適用于食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)觀察的冷凍切片技術(shù)*

余秋雨，嚴(yán) 冬，劉 宇，王守現(xiàn)，高 琪

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100097；2.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

食用菌子實(shí)體的形成和發(fā)育機(jī)制是近年來食用菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。從細(xì)胞生物學(xué)層面對(duì)子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察是研究子實(shí)體形成、發(fā)育最為有效和直觀的方法[1]。雜交育種是目前食用菌新品種選育的主要方法，明確擔(dān)孢子的核相和有性生活史是擔(dān)子菌開展雜交育種的基礎(chǔ)[2-3]。孢子內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)直接影響擔(dān)子菌的有性生殖模式[4]，解析擔(dān)子中細(xì)胞核的行為從而明確擔(dān)孢子中的核數(shù)，不僅是研究擔(dān)子類食用菌有性生活史的基礎(chǔ)，而且對(duì)開展食用菌新品種的育種工作來說也極有必要。

便捷的連續(xù)切片及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位技術(shù)，有助于通過細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞核變化規(guī)律。常用的切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等。徒手切片法是進(jìn)行動(dòng)、植物組織顯微觀察時(shí)最實(shí)用的方法之一，其不需要專門的儀器設(shè)備和特殊化學(xué)試劑（脫水劑、包埋劑等）處理。但觀察效果與樣品處理后的軟硬程度和切片的形態(tài)密切相關(guān)，且在制片過程中樣品的組織結(jié)構(gòu)易被破壞，難以得到薄而完整的切片[2]。例如常用的刀片壓切法，將樣品組織夾在兩塊刀片間壓切，得到的切片往往破損較多，有些含海綿組織較多的樣品，在海綿組織受壓復(fù)原時(shí)會(huì)因吸入空氣而使顯微視野下出現(xiàn)氣泡，嚴(yán)重影響觀察結(jié)果[5]。由此可見，該方法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高。石蠟切片法已廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物組織的顯微觀察中，在大型真菌如雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、黑木耳（Auricularia auricula）和橘黃裸傘（Gymnopilus spectabilis）等子實(shí)體的研究中也有應(yīng)用[6-8]。但石蠟切片法的步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，所使用的試劑如二甲苯毒性較大，會(huì)對(duì)操作者的身體健康造成一定影響[9]。另外，在石蠟切片染色過程中食用菌材料不易著色[10]，高溫融蠟這一操作極易導(dǎo)致樣品組織結(jié)構(gòu)和染色體的損傷，并且石蠟自發(fā)熒光的干擾會(huì)使其不適于熒光染色以進(jìn)行一些其他的免疫熒光染色觀察[11]。

冷凍切片法，是將樣品組織置于低溫條件下，待其硬度達(dá)到一定要求時(shí)進(jìn)行切片。與常規(guī)的石蠟切片法相比，冷凍切片的制作過程無需脫水、透明和浸蠟等操作，不會(huì)因高溫融蠟而造成樣品組織的損傷，可保持樣品原有的形態(tài)，常用于原位雜交、組織化學(xué)和免疫定位等研究[12-13]。李建霞等[12]以毛白楊的子房組織為例，優(yōu)化了直接包埋冷凍切片技術(shù)的冷箱溫度、冷臺(tái)溫度和冷凍時(shí)間，獲得了較好的切片，并在其他植物組織上驗(yàn)證了該方法的普適性。張力平[14]根據(jù)工作經(jīng)驗(yàn)和試驗(yàn)，改良固定液成分，探索出一套適用于植物病原真菌的冷凍切片技術(shù)。姚娟妮等[15]將冷凍切片技術(shù)用于植物病原菌侵染的預(yù)檢。由于不同種類的樣品組織具有不同的性質(zhì)和特點(diǎn)，相應(yīng)的冷凍切片制備方法也存在一定差異。食用菌的子實(shí)體和菌絲體較軟，尤其是子實(shí)體的菌褶部分較小、易碎且含水量高，常規(guī)切片耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，不能滿足食用菌顯微結(jié)構(gòu)觀察的試驗(yàn)需求。鑒于冷凍切片具有操作便捷、用時(shí)短、組織完整性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)冷凍切片技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立高效且適用于食用菌組織的冷凍切片技術(shù)，以期為食用菌的分類鑒定、有性生活史研究和新品種的選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

絲球小奧德蘑（Oudemansiella apalosarca）菌株JZB-2115055、香菇（Lentinula edodes）菌株JZB-2102217和平菇（Pleurotus ostreatus）菌株 JZB-2101390，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所食用菌研究室提供。

1.1.1 栽培料配方

絲球小奧德蘑栽培料：棉籽殼50%、木屑30%、麩皮18%、石灰2%，含水量60%～65%；香菇栽培料：木屑78%、麩皮20%、石膏1%、葡萄糖1%，含水量50%～55%；平菇栽培料：棉籽殼39%、玉米芯39%、麩皮20%、石灰2%，含水量60%～65%。

1.1.2 主要試劑與儀器

海藻糖、甘油、蔗糖、0.1 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O、 0.001 9 mol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.008 1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冷凍切片組織包埋劑，購(gòu)自Leica公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），購(gòu)自Sigma公司；戊二醛固定液（2.5%戊二醛），多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛），購(gòu)自Solarbio公司。

CM1950冷凍切片機(jī)，Leica公司；IX71熒光倒置顯微鏡，Olympus公司。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 固定

用鑷子選取絲球小奧德蘑的菌褶組織，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次，加入含有不同成分的固定液，于4℃下固定，棄液體，得到固定好的樣品。對(duì)照組不加固定液。不同固定方式及分組見表1。

表1 絲球小奧德磨的菌褶組織的不同固定方式Tab.1 The different fixation method for Oudemansiella apalosarca gill

1.2.2 預(yù)處理

將固定好的樣品用PBS清洗2次～3次后，設(shè)置5個(gè)分組（P1～P5）進(jìn)行預(yù)處理。P1：海藻糖5%、甘油10%，室溫孵育1 h；P2：海藻糖10%、甘油5%，室溫孵育1 h；P3：蔗糖20%和甘油10%，室溫孵育1 h；P4：分別按照30%、40%、50%、60%、70%的乙醇梯度水溶液順序進(jìn)行處理，各梯度均處理10 min；P5（CK）：對(duì)照，不進(jìn)行預(yù)處理。P1～P4進(jìn)行預(yù)處理后棄去液體，得到預(yù)處理的樣品。

1.2.3 包埋

將樣品托放至樣品準(zhǔn)備臺(tái)，-10℃預(yù)冷5 min，預(yù)冷后利用冷凍切片包埋劑進(jìn)行逐層包埋，直至樣品全部被包埋，在樣品臺(tái)上繼續(xù)冷凍直至包埋劑凝固。

1.2.4 切片

用冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片。箱體和冷刀溫度設(shè)定為-20℃，將包埋好的樣品固定在樣品臺(tái)上，將樣品表面修飾平整后，設(shè)置6個(gè)分組（T1～T6）進(jìn)行切片。T1：切片厚度為4 μm；T2：切片厚度為6 μm；T3：切片厚度為8 μm；T4：切片厚度為 10 μm；T5：切片厚度為12 μm；T6：切片厚度為20 μm。

1.2.5 制作顯微玻片

切片完成后，用毛筆挑取切下來的材料放置于載玻片上，用ddH2O清洗2次，去除殘留的包埋劑，晾干得到干凈的載玻片。

1.2.6 品紅染色試驗(yàn)

向潔凈的載玻片上滴加品紅染液，將蓋玻片蓋于染色區(qū)域，在蓋玻片四周涂抹指甲油封片，將載玻片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.7 熒光染色試驗(yàn)

使用干凈的載玻片，在需染色區(qū)域滴加30 μL DAPI染色液，將蓋玻片蓋于染色區(qū)域，四周涂抹指甲油封片，冰盒內(nèi)靜置1 h。將載玻片置于熒光顯微鏡下，在激發(fā)波長(zhǎng)405nm、發(fā)射波長(zhǎng)488nm下進(jìn)行觀察。

1.2.8 技術(shù)適配性驗(yàn)證

采用改良后的冷凍切片技術(shù)分別對(duì)平菇子實(shí)體、香菇子實(shí)體和香菇菌絲體等材料進(jìn)行切片。在顯微鏡下觀察切片效果，驗(yàn)證該技術(shù)在食用菌領(lǐng)域的適配性，并優(yōu)化不同食用菌組織材料的最適切片厚度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定條件優(yōu)化結(jié)果

各組樣品使用不同固定方法進(jìn)行固定，之后均添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行相同預(yù)處理，統(tǒng)一設(shè)置切片厚度為12 μm。不同固定方式對(duì)切片的影響見圖1。

圖1 不同固定方法下絲球小奧德蘑的冷凍切片F(xiàn)ig.1 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different fixation methods

如圖1所示，與固定后的樣品相比，對(duì)照組F5（CK）組織細(xì)胞破損嚴(yán)重，且擔(dān)子細(xì)胞輪廓不清晰，無法觀察到完整的細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)過固定的樣品（F1～F4），細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、清晰。與F1（戊二醛固定液固定）的樣品相比，F(xiàn)2（多聚甲醛固定液固定）的樣品有少部分組織仍易出現(xiàn)破損情況。F1固定20 min后，樣品的擔(dān)子細(xì)胞輪廓清晰且結(jié)構(gòu)完整，可滿足大部分光學(xué)染色和熒光染色需要。F3和F4切片結(jié)果顯示，菌褶組織固定時(shí)間超過1 440 min時(shí)，組織可完全浸入固定液中，但都會(huì)對(duì)細(xì)胞組織造成嚴(yán)重破壞，影響組織的完整性。

2.2 預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)切片的影響見圖2。

如圖2所示，P5（CK）未經(jīng)預(yù)處理的組織細(xì)胞破碎，損傷嚴(yán)重。P4（酒精梯度脫水）的樣品，細(xì)胞內(nèi)失水嚴(yán)重，造成孢子大面積皺縮損傷。P3（蔗糖20%、甘油10%預(yù)處理）的樣品，其組織在一定程度上保持了完整性，但擔(dān)子細(xì)胞失水皺縮嚴(yán)重，細(xì)胞界限不清晰。P2（海藻糖10%、甘油5%預(yù)處理）的樣品，其擔(dān)子細(xì)胞界限清晰明顯，但海藻糖濃度過高仍會(huì)導(dǎo)致?lián)蛹?xì)胞失水皺縮。P1（海藻糖5%、甘油10%預(yù)處理）的樣品，其擔(dān)子細(xì)胞界限明顯清晰，無失水皺縮現(xiàn)象，便于顯微結(jié)構(gòu)觀察。

圖2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下絲球小奧德蘑的冷凍切片F(xiàn)ig.2 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different pretreatment methods

2.3 絲球小奧德蘑擔(dān)子觀察的最適切片厚度

按照設(shè)定的不同切片厚度（T1～T6）進(jìn)行切片后，發(fā)現(xiàn)T1（切片厚度4 μm）和T2（切片厚度6 μm）的切片中部破損嚴(yán)重，有較大空隙，因此后續(xù)只對(duì)T3～T6的切片進(jìn)行品紅染色觀察，結(jié)果見圖3。

圖3 不同厚度的絲球小奧德蘑冷凍切片F(xiàn)ig.3 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca with different thicknesses

如圖3所示，品紅染色后絲球小奧德蘑的擔(dān)子及菌絲輪廓更加清晰，便于觀察。對(duì)比觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T3～T5（切片厚度為 8 μm～12 μm）處理下觀察結(jié)果最為理想；切片厚度越薄，菌褶中心部菌絲組織越容易破碎；T6（切片厚度為20 μm）易出現(xiàn)多層擔(dān)子細(xì)胞現(xiàn)象。因此，觀察絲球小奧德蘑單個(gè)擔(dān)子細(xì)胞內(nèi)情況時(shí)，最適切片厚度為8 μm；觀察整體菌褶組織情況時(shí)，最適切片厚度為12 μm。

2.4 熒光染色效果

對(duì)絲球小奧德蘑冷凍切片進(jìn)行熒光染色，觀察結(jié)果見圖4。

圖4 絲球小奧德蘑冷凍切片熒光染色Fig.4 Fluorescent staining of freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca.

如圖4所示，通過使用DAPI染色液進(jìn)行熒光染色，可清晰觀察到絲球小奧德蘑菌褶中完整的孢子、菌絲、擔(dān)子細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，以及其中的細(xì)胞核，而且信噪比較高，表明該技術(shù)可以應(yīng)用于熒光染色核相分析。

2.5 改良后冷凍切片技術(shù)在食用菌中適配性

利用條件優(yōu)化的冷凍切片技術(shù)，選取戊二醛為固定液，固定時(shí)間為20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)不同的食用菌品種及部位進(jìn)行切片，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，改良后的冷凍切片技術(shù)適用于平菇的子實(shí)體（圖5A）、香菇的子實(shí)體（圖5B）及菌絲體（圖5C）。由于不同種類的食用菌擔(dān)子大小及菌絲直徑存在差異，因此不同種類的食用菌最適切片厚度不同，其中成熟的平菇子實(shí)體菌褶中擔(dān)子觀察適宜切片厚度為6 μm～8 μm，可觀察到菌褶中菌絲和擔(dān)子完整形態(tài)結(jié)構(gòu)。成熟香菇子實(shí)體及次生菌絲體觀察的適宜切片厚度為4 μm～6 μm。

3 討論與結(jié)論

組織切片是從細(xì)胞生物學(xué)層面對(duì)食用菌子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究的最為有效和直觀的方法之一[1]。常用的組織切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等，其中徒手切片法對(duì)操作者的技術(shù)要求較高；石蠟切片法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，樣品組織結(jié)構(gòu)易受損[9]。冷凍切片法操作較簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，可保持樣品原有的生活形態(tài)，檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確，可用于原位雜交、組織化學(xué)和免疫定位等多種研究[12]。自1891年被確定為正式的診斷方法以來，冷凍切片成為臨床上幫助醫(yī)生確定疾病性質(zhì)的一種可靠手段，在疾病診斷中廣泛應(yīng)用[15]。近年來，冷凍切片技術(shù)被逐步應(yīng)用到植物研究中，多用于觀察植物器官結(jié)構(gòu)，如高度木質(zhì)化材料、植物花器官、植物微管骨架以及植物組織化學(xué)方面[15]。謝佩松等[16]利用冰凍切片技術(shù)，對(duì)草本植物水稻和麥冬的根、莖、葉進(jìn)行了冰凍切片，觀察其顯微結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的顯微化學(xué)定位，獲得了高質(zhì)量的圖片。朱登峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，快速冷凍切片法處理的植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存較好，木質(zhì)素染色清晰，且操作方法簡(jiǎn)便、快速、有效。寧代鋒等[18]建立了一種直接包埋冷凍和適當(dāng)回溫相結(jié)合的方法，不僅可以制作出植物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)保存完整的組織切片，而且避免了使用冰凍保護(hù)劑的弊端。

目前對(duì)食用菌的切片觀察大多使用其他的切片法。萬佳寧等[11]運(yùn)用包埋切片法制備了草菇（Volvariella volvacea）子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的菌褶切片，并運(yùn)用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡清晰觀察到草菇擔(dān)子細(xì)胞中的核相以及在減數(shù)分裂中的變化等。王瑞娟等[9]運(yùn)用改良石蠟切片法制備了金針菇（Flammulina velutiper）子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的切片，觀察其菌褶和菌柄的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)以檸檬烯為透明劑時(shí)金針菇子實(shí)體組織結(jié)構(gòu)清晰、完整、無皺縮。萬佳寧等[19]通過優(yōu)化石蠟切片方法對(duì)香菇子實(shí)體發(fā)育初期組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明Van-Clear為最適透明劑，以其制備的石蠟切片中香菇子實(shí)體各部分組織結(jié)構(gòu)清晰、完整、無皺縮變形。張鵬[8]通過石蠟制片法制片觀察木耳（Auricularia auricula）內(nèi)部結(jié)構(gòu)。酒連娣[20]運(yùn)用石蠟切片和徒手切片相結(jié)合的方法，對(duì)亞側(cè)耳（Panellus serotius）原基到成熟子實(shí)體各階段的材料進(jìn)行解剖研究。而使用冷凍切片技術(shù)對(duì)食用菌顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的報(bào)道較少，分析其主要原因可能是食用菌組織，尤其是菌褶部分易碎且含水量高，常規(guī)的冷凍切片方法并不適用于食用菌組織切片。

因此，此次針對(duì)食用菌的材料特點(diǎn)建立一種適用于食用菌擔(dān)子結(jié)構(gòu)觀察的冷凍切片技術(shù)，經(jīng)驗(yàn)證可成功應(yīng)用于絲球小奧德蘑、平菇和香菇子實(shí)體。該冷凍切片技術(shù)條件為：選取戊二醛為固定液，固定20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理。切片厚度應(yīng)根據(jù)不同的食用菌品種稍加調(diào)整，絲球小奧德蘑子實(shí)體切片厚度的選擇范圍為8 μm～12 μm，平菇子實(shí)體切片厚度的選擇范圍為6 μm～8 μm，香菇子實(shí)體及菌絲體切片厚度的選擇范圍為4 μm～6 μm，此時(shí)有助于獲得質(zhì)量較高的組織切片。該技術(shù)具有無毒、快速、操作簡(jiǎn)便、切片厚度薄、可用于免疫研究等優(yōu)點(diǎn)，可顯著提高食用菌組織切片的質(zhì)量，為食用菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察提供有力支持，為食用菌育種研究提供有效的方法保障。