正交試驗在建立碰碰香組織培養(yǎng)快繁體系中的應用

向 丹，張緣源，喻 娜，趙 靜

（廣安職業(yè)技術(shù)學院，四川廣安 638000）

碰碰香目前采用傳統(tǒng)的扦插方式進行繁殖[4]，該方法繁殖速度慢，易發(fā)生變異，不利于保持碰碰香的優(yōu)良性狀?，F(xiàn)代生物學技術(shù)中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)具備繁殖速度快、保存親本的優(yōu)良性狀的特點。然而，目前關(guān)于碰碰香組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究很少。因此，本研究通過正交試驗法對碰碰香的組織培養(yǎng)體系建立進行了研究，探討不定芽誘導、組培苗生根培養(yǎng)的最適條件，為建立完善的碰碰香組織培養(yǎng)快速繁殖體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取野外自然生長健壯植株的幼嫩莖段作為外植體，去除葉片后，用洗衣粉洗凈莖段表面，在自來水下流水沖洗30min，吸水紙吸干莖段表面水分，用0.1%的HgCl2水溶液消毒5min，無菌水沖洗5 次，將莖段切成1.5cm 左右的長度，置于超凈臺盛有無菌水的無菌瓶中備用。

1.2 方法

1.2.1 不定芽誘導培養(yǎng)。采用L9（34）正交設(shè)計探究不同培養(yǎng)基種類、6-BA、2,4-D對碰碰香不定芽誘導的影響（見表1），每瓶接種外植體4 個，每種處理接種20 瓶，重復3 次。30d 后觀察不定芽誘導情況，統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，計算誘導率。

表1 不定芽誘導培養(yǎng)正交試驗L9（34）因素和水平

1.2.2 組培苗生根培養(yǎng)。采用L9（34）正交設(shè)計探究不同培養(yǎng)基種類、NAA、活性炭對組培苗生根的影響（見表2），每瓶接種組培苗4 個，每個處理接種20 瓶，重復3次。30d 后觀察組培苗生根情況，統(tǒng)計生根苗數(shù)，計算生根率。

表2 組培苗生根培養(yǎng)正交試驗L9（34）因素和水平

1.3 培養(yǎng)條件

以1/2MS、MS、WPM 為基本培養(yǎng)基，均添加瓊脂6g/L，蔗糖30g/L，pH 調(diào)至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋設(shè)置121℃、131kPa 滅菌20min。接種后的培養(yǎng)瓶置于組培室內(nèi)，設(shè)置培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強度2500Lx，光照時間12h/d。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)在Excel 軟件上進行初處理后，用SPSS26.0 軟件進行分析。

不定芽誘導率（%）=誘導出芽的外植體數(shù)目/接種的外植體數(shù)目×100

組培苗生根率（%）=生根的組培苗數(shù)目/接種的組培苗數(shù)目×100

2 結(jié)果與分析

2.1 碰碰香不定芽誘導培養(yǎng)基組合的篩選

由表3 可知，以MS 作為培養(yǎng)基進行碰碰香不定芽誘導的效果最好，誘導效果依次為MS＞1/2MS＞W(wǎng)PM，3 種培養(yǎng)基作用存在極顯著差異（p＜0.01）。6-BA 濃度對碰碰香不定芽誘導的影響作用表現(xiàn)為1.0mg/L 6-BA＞1.5mg/L 6-BA＞0.5mg/L 6-BA，不同濃度間存在極顯著差異（p＜0.01），以6-BA 1.0mg/L 最宜，濃度過高會抑制不定芽的誘導。2,4-D 濃度對碰碰香不定芽誘導率的影響效果表現(xiàn)為0.3 mg/L 2,4-D＞0.1mg/L 2,4-D＞0.2mg/L 2,4-D，以0.3mg/L 為最佳，不同濃度存在顯著差異（p＜0.05）。

由表3 極差分析可知，培養(yǎng)基種類、6-BA 濃度、2,4-D濃度3 個因素的極差值大小為A＞B＞C，表明培養(yǎng)基種類是對不定芽誘導影響最大的因素，2,4-D濃度是對不定芽誘導的影響最小的因素，與方差分析的結(jié)果一致（表4），即碰碰香不定芽誘導率影響的作用依次為培養(yǎng)基種類＞6-BA 濃度＞2,4-D濃度。其中，A、B 因素在第2 水平對應的k 值均大于第1、3 水平的k 值，C 因素在第3 水平對應的k 值大于第1、2 水平的k 值，故碰碰香不定芽誘導培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B2C3，即MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D。

表3 不同因素對碰碰香不定芽誘導影響的極差分析

表4 不同因素對碰碰香不定芽誘導影響的方差分析

為驗證正交試驗結(jié)果，配制最優(yōu)組合培養(yǎng)基A2B2C3開展驗證試驗，接種20 瓶，碰碰香不定芽誘導率為92.5%，高于正交試驗中的9 種培養(yǎng)基組合的誘導率，說明正交試驗結(jié)果較好，碰碰香不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D。

2.2 碰碰香組培苗生根培養(yǎng)基組合的篩選

由表5 可知，生根影響效果依次為1/2MS＞MS＞W(wǎng)PM，3 種培養(yǎng)基作用存在極顯著差異（p＜0.01），以1/2MS 作為培養(yǎng)基進行碰碰香組培苗生根的效果最好。NAA 濃度對碰碰香組培苗生根影響作用表現(xiàn)為1.5mg/L NAA ＞1.0mg/L NAA ＞0.5mg/L NAA，以1.5mg/L 最佳?；钚蕴繉ε雠鱿闵实挠绊懶Ч憩F(xiàn)為3.0g/L 活性炭＞1.0g/L 活性炭＞5.0g/L 活性炭，以3g/L 最佳。

由表5 極差分析可知，培養(yǎng)基種類、NAA 濃度、活性炭濃度3 個因素的極差值大小為A＞B＞C，表明培養(yǎng)基種類是對碰碰香組培苗生根影響最大的因素，活性炭濃度是對組培苗生根影響最小的因素，與方差分析結(jié)果一致（表6），即碰碰香生根率影響的效果依次為培養(yǎng)基種類＞NAA 濃度＞活性炭濃度。A 因素在第1 水平對應的k 值大于第2、3 水平的k 值，B 因素在第3 水平對應的k 值大于第1、2 水平的k 值，C 因素在第2 水平對應的k 值大于第1、3 水平的k 值，故碰碰香組培苗生根培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A1B3C2，即1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭。

表5 不同因素對碰碰香組培苗生根影響的極差分析

表6 不同因素對碰碰香組培苗生根影響的方差分析

為驗證A1B3C2為最優(yōu)生根培養(yǎng)基組合，配制20瓶生根培養(yǎng)基開展驗證試驗，碰碰香組培苗的生根率高達98.8%，高于正交試驗中的9 種培養(yǎng)基組合的生根率，說明正交試驗結(jié)果較好，碰碰香組培苗生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭。

3 結(jié)論與討論

正交設(shè)計試驗是建立植物組織培養(yǎng)快速繁殖體系的常見方法，可從多個因素和水平中選出代表性強的試驗方案，通過統(tǒng)計分析，篩選出最優(yōu)試驗方案，省時省力?；谡辉囼炘O(shè)計，通過極差分析和方差分析，對碰碰香組織培養(yǎng)體系中的不定芽誘導、組培苗生根的主要影響因素進行比較，篩選出碰碰香組織培養(yǎng)體系過程的適宜培養(yǎng)條件。影響碰碰香不定芽誘導率的主要因素有培養(yǎng)基種類、6-BA 濃度、2,4-D濃度，經(jīng)過試驗分析，篩選出不定芽誘導的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L 2,4-D，在此培養(yǎng)條件下，不定芽萌發(fā)速度快，存活率高，葉片舒展較快，植株長勢良好。對碰碰香組培苗生根的主要影響因素有培養(yǎng)基種類、NAA 濃度、活性炭濃度，經(jīng)過統(tǒng)計分析，篩選出碰碰香組培苗生根最優(yōu)培養(yǎng)基組合為1/2MS+1.5mg/L NAA+3.0g/L 活性炭，在此培養(yǎng)條件下，組培苗生根速度快，根系粗壯，葉色鮮綠，植株長勢良好。

現(xiàn)有對碰碰香的組織培養(yǎng)研究很少，不定芽誘導最優(yōu)培養(yǎng)基組合結(jié)果與張娜[5]的研究中的MS 培養(yǎng)基、1.0 mg/L 6-BA 結(jié)果一致。這可能是因為MS 培養(yǎng)基相對于1/2MS 和WPM 培養(yǎng)基的無機鹽含量高，更利于不定芽的萌發(fā)和生長。同時，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中需加入適當濃度的植物生長激素如6-BA、2,4-D才有利于組培苗的生長和發(fā)育，激素在一定濃度范圍內(nèi)有利于不定芽的誘導，超過一定濃度后會抑制不定芽的誘導。

組培苗生根最優(yōu)培養(yǎng)基組合結(jié)果與張娜[5]的研究中的1/2MS 培養(yǎng)基結(jié)果一致，可能是因為1/2MS 培養(yǎng)基中含較低濃度的無機鹽，更有利于組培苗根系的生長。褐化是植物組織培養(yǎng)中的常見問題，所以在碰碰香的生根培養(yǎng)基中除了添加生長素以外，還加入了活性炭，因為一定濃度的活性炭可以抑制褐化作用[6]，但試驗結(jié)果的抑制效果不明顯，可能是由于活性炭在吸附有毒物質(zhì)抑制褐化的同時，也會吸附營養(yǎng)物質(zhì)，不利于組培苗的生長[7]，這一因素的影響還需進一步的研究。本試驗研究的最適培養(yǎng)基組合在激素濃度方面與已有的研究報道[1]存在一定的差異，這可能與碰碰香植株的來源不同、基因型存在差異、植株體所處的發(fā)育狀態(tài)不一致等有關(guān)。