響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取工藝

◎ 黃卉卉，柳誠剛，王 清，王子偉，劉 濤，許雪霞

（信陽農(nóng)林學院 食品學院，河南 信陽 464000）

枸骨為冬青科冬青屬常綠植物，枸骨的果實、葉子和根部都具有一定的藥用價值，枸骨具有補肝腎、清熱涼血、祛風止痛等多種功效[1-4]。枸骨中含有多糖，多糖是一種重要的生命物質(zhì)，其參與了細胞的多種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，強化了機體自身的免疫功能，天然植物多糖提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗癌及延緩衰老等作用[5-7]。近年來，枸骨化學成分和功效的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，但其多糖研究很少見報道。因此，為進一步開發(fā)利用枸骨資源，本研究以枸骨根為原料，運用響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖的提取工藝，以期為枸骨資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸骨根，購自信陽市醫(yī)藥公司，經(jīng)信陽農(nóng)林學院中藥教研室鑒定為枸骨根，干燥后粉碎備用。

苯酚（濟南創(chuàng)世化工有限公司）、濃硫酸（湖北鑫潤德化工有限公司）、葡萄糖（無錫市晶科化工有限公司）、無水乙醇、丙酮和乙醚，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外線分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；WK-4008高速藥物粉碎機：青州市（山東）精誠機械有限公司；LDZ4-0.8型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京精科華瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 繪制標準曲線

準確稱取葡萄糖2.500 0 g，用蒸餾水溶解，定容于500 mL量瓶中。移取2 mL定容至100 mL容量瓶，即得濃度為100 μg·mL-1葡萄糖標準溶液。分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL和0.9 mL于10 mL具塞試管中，加水至1 mL，搖勻，加入1 mL體積分數(shù)5%苯酚，搖勻后，加入5 mL濃H2SO4立即振蕩搖勻，放置15 min，在波長490 nm條件下測定吸光度，作濃度-吸光度曲線，得標準曲線方程Y=5.448 6X+0.004 7，R2=0.992 5[8]。

1.3.2 枸骨根多糖的提取流程

參照王清等[9]、王子偉等[10]提取工藝流程，確定枸骨根多糖的提取流程為：枸骨根粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加無水乙醇沉淀→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥→枸骨根粗多糖。

1.3.3 枸骨根多糖的含量測定

采用苯酚-硫酸法[11]，即將所得到的粗多糖產(chǎn)品稀釋100倍，取多糖液2.0 mL緩慢加入5%的苯酚1.0 mL，搖勻，再加5.0 mL濃H2SO4，立即搖勻，室溫靜置15～20 min，于490 nm測其吸光值。利用標準曲線計算出多糖含量，得出多糖的提取率。實驗重復(fù)3次，取平均值。多糖提取率計算公式為：多糖提取率=（多糖含量/原料重）×100%。

1.3.4 單因素試驗

（1）提取時間對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別溶于30 mL蒸餾水中，并于70 ℃溫度下分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

（2）提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別溶于30 mL蒸餾水中，于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃溫度下水浴提取2 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

（3）液料比對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉，分別以液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1溶于蒸餾水中，于70 ℃溫度下水浴提取2 h，過濾、離心得上清液，測定上清液吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以枸骨根多糖提取率為響應(yīng)值，選取時間（A）、溫度（B）、液料比（C）這3個因素設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對枸骨根多糖提取工藝進行進一步優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對枸骨根多糖提取率的影響

由圖1可看出，隨著提取時間的增加，枸骨根多糖提取率呈先增長后下降趨勢，當提取時間為2 h時提取率達到最大值，隨后提取率緩慢下降，說明多糖濃度已達到飽和，提取時間過長也可能導(dǎo)致其他物質(zhì)溶出，進而影響多糖的提取率。因此，提取時間應(yīng)選擇2 h為宜。

2.1.2 提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響

由圖2看出，隨提取溫度增高，枸骨根多糖提取率逐漸增高，至80 ℃達到最大值，隨后提取率下降，其可能的原因是溫度過高對枸骨根多糖的結(jié)構(gòu)有所影響，并造成多糖部分分解。因此，提取溫度應(yīng)選擇80 ℃為宜。

2.1.3 液料比對枸骨根多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著溶劑用量增加，枸骨根多糖提取率呈先增大后降低趨勢，液料比為10∶1（mL·g-1）時提取率達最大值，是因為當液料比較小時，由于樣品中的多糖未能充分溶解，故多糖提取率隨著液料比的增大而升高；而達到10∶1后趨于穩(wěn)定，再增加溶液的體積對多糖提取率影響較小，考慮到成本效益，液料比應(yīng)選擇10∶1為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取工藝的試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，可得到回歸方程：Y=5.22+0.049A-0.12B+0.32C-0.29AB+0.44AC+0.16BC-0.39A2-0.30B2-0.12C2。通過對方程的進一步分析可以確定優(yōu)化枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)組合。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果表

2.2.2 方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對枸骨根多糖提取率結(jié)果進行方差分析，見表3。

由表3可看出模型P＜0.01，說明模型極顯著，且一次項C，交互項AB、AC，二次項A2、B2差異極顯著，一次項A、B，交互項BC，二次項C2差異不顯著，說明3個因素交互作用共同影響多糖提取率，不是單一因素作用的結(jié)果，且由P值大小可得各因素對多糖提取率影響為：C（液料比）＞B（溫度）＞A（時間）。

表3 方差分析表

2.2.3 響應(yīng)面分析

對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖。由圖4、5、6可見，不同因素交互作用對枸骨根多糖提取率的影響程度不同，其中，提取時間（A）與提取溫度（B）、提取時間（A）與液料比（C）的交互作用均比較明顯，而提取溫度（B）與液料比（C）的交互作用不明顯，這與方差分析結(jié)果一致。

圖4表明了液料比取中心水平時，提取時間與提取溫度對枸骨根多糖提取率的交互作用。當液料比一定時，隨著提取時間和提取溫度的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

圖5表明了提取時間取中心水平時，提取溫度與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。當提取溫度一定時，隨著液料比的增加，枸骨根多糖提取率呈上升趨勢；當液料比一定時，隨著提取溫度的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

圖6表明了提取溫度取中心水平時，提取時間與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。由圖6可看出，當提取溫度一定時，隨著提取時間和液料比的增加，枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降趨勢。

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定

在提取時間、提取溫度、液料比單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，經(jīng)過以上對模型方程的方差分析以及其響應(yīng)面圖形分析可以得出枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果顯示，在液料比為12∶1 mL·g-1，提取時間為2.2 h，提取溫度為85 ℃時，理論上枸骨根多糖提取率達到最高，為5.62%。

2.2.5 驗證試驗

為檢驗結(jié)果的可靠性，依據(jù)最佳提取條件進行驗證試驗。設(shè)計3組平行試驗，測得枸骨根多糖提取率平均值為5.59%，與上述預(yù)測值5.62%誤差較小，表明該工藝穩(wěn)定可靠

3 結(jié)論

為更好地開發(fā)枸骨根資源，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到枸骨根多糖提取的最佳工藝條件為液料比12：1 mL·g-1，提取時間2.2 h，提取溫度85 ℃。此時理論上枸骨根多糖提取率可達到5.62%，驗證值為5.59%，說明其實際提取率與預(yù)測理論的最佳提取率相對誤差較小，故響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取的工藝參數(shù)可靠有效，可作為實際應(yīng)用操作的參考，也為進一步研究枸骨根多糖奠定了理論基礎(chǔ)。