單環(huán)刺螠體腔液抑菌特性研究

甘宏濤，劉統(tǒng)昊，丁子媛，姚海洋，崔 楠，孟 霄，徐國成，曹黎鑫，許星鴻

( 江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005 )

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)俗稱海腸，為典型的濾食性海洋無脊椎動物，其體內(nèi)缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞，主要依賴由體表黏液—體壁—體腔液組成的非特異性免疫系統(tǒng)對抗入侵的病原體，其體腔液是抵御病原菌侵染的主要成分。國內(nèi)外關(guān)于單環(huán)刺螠的研究主要集中于繁殖發(fā)育[1-2]、人工育苗[3]、營養(yǎng)成分分析[4]、硫化物代謝[5]以及活性物質(zhì)[6-7]等方面。據(jù)夏玉秀等[8]報道，單環(huán)刺螠體表黏液對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等9種菌無明顯抑制作用。關(guān)于其體腔液抑菌特性迄今尚未見報道。

目前有關(guān)海洋無脊椎動物體液和血淋巴細(xì)胞抑菌特性的報道多集中于節(jié)肢動物、軟體動物和棘皮動物。Haug等[9]從蜘蛛蟹(Hyasaraneus)血細(xì)胞破碎液中提取到的活性物質(zhì)對大腸桿菌(Escherichiacoli)、前毛弧菌(Vibrioanguillarum)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)和金黃色葡萄球菌具有抑菌性，并對谷氨酸棒狀桿菌抑制效果最好；鎧甲蝦(Galatheastrigosa)和挪威龍蝦(Nephropsnorvegicus)的血淋巴細(xì)胞破碎液上清液對檸檬扁球菌(Planococcuscitreus)具有顯著抑制作用[10]；馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)的血液上清液對大腸桿菌和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)具有明顯抑制作用[11]。海膽Paracentrotuslividus的體腔液上清液和體腔細(xì)胞破碎液上清液對溶藻弧菌(V.alginolyticus)均具有抑菌活性[12]。然而，并非所有海洋無脊椎動物的體腔液或血液均具抑菌活性，有的甚至還能促進(jìn)某些細(xì)菌的生長[13]。

筆者以牛津杯法和生長曲線抑制法檢測單環(huán)刺螠的抑菌特性，并分析溫度、鹽度、饑餓和干露對其抑菌活性的影響，探討單環(huán)刺螠體腔液對病原菌侵染和環(huán)境脅迫下的免疫應(yīng)答，為單環(huán)刺螠的相關(guān)免疫學(xué)研究和健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗用單環(huán)刺螠購自連云港水產(chǎn)品市場，所選個體活力強(qiáng)且體表無損傷，體質(zhì)量(18.03±1.35) g，體長(9.08±1.25) cm。暫養(yǎng)條件為鹽度25，pH 8.0，水溫(20±1) ℃，連續(xù)充氣，日換水1次并投喂2次等比例混合的螺旋藻粉和海參開口餌料。

1.2 試驗菌種

試驗所用菌種為江蘇海洋大學(xué)海洋經(jīng)濟(jì)動物資源實驗室保存的菌種。包括6種革蘭氏陰性菌：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、大腸桿菌、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)、凡隆氏氣單胞菌(A.veronii)和哈維氏弧菌(V.harveyi)；2種革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌(M.lysodeikticus)。菌種活化后，接入LB液體培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃冷藏備用，使用前將菌液調(diào)整至600 nm波長下光密度[D(600 nm)]為1.0。

1.3 單環(huán)刺螠體腔液提取物的制備

取單環(huán)刺螠用海水沖洗體表，濾紙吸干，從吻處剪開獲取體腔液，混勻后，4 ℃，3000 r/min(離心半徑13.5 cm，下同)離心20 min，取上清液作為體腔液上清液，-40 ℃凍存；將離心所得血細(xì)胞沉淀用3 mL無菌生理鹽水重懸后，經(jīng)超聲波破碎儀(Biosafer650-92型)4 ℃破碎5 min，4 ℃，10 000 r/min離心30 min，取上清液作為體腔細(xì)胞破碎液上清液，-40 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌的抑制作用

1.4.1 牛津杯法

采用牛津杯法通過瓊脂徑向擴(kuò)散來檢測體腔液的直觀抑菌效果，具體操作：在超凈臺中，當(dāng)滅菌后的LB固體培養(yǎng)基冷卻至約40 ℃，以V(菌懸液)∶V(培養(yǎng)基)=1∶100的比例接入已知菌懸液，將其混勻倒至無菌培養(yǎng)皿中，凝固后將牛津杯輕輕按入培養(yǎng)基，不可觸底。用移液槍分別向杯孔中注入150 μL體腔液提取物或等量生理鹽水，28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈并拍照。試驗重復(fù)3次。

1.4.2 生長曲線抑制法

以生長曲線抑制法測定單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌生長的影響，具體測定方法參考文獻(xiàn)[14]。以生理鹽水+菌懸液為對照組，試驗重復(fù)3次。

1.5 環(huán)境因子對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[15-17]得知單環(huán)刺螠對溫度、鹽度和干露時間的耐受范圍分別為-4～35.77 ℃、13.8～35.9、0～72 h，分別設(shè)置試驗組。

1.5.1 不同鹽度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

鹽度試驗設(shè)置15、20、25、30、35共5個梯度，以曝氣自來水與海水晶調(diào)節(jié)至相應(yīng)鹽度。每組設(shè)3個平行，每個平行隨機(jī)選取10只單環(huán)刺螠，試驗期間其他條件均同暫養(yǎng)期間。處理48 h后解剖取體腔液，制備體腔細(xì)胞破碎液上清液(方法見1.3)。取1.5 mL體腔細(xì)胞破碎液上清液與0.5 mL菌懸液(凡隆氏氣單胞菌)混合，28 ℃孵育2 h，將混合液4 ℃，10 000 r/min離心30 min后，棄上清液，以300 μL無菌生理鹽水重懸后接種至30 mL LB液體培養(yǎng)基中，每隔1 h吸取3 mL菌液，用分光光度計測定波長600 nm下吸光度，共取樣6次。試驗重復(fù)3次。

1.5.2 不同溫度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

將溫度組設(shè)置A和B 2個組，每組設(shè)置5個溫度梯度：A組(4、8、12、16、20 ℃)、B組(22、26、30、34、38 ℃)。用生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)調(diào)至對應(yīng)溫度，每個梯度設(shè)3個平行，每個平行隨機(jī)選取10只單環(huán)刺螠。處理2 h后解剖取樣。樣品處理與測定方法同1.5.1。試驗重復(fù)3次。

1.5.3 干露對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

將干露脅迫時間設(shè)置為2、4、6、8、10 h共5個時間段。每組設(shè)3個平行，每個平行隨機(jī)選取10只單環(huán)刺螠。將單環(huán)刺螠放入底部鋪上少量海水的托盤，暴露于空氣中，處理相應(yīng)時間后解剖取樣。樣品處理與測定方法同1.5.1。以生理鹽水+菌懸液為對照組1，未干露組體腔細(xì)胞破碎液上清液+菌液為對照組2。試驗重復(fù)3次。

1.5.4 饑餓對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

饑餓脅迫試驗設(shè)置為1、2、3、4、5 d共5個梯度。脅迫期間除不投喂餌料外，其他條件同暫養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，每個平行隨機(jī)選取10只單環(huán)刺螠。處理相應(yīng)時間后解剖取樣。樣品處理方法同1.5.1。以生理鹽水+菌液為對照組1，未饑餓組體腔細(xì)胞破碎液上清液+菌液為對照組2。試驗重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 25.0進(jìn)行單因子方差分析、LSD多重比較和Duncan檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌的牛津杯試驗

牛津杯試驗結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠體腔液上清液對鰻弧菌可觀察到明顯的抑菌圈，體腔細(xì)胞破碎液上清液可對凡隆氏氣單胞菌、副溶血弧菌和鰻弧菌產(chǎn)生抑制作用，其抑菌圈大小依次為：鰻弧菌>副溶血弧菌>凡隆氏氣單胞菌(圖1)。體腔細(xì)胞破碎液上清液對鰻弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏氣單胞菌的抑菌活性極顯著高于體腔液上清液(P<0.01，n=3)(表1)。體腔液上清液和體腔細(xì)胞破碎液上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和溶壁微球菌等5種菌均未顯示出抑菌活性。

圖1 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌的牛津杯試驗

表1 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌的抑菌圈直徑(n=3)

2.2 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌生長的影響

生長曲線檢測結(jié)果顯示，與對照組(生理鹽水+菌液)相比，在8種受試細(xì)菌中，體腔液上清液對鰻弧菌和副溶血弧菌有顯著抑菌效果(P<0.05)，體腔細(xì)胞破碎液上清液對鰻弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏氣單胞菌具有顯著抑菌作用(P<0.05)(圖2)。

圖2 單環(huán)刺螠體腔液對8種細(xì)菌生長的影響

2.3 環(huán)境因子對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

2.3.1 不同鹽度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

鹽度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性影響顯著(圖3)。鹽度25組體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性最強(qiáng)，但與鹽度20和鹽度30兩組的抑菌活性差異不顯著。鹽度15和35兩組抑菌活性下降極顯著(P<0.01)，且鹽度15組的抑菌活性顯著低于鹽度35組(P<0.05)，表明低鹽脅迫對體腔液抑菌活性影響更大。

圖3 鹽度對單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性的影響

2.3.2 不同溫度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

當(dāng)溫度處于12～26 ℃時，單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性較強(qiáng)，且組間差異不顯著(圖4)。8 ℃試驗組抑菌效果顯著降低(P<0.05)；4 ℃試驗組抑菌活性下降極顯著(P<0.01)。30 ℃試驗組抑菌活性顯著下降(P<0.05)；當(dāng)溫度≥34 ℃，抑菌活性下降極顯著(P<0.01)，并且個體開始出現(xiàn)死亡。

圖4 溫度對單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性的影響

2.3.3 干露脅迫對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

單環(huán)刺螠干露脅迫6 h以內(nèi)，試驗樣品無異常表現(xiàn)，其體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性無顯著性變化；干露時間8 h和10 h兩組的試驗樣品體表黏液分泌增多、體壁收縮加劇，但并未出現(xiàn)個體死亡現(xiàn)象，其體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性顯著下降(P<0.05)(圖5)。

圖5 干露脅迫對單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性的影響

2.3.4 饑餓脅迫對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

隨著饑餓時間延長，單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性逐漸下降(圖6)。饑餓1 d，抑菌活性有所降低但與對照組差異不顯著；饑餓2～4 d，抑菌活性極顯著下降(P<0.01)；饑餓5 d，體腔細(xì)胞破碎液上清液幾乎沒有抑菌活性，但處理期間未出現(xiàn)個體死亡。

圖6 饑餓脅迫對單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液抑菌活性的影響

3 討 論

3.1 單環(huán)刺螠體腔液不同組分的抑菌活性

在海洋無脊椎動物中，節(jié)肢動物門、軟體動物門和棘皮動物門的類群具有重要經(jīng)濟(jì)意義，其相關(guān)免疫機(jī)制以及抑菌特性的報道亦較多。在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[18]、鎧甲蝦[10]、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[19]和馬氏珠母貝[11]的血淋巴細(xì)胞破碎液上清液中發(fā)現(xiàn)顯著的抑菌特性，但其體腔液上清液的抑菌作用較弱；Tsvetnenko等[20]發(fā)現(xiàn)，天鵝龍蝦(Panuliruscygnus)血淋巴中具有抑菌能力，其抑菌活性定位于血細(xì)胞中，血淋巴上清液的抑菌能力有限。本試驗中，以嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、凡隆氏氣單胞菌、哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌等8種菌為受試菌，檢測出單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液對鰻弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏氣單胞菌具有明顯抑菌作用，體腔液上清液對鰻弧菌和副溶血弧菌有顯著抑菌效果，且體腔細(xì)胞破碎液上清液對鰻弧菌的抑菌圈顯著大于體腔液上清液，表明體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性大于體腔液上清液，與上述研究結(jié)果相一致。

叢聰?shù)萚14]發(fā)現(xiàn)，仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔液上清液對溶壁微球菌具有抑制作用，而體腔細(xì)胞破碎液上清液對哈維氏弧菌等8種細(xì)菌均不具備抑菌能力，表明抑菌活性因種類而異。并非所有海洋無脊椎動物的體腔液或血液都具有抑菌作用，如Alabi等[13]發(fā)現(xiàn)，幼生期凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的血細(xì)胞破碎液上清液能顯著促進(jìn)大腸桿菌的生長。不同的抑菌因子和不同種類的細(xì)菌侵染會導(dǎo)致海洋無脊椎動物抑菌能力產(chǎn)生差異。

譚建[21]在仿刺參腸道中提取到一類由小分子多肽組成的抑菌成分，對副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、大腸桿菌、鰻弧菌、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)、哈維氏弧菌均具有顯著的抑菌效果；趙歡等[22]在單環(huán)刺螠腸道和體腔液混合源中獲得一類小分子多肽，發(fā)現(xiàn)可在體外顯著提高小鼠的非特異性免疫活性。本試驗中，單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液較體腔液上清液表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌能力，針對其生存環(huán)境較惡劣，卻極少患病，結(jié)合本試驗中單環(huán)刺螠體腔液抑菌結(jié)果，推測其體內(nèi)具有一套穩(wěn)定的抑菌機(jī)制，并且抑菌因子可能為多肽類，且主要存在于體腔細(xì)胞中。

3.2 鹽度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

鹽度變化直接影響水生無脊椎動物血細(xì)胞密度和相關(guān)免疫指標(biāo)[23]。Zhao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦在低鹽度脅迫下，其免疫應(yīng)答會受到抑制；Joseph等[25]發(fā)現(xiàn)，低鹽度(<15)和高鹽度(>35)脅迫可引起斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)血淋巴代謝和免疫指標(biāo)的改變，低鹽脅迫下降趨勢更明顯。本試驗中，單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性在鹽度25達(dá)到最強(qiáng)，鹽度20和鹽度30兩組次之，鹽度15和鹽度35兩組的抑菌活性顯著下降，以低鹽脅迫影響更加顯著，與前者研究結(jié)果一致。

朱曉瑩等[26-27]研究了鹽度對單環(huán)刺螠體腔液免疫指標(biāo)的影響，鹽度15和35下血細(xì)胞密度減小和免疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境影響更為顯著，與本試驗抑菌活性結(jié)果類似。目前，已有不少學(xué)者[2,16-17,28]對單環(huán)刺螠鹽度的耐受性展開了研究，其耐受鹽度為13.8～35.9，適宜生長鹽度為25～30。由此可見，在單環(huán)刺螠人工養(yǎng)殖過程中，要重視水體鹽度的變化，尤其是暴雨導(dǎo)致水體鹽度驟降，需及時調(diào)整，以保證其各項生理功能和免疫應(yīng)答的穩(wěn)定性，減少疾病暴發(fā)。

3.3 溫度對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

單環(huán)刺螠屬于變溫動物，其體腔液的免疫指標(biāo)及生理功能會直接受養(yǎng)殖水體溫度的影響。本試驗結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性對溫度變化較為敏感，當(dāng)溫度為12～26 ℃時，體腔液抑菌活性保持較高水平，但溫度低于12 ℃或超過26 ℃后，體腔液抑菌活性均顯著下降。在已報道的黑唇鮑(Haliotisrubra)[29]、紫貽貝[30]和中華鱉(Trionyxsinensis)[31]中，溫度驟變對其血液或體腔液的抑菌活性具有顯著影響。李諾等[15]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)養(yǎng)殖水體溫度超過32.5 ℃，單環(huán)刺螠成體開始出現(xiàn)死亡；可見溫度不適宜不僅會對抑菌能力產(chǎn)生影響，其存活率也大大降低。因此在單環(huán)刺螠人工養(yǎng)殖中，要關(guān)注水溫的變化，以控溫設(shè)施或調(diào)節(jié)水體深度來保證適宜的水溫條件。

3.4 干露脅迫對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

單環(huán)刺螠主要分布于我國黃渤海，在銷售過程中需要進(jìn)行運輸。夏玉秀等[8,15]分別就單環(huán)刺螠在干露脅迫下的成體存活率以及體表黏液組成及抑菌特性的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)短時間的干露脅迫對以上方面并無顯著影響。本試驗中，當(dāng)干露脅迫超過8 h，單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性才會發(fā)生明顯變化，亦表明單環(huán)刺螠具有較強(qiáng)的耐干露特性，因此短時間的無水無沙運輸方式是可行的。

3.5 饑餓脅迫對單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性的影響

在自然環(huán)境或長途運輸中，單環(huán)刺螠可能會面臨饑餓脅迫。本試驗結(jié)果顯示，饑餓2～4 d的單環(huán)刺螠體腔液抑菌活性即出現(xiàn)極顯著下降，饑餓5 d后雖然仍然存活但體腔液已幾乎沒有抑菌活性。九孔鮑(H.diversicolor)在饑餓脅迫后其血液上清液對副溶血弧菌的抑菌能力顯著下降[32]；蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、凡納濱對蝦和仿刺參經(jīng)饑餓脅迫后，其相關(guān)免疫指標(biāo)和生理功能均已發(fā)生顯著變化[33-34]。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖模式多以大規(guī)模高密度養(yǎng)殖為主，因此養(yǎng)殖密度過大或投餌不足，都會對養(yǎng)殖個體的免疫力有明顯影響，使其抗病能力顯著降低[35]。單環(huán)刺螠人工養(yǎng)殖尚處于初步探究階段，養(yǎng)殖密度和投餌量還沒有標(biāo)準(zhǔn)模式可以參考，有待于結(jié)合養(yǎng)殖中的機(jī)體免疫機(jī)能變化進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞破碎液上清液的抑菌活性強(qiáng)于體腔液上清液，對鰻弧菌、副溶血弧菌和凡隆氏氣單胞菌具有顯著抑制作用。在鹽度20～30，溫度12～26 ℃條件下，抑菌活性較強(qiáng)。低鹽脅迫比高鹽脅迫對抑菌活性影響更大。干露時間超過8 h或饑餓時間超過2 d，體腔液抑菌活性顯著降低。