混合物毒性評(píng)價(jià)模型的選擇優(yōu)化

孫茹茹，王娜,*，馬曉妍，張歡樂(lè)，張靖坤

1. 西安科技大學(xué)建筑與土木工程學(xué)院，西安 710054 2. 西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，西安 710055

隨著大量的工業(yè)廢水和生活污水排放到江河等地表水體之中，水中化學(xué)物質(zhì)的數(shù)目越來(lái)越多，進(jìn)而導(dǎo)致地表水受到嚴(yán)重的污染。受污染的地表水體與人類的生活緊密相關(guān)，給人類和生態(tài)健康帶來(lái)極大的危害。大量研究表明，混合物對(duì)水體中各級(jí)生物體的聯(lián)合毒性往往大于單一物質(zhì)的毒性之和[1-2]。由于模型評(píng)價(jià)的差異性，同一組混合物可能得到截然不同的聯(lián)合作用結(jié)論[3-5]。因此要正確評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)混合物的聯(lián)合毒性，選擇合適的模型非常重要。目前，化學(xué)混合物毒性研究中最流行的加和參考模型是濃度加和模型(concentration addition model, CA)[6]和獨(dú)立作用模型(independent action model, IA)[7-8]。對(duì)于同一物質(zhì)中2個(gè)濃度組合成的虛擬混合物，CA模型雖然能合理解釋，但以物質(zhì)濃度與毒性之間具有線性關(guān)系為依據(jù)[9-10]。已有大量的研究表明，物質(zhì)的濃度和其毒性效應(yīng)具有非線性關(guān)系[11-12]，因此對(duì)CA模型的使用要謹(jǐn)慎。IA模型雖然不是依據(jù)物質(zhì)濃度與毒性之間的線性關(guān)系，但僅僅依據(jù)概率與統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，缺乏物理、化學(xué)和生物學(xué)的意義[9-10]。因此，迫切需要一種更簡(jiǎn)單、更科學(xué)的模型作為混合物聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)的補(bǔ)充。Gao等[13]建立的理論非線性聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)模型(the theoretical non-linear combined toxicity assessment model, TNL)在評(píng)價(jià)重金屬二元混合物的聯(lián)合作用上有很好的可靠性。課題組前期采用毒性效應(yīng)來(lái)衡量毒性的大小，該方法在原理上與TNL模型一致，通過(guò)評(píng)價(jià)不同類型的二元混合物發(fā)現(xiàn)，在劑量效應(yīng)曲線范圍內(nèi)，該模型能滿足各種類型物質(zhì)的聯(lián)合作用評(píng)價(jià)，并可將應(yīng)用范圍擴(kuò)展到多元混合物[14]。

重金屬具有持久性、毒性和生物累積性，對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)和人類健康具有重大的威脅[15]，本研究選擇常見(jiàn)的重金屬鎘。表面活性劑在水體中會(huì)起泡，隔絕空氣與水，抑制水體復(fù)氧，高濃度的表面活性劑亦會(huì)對(duì)生物降解功能產(chǎn)生抑制[16]。本研究選擇最常見(jiàn)的直鏈烷基苯磺酸表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate, SDS)。農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)必不可少的一部分。生長(zhǎng)型除草劑百草敵(dicamba, DIC)是世界上應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥之一[17]，它具有潛在的基因毒性已被多種體內(nèi)、體外生物毒性評(píng)價(jià)證明[18-19]。廣譜抗生素鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride, TC)是一種便宜的獸用抗生素和飼料添加劑，其在水和食物中常被檢測(cè)到，對(duì)水生有機(jī)物具有抑制生長(zhǎng)、發(fā)育的毒性[20]，影響人類的腸道菌群及增強(qiáng)耐藥性基因[21]。具有耐藥基因的生物體引起的感染越來(lái)越多，多肽類抗生素多粘菌素B(polymyxin B sulfate, PLB)作為人類應(yīng)對(duì)感染的最后一招，常在臨床醫(yī)學(xué)中用到[22]。鹽酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride, DPH)臨床上常被用來(lái)治療各種過(guò)敏癥狀、蕁麻疹、失眠，天然水體、污水廠二級(jí)出水、土壤、魚(yú)類體內(nèi)均檢測(cè)到它的存在，對(duì)人類的健康和水體生物帶來(lái)負(fù)面影響[23]。隨著離子液體應(yīng)用的普及，文獻(xiàn)中關(guān)于它們的生物毒性和環(huán)境危害性的報(bào)道越來(lái)越多[24-25]，離子液體1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽(1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride, IL)被選擇用于本研究。

綜上，本研究選擇5類環(huán)境中常見(jiàn)的7種有毒物質(zhì)，采用等毒性溶液法[26]設(shè)計(jì)二元混合物。利用應(yīng)用微板毒性分析法(microplate toxicity analysis, MTA)[27]測(cè)定了上述物質(zhì)對(duì)費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)的一元及二元急性生物毒性。通過(guò)分析3種模型的評(píng)價(jià)結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化混合物聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)中模型的選擇。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器、試劑與樣品

Centrol IApc LB962微孔板式發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)Berthold Technologies公司)，TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，中國(guó))，國(guó)華BS-1EA型恒溫震蕩培養(yǎng)箱(中國(guó))，12通道移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；CdCl2·2.5H2O(分析純)、鹽酸苯海拉明(DPH, >98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich(中國(guó)上海)；鹽酸四環(huán)素(TC, >98.0%)、十二烷基硫酸鈉(SDS, >97.0%)購(gòu)自TCI(日本)；敵百草(DIC，標(biāo)準(zhǔn)品)購(gòu)自DR(德國(guó))；1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽(IL, 99%)購(gòu)自安耐吉(中國(guó))；多粘菌素B硫酸鹽(PLB, 95%)購(gòu)自TRC(加拿大)。用超純水配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母液并儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用，表面活性劑藥品提前配制并使用超聲波儀器混合均勻，避免起泡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。物質(zhì)基本信息如表1所示。

1.2 二元毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

等毒性溶液法(equal toxic solution method, ETS)是一種混合物設(shè)計(jì)方法，將不同物質(zhì)按照毒性比1∶1混合，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的稀釋因子，使二元混合物抑制率在EC5至EC90之間均勻分布。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、可視化的優(yōu)點(diǎn)，常用于研究二元混合物的聯(lián)合毒性作用[26]。

1.3 生物毒性測(cè)定方法

V.fischeri和毒性試驗(yàn)方法按照課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)所述進(jìn)行[28-29]。為保證V.fischeri測(cè)試菌懸液狀態(tài)相同，V.fischeri生長(zhǎng)至菌密度(OD575)為1.2左右取出備用，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，保證3次測(cè)試結(jié)果誤差不超過(guò)10%。測(cè)試樣品對(duì)V.fischeri的急性毒性用相對(duì)發(fā)光抑制率表示，如式(1)所示。

(1)

式中：I為測(cè)試樣品的發(fā)光抑制率(%)；R0、R分別為空白樣品的發(fā)光強(qiáng)度平均值與測(cè)試樣品的發(fā)光強(qiáng)度平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析方法

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Origin Pro 8.5(OriginLab, North-ampton, MA, USA)軟件，采用非線性最小二乘法(non- linear least square, NLLS)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合，以獲得每個(gè)單一化學(xué)品和二元混合物的劑量效應(yīng)曲線(concentration response curves, CRCs)。由于所有的數(shù)據(jù)集都與Hill函數(shù)很好地吻合，Hill方程作為CRCs的數(shù)學(xué)表達(dá)式，如式(2)所示。

I=a×Cm/(bm+Cm)

(2)

式中：I為物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)抑制率(%)；C為物質(zhì)濃度(mg·L-1)；a為極限濃度對(duì)應(yīng)的效應(yīng)(%)；b為a/2效應(yīng)對(duì)應(yīng)的濃度(mg·L-1)；m為表示斜率的參數(shù)(量綱為1)。

1.4.2 混合物分析模型

(1)CA模型

CA模型常常被用來(lái)預(yù)測(cè)具有相同或相似作用機(jī)制的毒性物質(zhì)的混合物[30]。其數(shù)學(xué)表達(dá)式如式(3)所示。

(3)

式中：n為多元混合物的組分?jǐn)?shù)；ECx,i為第i個(gè)組分單一存在時(shí)，引起x%效應(yīng)的濃度；ci為混合物中第i個(gè)組分的濃度。

(2)IA模型

IA模型是基于化合物組分具有相異的作用原理對(duì)其毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)估[31]。數(shù)學(xué)上IA表達(dá)式如式(4)所示。

(4)

式中：n為多元混合物的組分?jǐn)?shù)；ci為混合物中第i個(gè)組分的濃度；cmix為混合物的總濃度；E(cmix)為混合物的總效應(yīng)；E(ci)為表示第i個(gè)組分獨(dú)立存在且其濃度為ci時(shí)產(chǎn)生的效應(yīng)。

(3)TNL模型[13]

TNL模型以理論抑制率與實(shí)測(cè)抑制率差異確定混合物的聯(lián)合作用強(qiáng)度。具體原理如圖1所示。

圖1 理論非線性聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法圖解Fig. 1 Diagram of theoretical non-linear combined toxicity assessment method

TNL模型可實(shí)現(xiàn)對(duì)各種類型的混合物聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)對(duì)成分和濃度未知的天然污水構(gòu)成混合物聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)[14]，原理上TNL可以解釋為：物質(zhì)A與物質(zhì)B分別在C1、C3濃度時(shí)可以達(dá)到抑制率x(x%≤50%)，在C2、C4濃度時(shí)可以達(dá)到抑制率2x(x%≤100%)。當(dāng)二者混合，利用物質(zhì)A的C1濃度代替物質(zhì)B的C3濃度，使混合物濃度變?yōu)?C4-C3+C1)，如果抑制率依舊為2x，則說(shuō)明二者作用是加和的。如果小于2x，則說(shuō)明物質(zhì)A與物質(zhì)B發(fā)生拮抗作用；若大于2x，則說(shuō)明物質(zhì)A與物質(zhì)B發(fā)生協(xié)同作用。

2 結(jié)果(Results)

2.1 7種化學(xué)物質(zhì)對(duì)V. fischeri的毒性

測(cè)定了7種化學(xué)物質(zhì)對(duì)V.fischeri的單一毒性，其CRCs如圖2所示。

由圖2可知，單一物質(zhì)對(duì)V.fischeri的CRCs呈現(xiàn)單調(diào)非線性趨勢(shì)，隨著物質(zhì)濃度的增加，抑制率也隨之增大。根據(jù)擬合結(jié)果來(lái)看，所有CRCs的修正的相關(guān)系數(shù)平方(Adj.R2)高于0.98，簡(jiǎn)化卡方檢驗(yàn)(Red.Chi-S)低于15，表示所有CRCs均能很好地被Hill函數(shù)擬合。以EC50來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)毒性的大小，7種化學(xué)物質(zhì)的毒性順序?yàn)椋篒L>Cd2+>PLB>SDS>DIC≈TC>DPH。毒性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)是IL，毒性最小的化學(xué)物質(zhì)是DPH。在2種抗生素中，PLB生物毒性比TC高出27.3倍，該結(jié)果和PLB作為應(yīng)對(duì)細(xì)菌最后一招的殺菌劑相一致。參數(shù)m值一定程度上反映了曲線的走勢(shì)，從擬合方程參數(shù)來(lái)看，7種物質(zhì)的CRCs差異較大，7種化學(xué)物質(zhì)的m值順序?yàn)椋篊d2+>TC>IL>DIC>PLB>DPH>SDS。m越大，曲線中間段越陡峭，例如：Cd2+、DIC、IL、TC，m值在3.6～6.7之間變化。m值越接近1，曲線中間段越平緩，例如：SDS、DPH和PLB。

圖2 7種化學(xué)物質(zhì)對(duì)V. fischeri毒性的劑量效應(yīng)曲線注：IL表示1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽；PLB表示多粘菌素B硫酸鹽；DIC表示敵百草；TC表示鹽酸四環(huán)素；SDS表示十二烷基硫酸鈉；DPH鹽酸苯海拉明。Fig. 2 The concentration-response curves of seven chemicals on V. fischeriNote: IL stands for 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride; PLB stands for polymyxin B sulfate; DIC stands for dicamba; TC stands for tetracycline hydrochloride; SDS stands for sodium lauryl sulfate; DPH stands for diphenhydramine hydrochloride.

2.2 二元混合物對(duì)V. fischeri的毒性

根據(jù)1.2節(jié)方法將7種化學(xué)物質(zhì)混合，用微孔板法測(cè)定了21組等毒性混合物對(duì)V.fischeri的急性毒性。二元混合物的CRCs均可用Hill方程較好地?cái)M合。二元混合物的急性毒性擬合信息如表2所示，包括混合物濃度比、擬合參數(shù)、Adj.R2和Red.Chi-S。

由表2可知，所有的Adj.R2值都>0.98，Red.Chi-S值<9，說(shuō)明Hill函數(shù)也能很好地?cái)M合二元混合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，21種二元混合體系對(duì)V.fischeri表現(xiàn)出了不同的抑制作用，其中毒性最強(qiáng)的混合物是IL+PLB，毒性最小的混合物是Cd2++DPH。

表2 二元混合物擬合函數(shù)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 2 The statistic parameters of the binary mixtures fitting function

2.3 聯(lián)合毒性作用類型分析

利用CA、IA和TNL模型對(duì)21種二元混合物進(jìn)行聯(lián)合毒性分析，通過(guò)比較二元混合物的實(shí)測(cè)的CRCs與IA模型預(yù)測(cè)的劑量效應(yīng)曲線(IA-CRCs)、CA模型預(yù)測(cè)的劑量效應(yīng)曲線(CA-CRCs)和TNL模型預(yù)測(cè)的劑量效應(yīng)曲線(TNL-CRCs)的偏差，確定二元混合物的毒性聯(lián)合作用，二元混合物整個(gè)濃度區(qū)間的聯(lián)合作用分析如圖3所示。

由圖3可知，21組二元混合物的毒性評(píng)價(jià)，有14組實(shí)測(cè)CRCs與IA-CRCs、CA-CRCs、TNL-CRCs發(fā)生較大偏離，說(shuō)明這些混合物產(chǎn)生了較強(qiáng)的相互作用(拮抗或協(xié)同)，占總數(shù)的67%。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了課題組前期的研究結(jié)果，CRCs形狀差異較大的2種物質(zhì)組成的混合物易產(chǎn)生相互作用[32]。CA、IA和TNL這3種模型對(duì)二元混合物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)結(jié)果不盡相同。按照IA-CRCs、CA-CRCs和TNL-CRCs在整個(gè)濃度區(qū)間的偏離程度，11組混合物，IA和TNL模型的評(píng)價(jià)結(jié)果更接近，例如Cd2++DPH、DIC+TC和SDS+PLB等，圖中以A類型標(biāo)注；6組混合物，CA和TNL模型的評(píng)價(jià)結(jié)果更接近，例如Cd2++SDS、DPH+DIC和TC+IL等，圖中以B類型標(biāo)注；3組混合物，CA和IA模型的評(píng)價(jià)結(jié)果更接近，例如，DPH+SDS、DIC+IL和TC+PLB，圖中以C類型標(biāo)注，在高濃度區(qū)域，CA和IA模型對(duì)組合DIC+IL的評(píng)價(jià)差異增大。該現(xiàn)象在宋曉青等[33]和王滔等[34]的研究中也被發(fā)現(xiàn)。有1組混合物(DPH+TC)，CA和、IA、TNL這3個(gè)模型的評(píng)價(jià)結(jié)果均接近，圖中以D類型標(biāo)注。通過(guò)比較A、B和C類型混合物各組分?jǐn)M合曲線的參數(shù)m發(fā)現(xiàn)：A、B類型混合物，m值差異大，例如混合物Cd2++SDS的m值差異百分比為83.6%；混合物TC+SDS的m值差異百分比為76.6%；C類型混合物，m值差異小，例如混合物DPH+SDS的m值差異百分比為15.4%；混合物DIC+IL的m值差異百分比為5.3%。

3 討論(Discussion)

CA模型存在某些預(yù)測(cè)盲區(qū)，應(yīng)用CA模型預(yù)測(cè)某個(gè)效應(yīng)的混合物總濃度，就必須保證混合物中的各個(gè)組分單獨(dú)存在時(shí)有此效應(yīng)濃度[6]。例如，由于組分PLB最高抑制率只能在65%左右，在高濃度區(qū)域沒(méi)有相應(yīng)抑制率，Cd2++PLB、DIC+PLB和TC+PLB 3組混合物中CA模型并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其高濃度混合物毒性。IA模型雖然不存在預(yù)測(cè)盲區(qū)，但是，IA模型是一個(gè)純粹的理論構(gòu)想：混合物中的所有組分通過(guò)不同的毒性作用模式和機(jī)制相互獨(dú)立地作用于靶點(diǎn)。實(shí)際上，在有機(jī)體內(nèi)任何復(fù)雜的、相互依賴的生理途徑中，這種情況是否會(huì)發(fā)生是有疑問(wèn)的。此外，由于IA假設(shè)兩者的作用機(jī)制是完全不同的，那么在混合物中，任何涉及的成分有多個(gè)或非特定的機(jī)制就不能完全遵循IA模型[35]，而IA模型對(duì)混合物毒性評(píng)價(jià)結(jié)果也在高濃度區(qū)域的差別逐漸增大[36]。對(duì)于TNL模型無(wú)法解釋的由同一種物質(zhì)組成的“虛擬組合”，IA模型同樣不適用，例如物質(zhì)十二烷基硫酸鈉(SDBS)，其EC10對(duì)應(yīng)濃度為34.9 mg·L-1，EC30對(duì)應(yīng)濃度為44.6 mg·L-1，根據(jù)IA模型預(yù)測(cè)混合物效應(yīng)為37%，但實(shí)測(cè)效應(yīng)為98%，相差61%。在環(huán)境毒理學(xué)中，協(xié)同作用被認(rèn)為是2種或2種以上環(huán)境化學(xué)品同時(shí)作用于機(jī)體所產(chǎn)生的生物學(xué)作用的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)各化學(xué)品單獨(dú)作用強(qiáng)度的總和，而拮抗作用指2種環(huán)境化學(xué)品同時(shí)作用于機(jī)體時(shí)，其中一種化學(xué)品可干擾另一種化學(xué)品的生物學(xué)作用，或2種化學(xué)品相互干擾，使混合物的毒作用強(qiáng)度低于各自單獨(dú)作用的強(qiáng)度之和[37-39]。TNL模型以二元混合物各組分的濃度和為自變量，以混合物的理論抑制率(各組分單獨(dú)存在時(shí)對(duì)應(yīng)抑制率之和)為因變量，用理論抑制率與實(shí)測(cè)抑制率差異確定混合物的聯(lián)合作用強(qiáng)度，符合毒理學(xué)關(guān)于聯(lián)合作用的定義。Gao等[13]也從銅綠微囊藻體內(nèi)氧化酶的活性，活性氧、丙二醛濃度等角度證明了TNL對(duì)混合物聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的正確性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，52%的組合TNL模型評(píng)價(jià)的結(jié)果與IA模型評(píng)價(jià)的結(jié)果更接近，24%的組合TNL模型評(píng)價(jià)的結(jié)果與CA模型評(píng)價(jià)的結(jié)果更接近。

CA、IA各自存在一定的不足之處，TNL模型可以作為補(bǔ)充模型，將CA、IA模型共同應(yīng)用于混合物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)。TNL模型的應(yīng)用對(duì)象是不同物質(zhì)組成的混合物，不適用于“虛擬組合”。因此，當(dāng)曲線形狀差異小時(shí)，CA模型評(píng)價(jià)結(jié)果與IA模型相近。由于CA模型相對(duì)保守[6, 35]，更適合混合物的毒性預(yù)測(cè)和生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[40]，因此選用CA模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。若CA模型出現(xiàn)預(yù)測(cè)盲點(diǎn)時(shí)，直接選用IA模型；當(dāng)曲線形狀差異大時(shí)，根據(jù)毒理學(xué)對(duì)聯(lián)合作用的定義，直接使用TNL模型來(lái)評(píng)價(jià)混合物的作用方式。

通訊作者簡(jiǎn)介：王娜(1981—)，女，博士，講師，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)。