菌具有十分豐富的生物多樣性。

內(nèi)共生真菌的群落組成及其天然代謝產(chǎn)物是否影響蜱的生理變化，包括棲息特征、侵襲行為及宿主選擇的偏好性等，還需進(jìn)一步探討。研究蜱與內(nèi)共生真菌的互作關(guān)系、內(nèi)共生真菌代謝產(chǎn)物與細(xì)菌之間的拮抗作用、熱帶環(huán)境的生態(tài)驅(qū)動能力及病原真菌在控蜱方面的應(yīng)用[23]，都為深入了解蜱的行為特征及建立有效的生物學(xué)防控措施提供了新的思路。

利益沖突：無

引用本文格式：蘆亞君，袁傳飛，解蕓蕓，等. Illumina MiSeq對熱帶環(huán)境血蜱屬成蜱內(nèi)共生真菌多樣性分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：441-446. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.047