不同生長階段甜靈芝產(chǎn)量及品質(zhì)的比較研究*

李一凡，周振輝，陳東梅，黎 鋼，張 智

（廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663）

靈芝（Ganoderma spp.）來源于多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma），具有養(yǎng)心安神、止咳平喘的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明靈芝具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[2-4]。隨著靈芝顯著的藥效作用為大眾熟知，人們對靈芝的應(yīng)用從治療病癥轉(zhuǎn)向預防和保?。皇褂们衅淖訉嶓w煮水或煲湯，破壁孢子粉直接售賣或提取孢子油；相較而言，靈芝子實體更易獲得，且售價遠低于孢子粉加工產(chǎn)品。在民間使用最多的靈芝為赤芝（G.lucidum），但赤芝苦味重，大眾接受度差，這對靈芝子實體的推廣利用產(chǎn)生了一定影響。甜靈芝為1989年從日本引入的新品種[5]，其苦味較淡，味偏甜，口感優(yōu)于赤芝，大眾接受度較佳，食用評價高于赤芝，具有很高的市場開發(fā)價值。據(jù)文獻報道，甜靈芝早期被認為屬于赤芝的變種[5]，但具體的品種鑒定結(jié)果以及該品種的拉丁名，至今未有報道。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者通過結(jié)合形態(tài)學與分子技術(shù)進行品種分類鑒定，以確定種屬及來源。近年來，隨著各方面研究的深入，大眾在生物學及生理學特性[6]、菌種制作[7]、培養(yǎng)方式[8-9]、功能成分分析[10]、木質(zhì)素降解酶活性[11]等方面對甜靈芝有了更多的了解。其栽培、生產(chǎn)目前已初具規(guī)模，掌握不同生長階段的產(chǎn)量及品質(zhì)可以更好地確定最佳采收時期及子實體開發(fā)方向，從而最大程度地提高菇農(nóng)及企業(yè)的效益。通過分析、比較不同生長階段甜靈芝子實體的產(chǎn)量、多糖及三萜含量、孢子粉產(chǎn)量、收粉后子實體的品質(zhì)等數(shù)據(jù)，以為甜靈芝的規(guī)?；耘嗵峁﹨⒖家罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

所用甜靈芝菌株為廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司保藏管（編號GL-AS）。由廣東省科學院微生物研究所食用菌研究中心進行分子鑒定，采用試劑盒法提取其DNA，以ITS序列為引物進行擴增，再結(jié)合其宏觀及微觀形態(tài)，結(jié)果表明該甜靈芝菌株為無柄靈芝（G.resinaceum）。

1.1.2 儀器與試劑

磁珠法真菌DNA提取試劑盒B，廣州邁寶生物科技有限公司；SHHL-1.2液壓翻斗培養(yǎng)料混合機、SZDY-1000食用菌培養(yǎng)料沖壓裝袋機，漳州市興寶機械有限公司；YXQ.WF22-800SZ臥式矩形壓力蒸汽滅菌器，湖南共創(chuàng)醫(yī)療設(shè)備有限公司；HK-C2D雙人垂直雙面潔凈工作臺，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麩皮，五得利集團商丘面粉有限公司；高粱，本地超市采購；木屑，產(chǎn)自佛山南海；棉籽殼，產(chǎn)自廣州市白云區(qū)、新疆；碳酸鈣，產(chǎn)自廣州市白云區(qū)；17 cm×35 cm×0.005 cm聚丙烯折角袋，漳州天珍塑料制品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方及制作

母種培養(yǎng)基：土豆200 g·L-1（去皮，切成小塊后水煮，過濾，濾液備用）、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、硫酸鎂 1.5 g·L-1、磷酸二氫鉀 3 g·L-1、VB11 mg·L-1，pH 自然。

原種培養(yǎng)料：高粱98%（浸泡過夜，煮至無白心），碳酸鈣2%。

栽培種培養(yǎng)料及菌袋：木屑62%、棉籽殼27%、麩皮10%、碳酸鈣1%，含水量63%～65%，pH 6.2～6.4，每袋裝濕料1 kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)菌培養(yǎng)

將接種好的試驗菌袋放置在發(fā)菌房中黑暗培養(yǎng)，期間保證發(fā)菌房的環(huán)境參數(shù)為溫度22℃～24℃、濕度60%～70%、CO2體積分數(shù)0.2%～0.3%。在發(fā)菌期間觀測記錄試驗菇包的菌種萌發(fā)時間、長至袋肩時間、滿袋時間、袋間溫度以及其他生長情況。

1.2.2 出菇培養(yǎng)

待菌袋長滿白色菌絲且海綿蓋可見少量原基時在菌袋上開小口，之后立即移入出菇房中進行出菇生長情況觀測，管理參數(shù)在黃毅[12]、陳鋒平[13]的參數(shù)基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。期間保證出菇房的環(huán)境參數(shù)為溫度26℃～27℃、濕度80%～90%、光照200 lx～600 lx；生長前期維持CO2體積分數(shù)0.1%～0.2%，待菌柄長至4 cm～5 cm時修枝，修枝后CO2體積分數(shù)降低至0.06%～0.08%，繼續(xù)培養(yǎng)。在出芝管理過程中記錄現(xiàn)蕾時間、菌柄長度變化、開傘情況。

1.2.3 采收

此菌株菌蓋為橢圓形，在開傘過程中，根據(jù)菌蓋大小設(shè)置3個生長階段（S1：菌蓋長直徑為4 cm～6 cm；S2：菌蓋長直徑為6 cm～8cm；S3：菌蓋長直徑為8 cm～10 cm）采收子實體，測定并記錄采收子實體的菌蓋長直徑及短直徑、鮮重及干重、含水量、三萜及多糖的含量。

1.2.4 孢子粉產(chǎn)量

當子實體邊緣的白色生長圈消失，菌蓋表面出現(xiàn)少量孢子粉時將其放入特定的收粉裝置中，進行孢子粉產(chǎn)量測定試驗，收粉裝置見圖1。

如圖1所示，收粉裝置為規(guī)格40.5 cm×40.5 cm×28.0 cm的紙箱，內(nèi)固定規(guī)格為80 cm×70 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，箱口處固定1層無紡布，再外置1層塑料膜，每個收粉箱內(nèi)放置4個菌袋。收粉完成時，用小刷子將子實體及菌袋表面的孢子粉輕輕掃入聚丙烯袋中，剪下子實體稱重后，菌孔朝下放置在干凈的A4紙上，隔日觀察子實體是否繼續(xù)噴粉以判斷是否達到噴粉終點，收集的孢子粉稱重后測定其含水量。觀測并記錄不同收粉時間（30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d）的孢子粉產(chǎn)量及子實體情況，確定最佳收粉時間。

圖1 孢子收粉裝置Fig.1 Collecting device of spore powder

1.3 多糖和三萜的含量測定

子實體60℃烘干，干品參照《中國藥典》中靈芝多糖及三萜的測定方法進行含量測定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)收集與分析

每個處理組觀測60包，重復3次。采用SPSS 20軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法進行差異顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菌情況

供試靈芝菌株發(fā)菌情況見表1。

表1 無柄靈芝菌絲體生長情況Tab.1 Mycelium growth Growth of Ganoderma resinaceum

如表1所示，接種后約3 d菌種萌發(fā)，7 d～8 d菌絲長至袋肩，18 d～20 d滿袋，后熟2 d～3 d出現(xiàn)原基頂蓋現(xiàn)象，可以進行出菇處理。在發(fā)菌過程中兩個菌袋間的溫度變化為22℃～25℃，菌絲長至袋肩時袋間溫度最高。

2.2 出菇情況

供試靈芝菌株出菇期生長情況見表2，開傘前及開傘后3個階段的子實體形態(tài)見圖2。

如表2、圖2所示，出菇培養(yǎng)后3 d～4 d現(xiàn)蕾，14 d～16 d菌柄長度約為4 cm，此時進行修枝，再繼續(xù)培養(yǎng)至開傘；22 d～23 d菌蓋的長直徑達4 cm～6 cm，26 d～27 d菌蓋的長直徑達6 cm～8 cm，29 d～30 d菌蓋的長直徑達8 cm～10 cm并出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象，子實體培養(yǎng)完成。該菌株出菇階段表現(xiàn)出原基數(shù)量較多、菌柄細長、噴粉時間較早的生長特點。

表2 無柄靈芝出菇情況Tab.2 Fruiting of Ganoderma resinaceum

圖2 不同生長階段的無柄靈芝子實體Fig.2 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages

按照試驗設(shè)置的3個階段采收子實體，并對各項指標進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。

表3 開傘后不同生長階段的無柄靈芝子實體情況Tab.3 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages after the pileus opening

由表3可知，在該培養(yǎng)條件下，菌蓋長直徑達到（9.37±0.46）cm，短直徑達到（7.62±0.66）cm時甜靈芝子實體基本成熟，開始出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象。對于子實體的產(chǎn)量而言，隨著子實體不斷長大，其質(zhì)量不斷增加，但子實體含水量逐漸降低；子實體基本成熟時，平均單菇鮮質(zhì)量為（30.86±1.70）g，含水量約77%。分析該甜靈芝子實體的三萜和多糖含量發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，子實體的三萜含量不斷增加；在菌蓋生長至最大，子實體成熟時三萜含量達到最高，為（2.46±0.64）%。與之相反，其子實體的多糖含量隨著培養(yǎng)時間的增加不斷降低，在開傘初期多糖含量最高，為（1.14±0.11）%。由此可見，要想獲得三萜含量高的子實體，需要培養(yǎng)至成熟后再采收，而想要獲得多糖含量高的子實體，則需要在開傘初期采收。

2.3 孢子粉產(chǎn)量

當邊緣白色生長圈消失，出現(xiàn)輕微噴粉現(xiàn)象后將子實體放入收粉裝置中，跟蹤觀測不同采收時間的孢子粉產(chǎn)量及子實體情況，結(jié)果見表4。

表4 不同收粉時間的無柄靈芝孢子粉產(chǎn)量及子實體情況Tab.4 Spore powder yield and fruit body of Ganoderma resinaceum at different times for harvesting spore powder

由表4可知，隨著收粉時間的增加，孢子粉產(chǎn)量不斷上升；到第40天時孢子粉干重為16.36 g/袋，產(chǎn)量變化幅度達到最大；到第50天時雖然孢子粉產(chǎn)量最高（16.53 g/袋），但從第40天之后產(chǎn)量的變化幅度開始減小，且持續(xù)降低。孢子粉的含水量在收粉初期最高。收粉后子實體的單菇鮮質(zhì)量逐漸下降，與子實體的干燥程度呈正相關(guān)，收粉50天后子實體較輕且質(zhì)脆，與烘干后的靈芝相似。觀察發(fā)現(xiàn)收粉40 d時僅有極少數(shù)子實體可繼續(xù)產(chǎn)生少量孢子粉，結(jié)合時間、成本以及收粉末期會出現(xiàn)孢子粉顆粒不飽滿、品質(zhì)差的情況，考慮孢子粉收集時間約40 d為宜，此時基本達到孢子粉采收的終點。

3 討論與結(jié)論

甜靈芝為商品名，目前市售甜靈芝可能存在品種混雜的情況。通過鑒定發(fā)現(xiàn)供試的甜靈芝品種為無柄靈芝。柯斌榕[15]曾對中國部分靈芝產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源進行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前栽培的靈芝品種主要有3類，包括赤芝菌株13個、紫芝（G.sinense）菌株1個、無柄靈芝菌株4個。由此可見，無柄靈芝早已被廣泛栽培和使用。盡管無柄靈芝與赤芝在形態(tài)上存在一定差異，但二者親緣關(guān)系十分接近，經(jīng)常容易混淆[16]。對無柄靈芝的有效成分測定結(jié)果表明，無柄靈芝子實體內(nèi)三萜含量較赤芝高[17]。此外，彭惺蓉[18]從無柄靈芝中分離獲得了18個化合物，主要為可能起到保肝作用的三萜類化合物。Ding等[19]對無柄靈芝三萜類化合物進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有試驗中作為標準品參照所用的8種靈芝酸。可見無柄靈芝內(nèi)三萜類化合物豐富，作為子實體推廣或保健品原材料進行開發(fā)利用，均具有很好的潛力。

供試甜靈芝子實體的三萜含量隨著培養(yǎng)時長的增加而不斷上升，但多糖含量隨著培養(yǎng)時長的增加而降低，這與林應(yīng)興[20]、付立忠[21]等對赤芝的研究結(jié)果相一致，說明此甜靈芝菌株與赤芝有相似的生長規(guī)律。相較而言，甜靈芝在三萜含量上較其他靈芝菌株（霍芝1號、韓芝、日芝）更具優(yōu)勢[22]，因此更適合用于提取三萜類成分。

在收粉40天后此甜靈芝菌株基本已達到了噴粉終點，且子實體較干燥，考慮到成本問題，甜靈芝的收粉時間建議以40 d～50 d為宜。此外，該甜靈芝菌株的噴粉時間較早；且相較于已被報道的其他靈芝菌株（龍芝二號、滬農(nóng)一號、南韓靈芝、美國大靈芝、中華紅芝等）[23-24]，此菌株孢子粉產(chǎn)量較大，收粉時間適宜；因此該甜靈芝也可以作為一個收粉的品種進行開發(fā)利用。

在目前關(guān)于無柄靈芝的研究中，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其味道偏甜的報道，此甜靈芝菌株可能為無柄靈芝里較為特殊的一個品種。無柄靈芝與赤芝的親緣關(guān)系十分接近，并具有相似的生長規(guī)律，且在三萜種類及含量上較赤芝有一定的優(yōu)勢。此外，此次供試菌株作為無柄靈芝中的一種，在孢子粉產(chǎn)量上也具有很好的表現(xiàn)，說明無柄靈芝也具有開發(fā)成產(chǎn)孢靈芝的潛能。雖然目前無柄靈芝已被廣泛栽培，但因未被列入《中國藥典》而導致其在加工利用中受到一定的限制，因此，推動該品種進入新食品原料名錄對更充分地利用無柄靈芝的優(yōu)勢、豐富靈芝栽培產(chǎn)業(yè)及靈芝保健品行業(yè)都具有重要的意義。