基于3D體外培養(yǎng)模型的化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測研究進展

閆路，茍瀟，彭穎，高瑞澤，田明明，張效偉,3,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 流域環(huán)境生態(tài)工程研發(fā)中心，北京師范大學(xué)自然科學(xué)高等研究院，珠海 519087 3. 江蘇省生態(tài)環(huán)境保護化學(xué)品安全與健康風(fēng)險研究重點實驗室，南京 210023

化學(xué)物質(zhì)引起的人體肝臟疾病不容忽視。肝臟在保護機體免受有毒有害化學(xué)物質(zhì)侵害方面發(fā)揮著重要作用，它能夠?qū)⒂H脂性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為更多的水溶性代謝物，并通過尿液有效地從體內(nèi)排出[1]。然而，一些化學(xué)物質(zhì)仍然會引起以炎癥、氧化應(yīng)激和壞死為特征的肝臟損害[2]。據(jù)統(tǒng)計，超過50%以上的肝臟損害臨床案例是由于藥物引起的，并且研究發(fā)現(xiàn)，在過去的20年里，導(dǎo)致肝臟損害的化學(xué)物質(zhì)還包括工業(yè)化學(xué)品、生物殺蟲劑、化妝品成分、食品添加劑和膳食補充劑等多類型化學(xué)物質(zhì)[3]。如今，全球每年新增化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量超過1 000種[4]，這些化學(xué)物質(zhì)在生產(chǎn)和使用過程中可能會產(chǎn)生環(huán)境污染，從而對生活在這樣環(huán)境中的人群的健康，特別是肝臟，產(chǎn)生不良的影響。為了保護人體健康免受某些環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的危害，利用肝毒性測試模型開展環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測和評估是識別健康危害的重要方面之一。

化學(xué)物質(zhì)肝毒性測試方法包括傳統(tǒng)的動物模型(以嚙齒類為代表)和體外細胞模型。動物模型可以從組織以及個體水平上反映對環(huán)境化學(xué)物質(zhì)暴露的生物效應(yīng)，但是在面對大量待測環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的挑戰(zhàn)以及物種間差異問題時存在一定的局限性。2007年由美國國家研究委員會提出的“21世紀毒理學(xué)測試遠景與策略”強調(diào)未來毒性測試方法的重心將從整體動物的系統(tǒng)測試轉(zhuǎn)向基于毒性通路和毒性作用機制的體外測試，因此，以人源細胞系或者細胞成分為主的體外測試模型在評估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的人體肝毒性方面發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。經(jīng)典的二維(2D)單層培養(yǎng)系統(tǒng)因為操作簡單而被廣泛用于化學(xué)物質(zhì)高通量毒性測試，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在2D單層培養(yǎng)中，維持細胞生理表型所需的生化反應(yīng)和細胞間的相互作用會隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸消失，尤其是在肝細胞中發(fā)揮重要作用的各種代謝或轉(zhuǎn)運酶的表達量會降低[5]；并且在此培養(yǎng)模型下得到的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性評估無法很好地反映生物體內(nèi)長期重復(fù)劑量暴露下的真實毒性效應(yīng)[6]。因此，為了提高基于體外預(yù)測模型的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測準確性，建立能夠模擬體內(nèi)環(huán)境的體外測試模型是非常重要的。

三維(3D)體外細胞培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性測試方面，為更真實地反映環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)人體肝毒性效應(yīng)及揭示致毒機制提供了新的測試平臺。3D體外細胞培養(yǎng)不同于傳統(tǒng)的2D單層貼壁細胞培養(yǎng)方式，細胞在表面黏附能力極低或含有細胞基質(zhì)的支架中培養(yǎng)，并利用天然的細胞間相互作用來驅(qū)動3D結(jié)構(gòu)的形成，這使得即使肝細胞在體外經(jīng)歷長時間(例如28 d)培養(yǎng)，其功能也能得到較完整的保留，并且細胞也能以類似活體組織的微組織形態(tài)存在[7]。3D體外細胞培養(yǎng)起初是用于藥物毒性測試和篩選，隨著研究的深入，藥物肝毒性預(yù)測準確率不斷提高[8]。目前隨著社會對環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性的關(guān)注越來越密切，3D體外細胞培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測方面的應(yīng)用也在不斷增加[9]。但是，大部分現(xiàn)有的研究依然是從細胞毒性或者基因表達等細胞和分子層面評估環(huán)境化學(xué)物的肝毒性，如何充分發(fā)揮3D體外細胞培養(yǎng)模型的優(yōu)勢，為環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性研究提供系統(tǒng)的毒性機制信息是未來研究的挑戰(zhàn)。與此同時，有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架很好地總結(jié)了驅(qū)動毒性發(fā)生的致毒機制，整合了從分子、細胞、器官乃至個體、種群水平的各個毒性事件[10]。毒性事件按發(fā)生的時間順序可以分為分子起始事件(molecular initiating event, MIE)，關(guān)鍵事件(key events, KEs)和有害結(jié)局(adverse outcomes, AOs)[10]?？蚣芑亩拘詸C制為體外測試方法的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[11]。創(chuàng)立于2014年的AOP-wiki數(shù)據(jù)庫(https://aopwiki.org/)目前(截至2021年8月31日)有22條與肝毒性相關(guān)的AOPs，涉及的肝毒性終點包括肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積以及肝細胞損傷。驅(qū)動肝毒性發(fā)生的致毒機制總結(jié)為3D體外肝細胞培養(yǎng)方法的建立以及測試應(yīng)用提供了機制參考信息。本文綜述了目前常用3D體外細胞培養(yǎng)模型的制備方法，以及在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)(納米材料、持久性有機污染物和新型有機污染物等)肝毒性預(yù)測方面的應(yīng)用，最后探討了3D肝細胞體外培養(yǎng)模型在AOP指導(dǎo)下開展肝毒性預(yù)測的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景，包括如何確定細胞培養(yǎng)體系和整合毒性測試信息、如何提高環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測的效率以及準確性等。

1 3D體外培養(yǎng)模型的制備方法(Methods of 3D in vitro culture models)

依據(jù)制備方法，3D肝細胞體外培養(yǎng)模型可以分為夾層培養(yǎng)法、靜態(tài)球形模型、生物反應(yīng)器、器官芯片和3D生物打印(表1)。

1.1 夾層培養(yǎng)法

肝細胞夾層培養(yǎng)法被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)通過膽汁淤積誘導(dǎo)的肝毒性研究中。它的培養(yǎng)方式是在2層細胞外基質(zhì)之間培養(yǎng)肝細胞(圖1(a))。通常用到的細胞外基質(zhì)是凝膠的膠原蛋白或Matrigel(一種細胞外基質(zhì)的混合物，其中包含層連蛋白和多種生長因子)；細胞外基質(zhì)的構(gòu)成影響著細胞的排列和功能，夾層培養(yǎng)中的底層基質(zhì)先于細胞放置于培養(yǎng)板中，故基質(zhì)種類和成分的不同會影響底層基質(zhì)的硬度以及粘連蛋白的數(shù)量從而影響后續(xù)接種細胞形態(tài)和多細胞排列；覆蓋層基質(zhì)放入后，細胞會處于上下覆蓋的立體空間中，這樣的環(huán)境有利于維持細胞的活力，并能誘導(dǎo)細胞分化，影響膽汁的分泌和排泄行為[12, 17]。肝細胞在夾層培養(yǎng)中保存了肝細胞極性，以及膽管功能的形成。這種3D肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于評估化學(xué)物質(zhì)對肝膽運輸?shù)挠绊懸约盎瘜W(xué)物質(zhì)引起由膽汁酸介導(dǎo)的肝臟毒性(膽汁淤積)[17]。Chatterjee等[18]利用夾層培養(yǎng)法分別構(gòu)建了基于人源肝細胞和大鼠源肝細胞的化學(xué)物質(zhì)膽汁淤積評估模型，通過比較不同模型下得到的化學(xué)物質(zhì)膽汁淤積指數(shù)，該研究發(fā)現(xiàn)人源肝細胞模型中獲得的膽汁淤積指數(shù)與報道的臨床藥物膽汁淤積發(fā)生率相關(guān)。同時，另一則研究利用該培養(yǎng)方式對344個藥物的肝毒性進行測試，并實現(xiàn)了50%～60%的真陽性預(yù)測準確率[19]。然而，夾層培養(yǎng)法的主要局限性是在長期培養(yǎng)中存在滲漏、膽管損傷和膽汁淤積的現(xiàn)象，因此夾層培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件還需要改善，以便增加體外模擬肝膽排泄過程所需的膽管系統(tǒng)的穩(wěn)定性[20]。

1.2 靜態(tài)球形模型

球形模型是指那些使細胞聚集為細胞球狀體的細胞培養(yǎng)體系，其中懸滴培養(yǎng)法和微模法是2種比較常用的靜態(tài)球形模型，因為操作簡單而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)肝毒性評估以及機制研究中(圖1(b))。HepG2(人肝癌細胞)球狀體和HepaRG(末分化的人肝癌細胞)球狀體是2種在靜態(tài)球形模型下容易獲取的肝細胞球狀體。HepG2球狀體相比于常規(guī)的2D培養(yǎng)方式下的HepG2具有較好的糖原儲存和代謝能力，且白蛋白、尿素、異源物質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子、Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達量增多[13]。分化狀態(tài)下的HepaRG細胞的酶活性以及轉(zhuǎn)錄組表達情況與原代人肝細胞相似，它被認為是原代人源肝細胞的替代細胞系[21]。但是在2D單層培養(yǎng)下，HepaRG的部分細胞色素酶、Ⅱ相酶以及轉(zhuǎn)運蛋白表達量與原代人源細胞相比顯著下降[22]。HepaRG球狀體可培養(yǎng)長達4周且在培養(yǎng)過程中外源代謝能力一直保持著與原代人肝細胞相似的水平[23]。研究表明HepG2和HepaRG球狀體有著不同的應(yīng)用場景，HepG2球狀體在識別化學(xué)物質(zhì)引起的細胞毒性方面有著更高的敏感性，而HepaRG球狀體在分子水平識別特異毒性方面有著更好的能力[24-25]。

圖1 3D體外培養(yǎng)模型制備方法Fig. 1 Methods of 3D in vitro culture models

表1 3D體外培養(yǎng)模型的制備方法Table 1 Methods of 3D in vitro culture models

3D培養(yǎng)方法3D generation methods肝細胞類型Hepatocytes 培養(yǎng)時間Culture times高通量能力High-throughput支架Scaffold模型特點Comments參考文獻References3D生物打印3D Bioprinting原代肝細胞(人、大鼠、小鼠)、HepG2、Hep-aRG、干細胞、肝細胞與非實質(zhì)細胞共培養(yǎng)Primary hepatocytes (hu-man/rat/mouse), HepG2, HepaRG, stem cells, co-culture with NPCs>2周>2 weeks☆合成聚合物Synthetic polymers按照預(yù)先設(shè)定的程序,生物材料能夠被精準放置,制備出復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)Based on a predetermined proce-dure, biological materials can be precisely placed to generate com-plex biological structures[16]

肝非實質(zhì)細胞在肝毒性產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用，因此由肝細胞和肝星狀細胞、Kupffer細胞、竇狀內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)的多細胞球形模型提高了預(yù)測化學(xué)物質(zhì)肝毒性的能力。其中，肝細胞與肝星狀細胞共培養(yǎng)比較常見，而組成相對復(fù)雜的肝細胞、肝星狀細胞與Kupffer細胞的三元共培養(yǎng)系統(tǒng)則可更全面、高效地評估化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝纖維化的機制及能力[26]。Prestigiacomo等[27]利用GravityPLUSTMHanging Drop系統(tǒng)構(gòu)建了一個由HepaRG、肝星狀細胞以及巨噬細胞混合培養(yǎng)的3D肝微組織模型，并證實該模型可以在體外再現(xiàn)導(dǎo)致肝臟纖維化的分子與細胞水平的關(guān)鍵生物事件，如肝細胞損傷、抗氧化反應(yīng)、Kupffer細胞激活、肝星狀細胞激活以及細胞外基質(zhì)沉積。盡管靜態(tài)球狀模型在高通量化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測方面有著較好的應(yīng)用前景，但是目前的研究往往缺乏統(tǒng)一的測試基準來標準化測試結(jié)果，因此限制了其在大規(guī)?；瘜W(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測方面的應(yīng)用。

1.3 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器因培養(yǎng)條件可控的特點為體外細胞培養(yǎng)提供了良好的生長環(huán)境，被用于化學(xué)物質(zhì)肝毒性研究。生物反應(yīng)器是一個通過灌注或者攪拌的方式使肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)處于一個流動狀態(tài)的裝置(圖1(c))，該裝置將血流動力學(xué)和剪切應(yīng)力對肝臟功能的影響考慮到了模型制備中，目的是為了生成更貼近體內(nèi)肝臟復(fù)雜形態(tài)的模型，特別是彌補了嚴重肝損傷時肝臟功能下降的不足[28]。流動的生物反應(yīng)器可以提升模型的去毒能力同時保存生物合成和生物轉(zhuǎn)化的功能。最早報道的生物反應(yīng)器是一個體積為800 mL的3D灌注多室中空纖維膜生物反應(yīng)器[29]，它由3個獨立的毛細管系統(tǒng)組成，分別用于動靜脈介質(zhì)灌注、氧氣供應(yīng)和二氧化碳清除，當(dāng)反應(yīng)器中接種肝臟實質(zhì)和非實質(zhì)細胞后，這些細胞在培養(yǎng)過程中自我組裝成組織樣結(jié)構(gòu)。之后，該裝置被縮小到2 mL的體積，使用的細胞量也減少至1.2×108個，適用于臨床藥物測試。在該裝置內(nèi)，細胞色素酶P450可保持活性長達23 d，肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞的生理結(jié)構(gòu)也能被觀察到，管狀轉(zhuǎn)運體蛋白MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2)、P-gp (P-glycoprotein)和BCRP (breast cancer resistance protein)等外排型轉(zhuǎn)運蛋白分布特征也與人體肝臟組織中的分布特征相似。此外，研究發(fā)現(xiàn)HepaRG細胞和原代人肝細胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中表現(xiàn)出相似的細胞色素酶P450和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性[30]。生物反應(yīng)器還可以密切監(jiān)視整個反應(yīng)介質(zhì)中氧氣、乳酸含量以及任何可通過近紅外技術(shù)測量的參數(shù)；同樣的，細胞的狀態(tài)也可以通過觀察細胞內(nèi)熒光蛋白的含量得到反映[31]。總的來說，生物反應(yīng)器裝置在模擬肝臟的功能和表型方面表現(xiàn)優(yōu)異，但實際使用過程中由于所需細胞量巨大而不適用于高通量的毒性測試。

1.4 器官芯片

器官芯片為研究化學(xué)物質(zhì)肝毒性提供了一種復(fù)雜度更高、仿真效果更好的體外模擬人體肝臟器官的方式[32-33]。模型利用微流控技術(shù)將不同類型細胞在同一個系統(tǒng)的分隔室內(nèi)共同培養(yǎng)，通過產(chǎn)生流體剪切力、機械應(yīng)力和生化濃度梯度等理化刺激使細胞發(fā)生自組裝，從而在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出更加真實的生理學(xué)功能[33]。肝臟芯片技術(shù)為研究藥物代謝和化學(xué)物質(zhì)毒性測試提供了一個更加接近于人體真實暴露環(huán)境的裝置，且肝臟芯片已逐漸被商業(yè)化使用[34]。例如，Organovo公司生產(chǎn)了一種由原代肝細胞和非血小板細胞組成的肝臟微組織芯片ExViveTM[35]。Rennert等[36]使用雙通道微流控技術(shù)創(chuàng)建了一個由多孔膜(模擬肝淋巴間隙)分隔的3D肝臟模型，該模型整合了由內(nèi)皮細胞和組織巨噬細胞組成的血管層以及由肝星狀細胞與HepaRG細胞共同培養(yǎng)的肝臟層，增強了肝細胞的極性，并允許觀察肝膽功能。同時，器官芯片還可以通過連接腸道上皮細胞和肝臟細胞形成肝-腸多器官芯片，進一步增加器官芯片的復(fù)雜性[37](圖1(d))，這樣的模型可用于研究化學(xué)物質(zhì)的代謝途徑以及在器官水平上評估化學(xué)物質(zhì)的毒性效應(yīng)。Choe等[15]開發(fā)了一種由腸道上皮細胞(Caco-2)和肝細胞(HepG2)2個單獨層組成的微流體腸道肝芯片，2種細胞的細胞色素酶P450代謝活性在該培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著增強，且Caco-2細胞的吸附特性也因流動而改變，在評估藥物代謝特征方面比單一細胞培養(yǎng)更接近人體報告數(shù)據(jù)?？傊纹鞴傩酒峁┝艘粋€更加接近于人體肝臟器官的體外培養(yǎng)模型，有利于準確掌握化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝毒性的致毒機制及毒代動力學(xué)過程，但是大部分的肝臟器官芯片測試還需要得到進一步的驗證，且芯片的高成本阻礙了其應(yīng)用。

1.5 3D生物打印

3D生物打印利用編程技術(shù)可以實現(xiàn)對肝細胞以及細胞外基質(zhì)的精準組裝，被逐漸應(yīng)用于預(yù)測化學(xué)物質(zhì)肝毒性以及毒性機制研究中。這項技術(shù)使用含有細胞的生物材料作為生物打印墨水，在預(yù)設(shè)的計算機程序下，逐層精確定位墨水的空間位置，從而打印出具有生物活性的立體細胞組織構(gòu)架(圖1(e))。3D生物打印的方法策略包括3個方面：(1)仿生學(xué)，即對組織或器官的細胞和細胞外成分進行體外復(fù)制，復(fù)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的同時也要保證功能的實現(xiàn)；(2)自組裝，即利用胚胎作為生物組織復(fù)制的原材料，并通過操縱培養(yǎng)系統(tǒng)的參數(shù)來驅(qū)動3D生物打印組織中的胚胎生長；(3)微型組織、器官，即利用仿生學(xué)和自組裝策略的結(jié)合，將自我組裝的細胞集團，再次組裝成為功能性的宏觀組織[38]。目前3D生物打印主要有3種打印方式：激光輔助生物打印[39]、液滴噴射生物打印[40]和擠壓成型生物打印[41]。通過這些技術(shù)，3D生物打印最終能夠在體外構(gòu)建出一個功能性的組織或器官，用于化學(xué)物質(zhì)的毒性預(yù)測和篩選。在化學(xué)物質(zhì)肝毒性篩選與預(yù)測方面，Ide等[8]利用3D Regenova?生物打印機生成了由原代人肝細胞和人肝星狀細胞組成的肝微組織，該微組織直徑大約1 mm，能夠持續(xù)培養(yǎng)25 d，且保持長期的細胞活力以及代謝與轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達；與2D培養(yǎng)和球狀模型下的化學(xué)物質(zhì)肝毒性評估結(jié)果相比，該模型通過檢測三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate, ATP)和白蛋白指標識別出了其他2類模型沒有識別到的肝毒性化學(xué)物質(zhì)，具有更高的靈敏性。然而，3D生物打印仍然存在一些有待改進的地方，如細胞與生物相容性材料之間的兼容性差，打印速度低，打印后可能會由于培養(yǎng)環(huán)境的失控導(dǎo)致支架形狀發(fā)生改變。為了解決這些問題，新一代的3D生物打印方法也在不斷的發(fā)展中[16]，例如，一種四維(4D)生物打印新技術(shù)被提出，第四維指的是3D生物打印生成的構(gòu)造在打印后隨著時間的推移繼續(xù)被控制發(fā)展[42]。

2 3D體外培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測中的應(yīng)用(Application of 3D in vitro culture models on hepatotoxicity prediction of environmental chemicals)

環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性評估按暴露時間主要分為短期暴露(12 h或24 h)產(chǎn)生的肝細胞毒性(例如50%受抑制濃度(IC50))，與長期暴露(數(shù)周或數(shù)月)引起的肝特有毒性(例如肝纖維化或脂肪肝)[43]。目前3D肝細胞體外測試模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性尤其是慢性肝毒性評估方面的應(yīng)用逐漸增加，表2羅列了3D體外培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝毒性的預(yù)測中的應(yīng)用案例，包括納米材料、持久性有機污染物(四氯二苯并-對-二噁英(TCDD)、3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯(PCB126)等)和新型有機污染物等(全氟辛酸(PFOA)等)。

2.1 納米材料

3D肝細胞體外培養(yǎng)模型可有效控制納米材料的暴露方式，為研究納米材料在體外肝細胞功能穩(wěn)定情況下的毒性效應(yīng)提供測試平臺，且目前在納米材料肝毒性評估中應(yīng)用較多的是球形模型和流動狀態(tài)的芯片模型。隨著納米材料在醫(yī)藥、個人護理品及電子產(chǎn)品等多個領(lǐng)域的大量應(yīng)用[56]，納米材料存在廣泛的環(huán)境暴露與生物內(nèi)暴露，嚴重威脅生態(tài)環(huán)境及人體健康安全[57]。盡管目前納米材料的環(huán)境健康風(fēng)險研究已經(jīng)取得了較多的進展，但是仍然存在許多亟待解決的問題和挑戰(zhàn)。其中，由于納米材料的毒性效應(yīng)受多種因素(元素組成、尺寸和表面電荷等)的影響，傳統(tǒng)的化學(xué)藥品毒性測試方法不適用于納米材料毒性機制評估[58]，因此，需要發(fā)展針對納米材料環(huán)境健康風(fēng)險評估的新方法或者替代測試策略。Li等[44]構(gòu)建了一個用于評估納米材料肝毒性的微流控3D肝細胞芯片模型，該模型通過連續(xù)灌注的方式研究納米材料累積暴露的毒性。超順磁性氧化鐵納米粒子在該模型下表現(xiàn)出比標準的2D孔板暴露方式更強的肝毒性，可能的原因是較小尺寸的納米粒子在此模型下更有可能與肝細胞發(fā)生作用，影響白蛋白和尿素的合成路徑，最終引發(fā)更嚴重的肝損傷。Jiang等[45]利用大鼠肝細胞球狀體研究了硫化銅納米粒子的肝毒性及其機制，發(fā)現(xiàn)硫化銅納米粒子通過影響線粒體膜電位以及誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激從而引起肝毒性，同時還發(fā)現(xiàn)硫化銅納米粒子影響膽鹽輸出泵的轉(zhuǎn)錄和表達，對肝臟膽汁的轉(zhuǎn)運進行阻斷，但是具體的機理還有待進一步的研究。

表2 3D體外培養(yǎng)模型在化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測方面的應(yīng)用案例Table 2 Application cases of 3D in vitro culture models for hepatoxicity prediction of environmental chemicals

不同的納米材料在3D肝細胞體外培養(yǎng)模型下的肝毒性效應(yīng)與2D培養(yǎng)模型下的結(jié)果相比較，敏感性不同，但3D培養(yǎng)模型下的肝毒性效應(yīng)更能真實地反映納米材料體內(nèi)暴露的毒性。Elje等[46]對比了HepG2細胞在3D球形培養(yǎng)和2D培養(yǎng)下對納米二氧化鈦、納米銀以及納米氧化鋅的毒性響應(yīng)，包括細胞毒性和基因毒性；發(fā)現(xiàn)弱毒性的納米二氧化鈦在2個模型下都沒有表現(xiàn)出毒性效應(yīng)，強毒性的納米氧化鋅表現(xiàn)出相似的細胞毒性，但是納米銀對2D培養(yǎng)下的HepG2細胞具有更強的毒性，這些差異的來源可能是由于納米材料暴露方式的不同影響了其毒性效應(yīng)。盡管納米材料的肝毒性在3D培養(yǎng)模型下與2D培養(yǎng)存在差異，但是3D培養(yǎng)模型下的肝毒性數(shù)據(jù)與體內(nèi)測試結(jié)果有著更好的一致性[59]。因此，開發(fā)并使用能夠模擬體內(nèi)暴露環(huán)境的3D培養(yǎng)模型進行納米材料的人體健康風(fēng)險評估非常重要。

2.2 持久性有機污染物

3D肝細胞模型為研究持久性有機污染物(POPs)對人體肝臟的影響提供了一個接近于體內(nèi)肝臟功能且能夠研究低濃度長期暴露毒性效應(yīng)的測試平臺，這增加了利用體外模型的毒性數(shù)據(jù)預(yù)測POPs人體健康風(fēng)險的可信度。二噁英(TCDD)和多氯聯(lián)苯(PCB126)是2種典型的持久性有機污染物，同時是芳香烴受體(AhR)的配體[60]，由于AhR受體的結(jié)構(gòu)以及AhR信號通路響應(yīng)在動物與人體之間具有差異，且AhR受體在TCDD、PCB126致毒過程中發(fā)揮著重要作用，因此TCDD、PCB126致毒機制及毒性效應(yīng)存在物種差異[61]。在動物模型下，TCDD、PCB126與AhR受體結(jié)合，激活A(yù)hR信號通路，產(chǎn)生大量的細胞色素酶，長期暴露導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增強，肝細胞以及周圍的肝非實質(zhì)細胞的正常功能紊亂，導(dǎo)致脂肪肝、肝纖維化以及肝臟腫瘤的發(fā)生[62]。然而，Yan等[47]構(gòu)建了一個由HepaRG、肝星狀細胞(HSCs)和巨噬細胞(THP-1)共培養(yǎng)的人肝微組織模型，該模型能有效用于識別化學(xué)物質(zhì)所引發(fā)的肝纖維化，并且觀察到硫代乙酰胺(TAA)以及苯并芘(BaP)引起的肝纖維化。但在TCDD和PCB126脅迫下，并未觀察到肝纖維化，僅檢測到細胞色素酶等代謝相關(guān)信號的激活[27]。動物模型和人肝微組織模型測試結(jié)果的差異進一步預(yù)示著在評估POPs對人體肝臟危害時，需要考慮物種間的毒性差異。除了3D人肝微組織模型外，基于雞肝癌細胞(LMH)以及原代水牛肝細胞的3D球狀模型也分別用于評估PCB126和TCDD的毒性效應(yīng)[48-49]。研究發(fā)現(xiàn)，PCB126在3D雞肝癌細胞模型下的細胞毒性IC50值高于2D培養(yǎng)模型，但是在評估7-乙氧基-異吩唑酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)活性以及AhR相關(guān)基因表達方面，PCB126在3D模型下誘導(dǎo)更高的基因表達以及EROD活性，這表明了3D培養(yǎng)模型在評估分子水平變化時具有靈敏度高的特點。以原代水牛肝細胞構(gòu)建的3D肝細胞培養(yǎng)模型通過檢測TCDD誘導(dǎo)的特有基因表達情況，并與已知的原代人肝細胞以及大鼠細胞測試結(jié)果做比較，發(fā)現(xiàn)該模型對TCDD的響應(yīng)與原代人肝細胞模型更相似，這也說明了不同物種在響應(yīng)TCDD毒性時存在物種差異，以及發(fā)展更接近于人體毒性響應(yīng)模型的重要性[49]?？傊谠u估化學(xué)物質(zhì)對人體肝臟的影響時，建立與人體肝臟模型相關(guān)性高的3D體外細胞模型一方面可以在體外培養(yǎng)肝細胞的過程中保存肝細胞功能，另外一方面可以縮小毒性效應(yīng)的物種差異，為環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的肝毒性評估提供接近于人體肝臟功能的測試平臺。

2.3 新型有機污染物

3D肝細胞培養(yǎng)模型為新型有機污染物全氟辛酸(perflurooctanoic acid, PFOA)和雙酚A (bisphenol A, BPA)的肝毒性機制研究提供了一個模擬體內(nèi)暴露環(huán)境的平臺，縮小了體外和體內(nèi)研究結(jié)果的差異，彌補了傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)下肝細胞基因表達異常等不足。隨著PFOA替代品的出現(xiàn)，為了提高PFOA及其替代品的毒性測試通量以及增加體外測試數(shù)據(jù)的準確性，利用3D肝細胞模型進行這類物質(zhì)的肝毒性研究是一個可行的選擇。在小鼠肝細胞(AML12)球形模型下，PFOA細胞毒性的IC50值比2D培養(yǎng)條件下的數(shù)值高，且氧化應(yīng)激水平也具有同樣的趨勢，41.4 mg·L-1和82.8 mg·L-1PFOA暴露AML12球狀體28 d會導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激、乳酸脫氫酶漏出率以及凋亡效應(yīng)因子caspase3/7活性顯著增加；六氟環(huán)氧丙烷二聚酸(hexafluoropropylene oxide dimer acid, HFPO-DA)和全氟-3,5,7,9-四氧雜癸酸(perfluoro-3,5,7,9-tetraoxadecanoic acid, PFO4DA)這2個新興替代品也會引起細胞氧化應(yīng)激以及細胞損傷，但比PFOA的肝毒性小[50]。

3D肝細胞體外培養(yǎng)模型在BPA肝毒性機制研究方面的應(yīng)用提高了慢性BPA暴露肝毒性致毒機制的認識。HepG2球狀體經(jīng)BPA染毒14 d后的轉(zhuǎn)錄組變化顯示，BPA影響與脂質(zhì)代謝功能相關(guān)的生物過程，包括脂質(zhì)生物合成、類固醇代謝過程和膽固醇調(diào)節(jié)過程，且這一結(jié)果與大鼠經(jīng)BPA暴露90 d后的轉(zhuǎn)錄組變化情況相一致[51]，補充了2D HepG2模型未檢測到低濃度BPA暴露影響脂質(zhì)代謝的不足[63]。另外，在基于人肝癌細胞Hep3B的微流控芯片模型中，BPA被證實在CYP2E1細胞色素酶存在的情況下毒性更強，而在乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶以及雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶存在的情況下毒性減弱，同時該系統(tǒng)用到的酶樣品體積僅為普通的96孔板的1/2 000，大大節(jié)約了該模型評估化學(xué)物質(zhì)代謝毒性所需要的花費[9]。

2.4 其他環(huán)境化學(xué)物質(zhì)

3D肝細胞模型可用于研究由農(nóng)藥暴露引起的肝臟代謝紊亂的毒性機制。在傳統(tǒng)的2D細胞模型下，肝細胞的代謝能力會迅速減弱，這會影響農(nóng)藥肝臟毒性的預(yù)測，以及機制的研究。Jellali等[52]利用大鼠原代細胞構(gòu)建的器官芯片和多組織學(xué)測試方法的結(jié)合研究了滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT)、氯菊酯(permethrin, PMT)和它們混合物引起的肝臟損害，轉(zhuǎn)錄組和代謝組測試結(jié)果共同表明，53.1 mg·L-1DDT、58.7 mg·L-1PMT和DDT/PMT混合物通過干擾與PPARα信號傳導(dǎo)、脂質(zhì)代謝和類固醇合成等相關(guān)基因而干擾脂肪酸、脂質(zhì)以及葡萄糖的代謝，同時發(fā)現(xiàn)混合暴露會引起更加復(fù)雜的基因和代謝紊亂。

除了肝毒性之外，3D肝細胞模型也可以用于評估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)基因毒性，且比2D培養(yǎng)模型具有更好的靈敏性。Sharin等[53]對比了BaP在雞肝癌細胞2D培養(yǎng)和3D球形培養(yǎng)下誘導(dǎo)的cyp1a表達量以及引發(fā)的DNA損傷響應(yīng)；在3D模型下，EROD活性在暴露8 h后即可檢測到且在暴露24 h達到最大值，比2D模型更早檢測到，同時與DNA損傷響應(yīng)相關(guān)的基因也更早地在3D細胞模型下被檢測到，這說明了雞肝癌細胞LDH球狀體適用于評估需要CYP1A激活的化學(xué)物質(zhì)的基因毒性。Mandon等[54]利用HepaRG細胞構(gòu)建了一個用于評估化學(xué)物質(zhì)基因毒性的肝細胞模型，該模型測試了11個基因毒性化學(xué)物質(zhì)對HepaRG球狀體染毒24 h和48 h后DNA損傷情況，并且彗星實驗結(jié)果顯示8個基因毒性化學(xué)物質(zhì)被檢測到具有損傷DNA的能力。盡管3D HepaRG球狀體在預(yù)測化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性方面是一個非常有潛力的模型，但是還需要進一步的實驗來驗證和提高該模型對化學(xué)物質(zhì)致癌性的預(yù)測效果。

3 3D體外培養(yǎng)模型在肝毒性AOPs指導(dǎo)下的應(yīng)用前景(Prospect of 3D in vitro culture models under the guide of hepatotoxicity AOPs)

3D體外培養(yǎng)模型不僅提高了環(huán)境化學(xué)物質(zhì)關(guān)于肝細胞毒性數(shù)據(jù)的準確性，還為分析環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)多種肝毒性有害結(jié)局(例如膽汁淤積、脂肪肝和肝纖維化)提供了復(fù)雜的體外細胞模型。肝毒性AOPs系統(tǒng)地描述了毒性發(fā)展過程，根據(jù)收錄在AOP-wiki數(shù)據(jù)庫中涉及到肝毒性的有害結(jié)局，肝毒性AOPs可以歸納為5種類型：肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積和肝細胞損傷。這些AOPs涉及到的生物信息有利于針對性地設(shè)置3D體外培養(yǎng)模型的檢測指標，指導(dǎo)3D體外培養(yǎng)模型從分子、細胞、組織和器官水平對環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性進行評估，實現(xiàn)提高模型預(yù)測準確性的目標[64]。

不同的肝毒性終點測試需求決定了3D體外培養(yǎng)模型的選擇。在預(yù)測環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對人體肝臟的影響時，選擇基于人源細胞系的培養(yǎng)模型能夠減少由物種差異帶來的毒性信息不一致的可能性；而利用動物源肝細胞培養(yǎng)模型獲得的化學(xué)物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)以及毒性機制信息同樣為生態(tài)及健康風(fēng)險評估提供了重要的理論依據(jù)。另外一方面，針對化學(xué)物質(zhì)引起的肝纖維化、脂肪肝等肝臟毒性研究，由于毒性產(chǎn)生過程中多種細胞系受到影響且細胞系之間存在密切的相互作用，因此在評估這種類型的肝毒性時，多細胞系共培養(yǎng)模型更加符合化學(xué)物質(zhì)毒性引發(fā)的場景。此外，3D體外培養(yǎng)模型可以評估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)低濃度長期暴露引起的肝臟損傷以及細胞內(nèi)發(fā)生的分子機制，并結(jié)合現(xiàn)有的肝毒性AOPs預(yù)測環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對人體的影響。

3D體外肝細胞培養(yǎng)模型聯(lián)合其他體外測試方法或者組學(xué)測試(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué))進一步提高了環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測的準確性[65]。導(dǎo)致肝臟毒性的過程會涉及到多種細胞參與，是一個機制比較復(fù)雜的過程。因此，目前單一模型或測試無法準確評估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)肝損傷的風(fēng)險。依據(jù)肝毒性機制構(gòu)建一個包含多種或多級肝毒性測試方法的整合預(yù)測模型是毒性測試的發(fā)展方向[66]。這種整合預(yù)測方法由2個維度組成(圖2)，橫向反映的是環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)的肝毒性AOPs，縱向是整合測試評估方法(integrated approaches to testing and assessment, IATA)。環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引起肝毒性分子啟動事件的發(fā)生是肝損傷的重要分子標志物之一，由于待測環(huán)境化學(xué)物質(zhì)數(shù)量巨大，采用體外化學(xué)分析法(inchemico)或計算機模擬法(insilico)對分子啟動事件的進行評估可以提高預(yù)測的規(guī)模和速度。具有引發(fā)分子啟動事件潛力的那些環(huán)境化學(xué)物質(zhì)將會進行第二級的肝毒性體外測試，主要是為了檢測環(huán)境化學(xué)物質(zhì)在細胞或組織水平是否能夠引起肝毒性生物標志物的變化，這個過程涉及到的毒性機制更加復(fù)雜，因此3D體外肝細胞培養(yǎng)模型的應(yīng)用為這一步的測試提供了更好的測試平臺。如果環(huán)境化學(xué)物質(zhì)在第二級同樣被檢測出有肝毒性風(fēng)險，則需要進行第三級人群流行病學(xué)的調(diào)查，進一步確認該環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的肝毒性。

綜上所述，3D體外肝細胞培養(yǎng)模型更好地模擬了真實肝臟的功能，并形成了以夾層培養(yǎng)法、球形模型、生物反應(yīng)器、器官芯片和3D生物打印5種主要的3D細胞模型制備方法，其中球形模型在進行大量環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測方面應(yīng)用時可以做到高通量，而生物器、器官芯片以及3D生物打印可以模擬更加復(fù)雜的體內(nèi)肝臟環(huán)境。肝毒性AOPs總結(jié)了化學(xué)物質(zhì)從(1)分子啟動事件(cyp2e1持續(xù)激活、AhR持續(xù)激活、PPARα激活等)，到(2)細胞、組織/器官水平上的分子響應(yīng)關(guān)鍵事件(膽汁酸合成增加、脂質(zhì)積累、炎癥反應(yīng)、肝星狀細胞激活等)，再到(3)個體水平上可觀察到的肝損傷(肝臟腫瘤、肝纖維化和脂肪肝等)，為充分利用3D體外肝細胞培養(yǎng)模型進行環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測提供了理論依據(jù)。另外，3D肝細胞模型可以與多種檢測技術(shù)(如組學(xué))結(jié)合，進一步提高對環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測的準確性。

圖2 有害結(jié)局路徑指導(dǎo)下的肝毒性整合測試評估方法注：AOP表示有害結(jié)局路徑；IATA表示整合測試評估方法；MIEs表示分子啟動事件。Fig. 2 Integrated testing assessment approaches for hepatotoxicity guided by the adverse outcome pathwayNote: AOP stands for adverse outcome pathway; IATA stands for integrated approaches to testing and assessment; MIEs stands for molecular initiating events.

通訊作者簡介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為生態(tài)毒理學(xué)和健康風(fēng)險評估。