甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和抗生素混合藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果

趙曉佳，袁裕超，孫玉鳳，葉建仁，談家金

南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037

松材線(xiàn)蟲(chóng)?。╬ine wilt disease，PWD）作為松樹(shù)“癌癥”對(duì)森林經(jīng)濟(jì)以及生態(tài)造成了極大的影響。一直以來(lái)，人們對(duì)于松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治的重點(diǎn)都在殺線(xiàn)劑上，防治狀況雖有所改善，但是仍然面臨嚴(yán)峻的病害形勢(shì)。自 1980年 Oku 等［1］提出細(xì)菌與松材線(xiàn)蟲(chóng)病相關(guān)后，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病中具有重要作用［2-4］。有學(xué)者認(rèn)為該病是松材線(xiàn)蟲(chóng)和致病細(xì)菌共同作用引起的復(fù)合侵染病害，二者互惠共生，在誘發(fā)寄主萎蔫方面缺一不可，且認(rèn)為運(yùn)用抗生素控制細(xì)菌的方法可以控制松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生［5］。在此基礎(chǔ)上，一些學(xué)者開(kāi)始研究用抗生素［6-7］或抗生素與殺線(xiàn)劑混合使用［8-9］的方法防治松材線(xiàn)蟲(chóng)病，都取得了一定的防效?？梢?jiàn)，對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)和病害相關(guān)細(xì)菌雙向抑制，可能成為今后解決松材線(xiàn)蟲(chóng)病的重要方向。

甲維鹽是在發(fā)酵產(chǎn)品阿維菌素B1 基礎(chǔ)上合成的一種半合成抗生素殺蟲(chóng)劑，對(duì)許多害蟲(chóng)具有較高的毒殺活性，且對(duì)益蟲(chóng)影響較小，能夠在保護(hù)人畜安全的情況下，對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行精準(zhǔn)防治［10］。甲維鹽作為低毒、高效農(nóng)藥多次被證實(shí)具有較好的殺線(xiàn)活性，能有效地降低松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)病率，一定程度上限制了松材線(xiàn)蟲(chóng)病的擴(kuò)散［11-13］，但關(guān)于甲維鹽和抗生素混合防治松材線(xiàn)蟲(chóng)病鮮有報(bào)道。本研究將對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病相關(guān)細(xì)菌有較強(qiáng)抑菌活性的抗生素與甲維鹽混合，測(cè)定其混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺作用以及松材線(xiàn)蟲(chóng)病溫室防治效果，旨在為尋求更好的松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3 強(qiáng)毒蟲(chóng)株分離自安徽省感病黑松（Pinus thunbergii）。2年生馬尾松盆栽苗由江蘇沂北園林苗木有限公司提供。98%米諾環(huán)素（二甲胺四環(huán)素鹽酸鹽）和98%鹽酸環(huán)丙沙星購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。抗生素藥敏片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，直徑為7 mm，包括：米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、麥迪霉素、頭孢哌酮、萬(wàn)古霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氯霉素、多西環(huán)素、頭孢唑林、氨芐西林、阿米卡星、苯唑西林、復(fù)方新諾明（SMZ/TMP）、青霉素、紅霉素、諾氟沙星、羧芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、丁胺卡那、克林霉素、多粘菌素、慶大霉素。72%甲維鹽原藥購(gòu)自河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司。

NA 固體培養(yǎng)基為蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 為 7.2～7.4。NB 液體培養(yǎng)基為蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 為 7.2～7.4。MH 固體培養(yǎng)基為牛肉膏2 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白17.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH為7.2～7.4。

1.2 細(xì)菌處理下松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率、繁殖量的測(cè)定以及病害發(fā)生情況統(tǒng)計(jì)

1）松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌 AMA3-1、AMA3-2 和AMA3-3 的獲得。將松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3 接種在長(zhǎng)滿(mǎn)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)5～6 d后，采用貝爾曼漏斗法分離收集線(xiàn)蟲(chóng)。將收集到的線(xiàn)蟲(chóng)懸液3 500 r/min 離心3 min，棄上清，用無(wú)菌水清洗3 遍以上。吸取0.5 mL 松材線(xiàn)蟲(chóng)水懸液于1.5 mL 滅菌的離心管里，用滅菌的研磨棒充分研磨，稀釋涂布NA 固體培養(yǎng)基，25 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落進(jìn)行純化、培養(yǎng)和保存，即為松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌。

2）松材線(xiàn)蟲(chóng)預(yù)處理。將收集到的線(xiàn)蟲(chóng)水懸液與3%的過(guò)氧化氫1∶1混合，靜置10 min，3 500 r/min離心3 min，棄上清，用無(wú)菌水清洗3 遍后用等體積0.1%的硫酸鏈霉素混合處理1 h，隨后用無(wú)菌水洗3遍以上。

3）細(xì)菌水懸液的制備。挑取NA 固體培養(yǎng)基上的1 個(gè)單菌落于 NB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min黑暗條件下震蕩培養(yǎng)10 h，在8 000 r/min 下離心10 min，棄上清，沉淀用無(wú)菌水清洗3 次后重新懸浮，制成1×108、1×107、1×106cfu/mL細(xì)菌水懸液，備用。

4）松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率的測(cè)定。將線(xiàn)蟲(chóng)濃度調(diào)整為5 000條/mL，分別與3種濃度的細(xì)菌水懸液1∶1混合于1.5 mL 的滅菌離心管中，此時(shí)細(xì)菌的濃度為5×107、5×106、5×105cfu/mL。將蟲(chóng)菌混合液放置于25 ℃培養(yǎng)箱中，每隔3 d 在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察線(xiàn)蟲(chóng)的存活情況，統(tǒng)計(jì)和比較不同濃度、不同細(xì)菌處理下松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活率。每個(gè)處理重復(fù)5次，以松材線(xiàn)蟲(chóng)和無(wú)菌水等體積混合為對(duì)照。線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體僵直無(wú)光澤，用大頭針刺激不活動(dòng)者，視為死亡。

線(xiàn)蟲(chóng)存活率=活蟲(chóng)數(shù)/線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)×100%

5）松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量的測(cè)定。將線(xiàn)蟲(chóng)濃度調(diào)整為3 000 條/mL，分別與 3 種濃度的細(xì)菌水懸液 1∶1 混合，吸取200 μL 蟲(chóng)菌混合液（約300 條松材線(xiàn)蟲(chóng)）放置于長(zhǎng)滿(mǎn)灰葡萄孢的PDA 固體培養(yǎng)基中央，于25 ℃下培養(yǎng)，待其中1 個(gè)培養(yǎng)皿灰葡萄孢菌絲消失時(shí)，分離線(xiàn)蟲(chóng)并計(jì)數(shù)，以松材線(xiàn)蟲(chóng)和無(wú)菌水等體積混合的處理為對(duì)照，每處理5個(gè)重復(fù)。

6）松材線(xiàn)蟲(chóng)病病害發(fā)生情況的統(tǒng)計(jì)。將線(xiàn)蟲(chóng)濃度調(diào)整為10 000 條/mL，與濃度為1×108cfu/mL 的細(xì)菌水懸液等體積混合2 h后，采用皮接法［14］接種于2年生馬尾松苗莖干中部偏下位置，在25 ℃的室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)計(jì)8 個(gè)處理，每個(gè)處理接種6 株馬尾松：（1）AMA3-1+ AMA3；（2）AMA3-2+ AMA3；（3）AMA3-3 + AMA3；（4）AMA3-1 +無(wú)菌水；（5）AMA3-2 + 無(wú)菌水；（6）AMA3-3 + 無(wú)菌水；（7）CK1：AMA3 +無(wú)菌水；（8）CK2：無(wú)菌水。每株馬尾松接種500 μL 松材線(xiàn)蟲(chóng)水懸液，每5 d觀(guān)察馬尾松苗的感病癥狀，統(tǒng)計(jì)感病率和感病指數(shù)。馬尾松病情分級(jí)和病情指數(shù)的計(jì)算參照談家金等［15］的方法，略加修改：0級(jí)正常，針葉綠色，代表值為0；1級(jí)為1/2 以下針葉褪綠、1/4 以下葉發(fā)黃，代表值為 1；2 級(jí)為1/2 以上葉褪綠、1/4～3/4 葉發(fā)黃，代表值為2；3級(jí)為3/4 以上葉發(fā)黃、1/2 以下葉變紅，代表值為3；4級(jí)為1/2 以上葉變紅、植株瀕死或死亡，代表值為4。計(jì)算公式如下：

1.3 抗生素藥敏試驗(yàn)

吸取100 μL 的細(xì)菌水懸液放置于MH 固體培養(yǎng)基中，用涂布器推勻整個(gè)平板，稍晾干后，取30 種抗生素藥敏片置于細(xì)菌平板上，于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈大小。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。篩選出高效抗生素，備用。

1.4 甲維鹽對(duì)細(xì)菌抑菌活性測(cè)定

將直徑7 mm 的圓形濾紙片滅菌烘干后浸泡于預(yù)先配制好的不同質(zhì)量濃度（5×104、104、103、102、10、1、0.1 和 0.01 mg/L）的甲維鹽溶液中，10 min 后取出，在超凈工作臺(tái)上晾干，制成含甲維鹽的藥敏紙片。在MH 固體培養(yǎng)基上，用涂布器充分推勻100 μL 的細(xì)菌水懸液，放置含有甲維鹽的藥敏紙片。25 ℃24 h后記錄抑菌圈大小，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.5 甲維鹽與高效抗生素混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺試驗(yàn)

1）不同質(zhì)量濃度高效抗生素的配制。將本文“1.3”中篩選獲得的高效抗生素環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素分別稱(chēng)取1 g，加入1 L 無(wú)菌水使其充分溶解，得到2 000 mg/L 的抗生素母液。再將抗生素母液取出一定量，用無(wú)菌水分別稀釋成 1 000、500、250、125 和31.25 mg/L的不同質(zhì)量濃度的抗生素溶液。

2）不同質(zhì)量濃度甲維鹽的配制。將72%甲維鹽原藥用助溶劑二甲基甲酰胺（DMF）和乳化劑OP-10溶解制成5%的甲維鹽乳油（EC），再用無(wú)菌水稀釋成 1 000、500、250、125 和 31.25 mg/L 不同質(zhì)量濃度的甲維鹽溶液。

3）不同質(zhì)量濃度甲維鹽和高效抗生素混合液的配制。將雙倍濃度的甲維鹽和高效抗生素1∶1 混合于離心管中，配成質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125 和31.25 mg/L 的混合液。將上述不同質(zhì)量濃度的高效抗生素分別與松材線(xiàn)蟲(chóng)水懸液1∶1 混合于1.5 mL 離心管中，此時(shí)得到終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5和15.625 mg/L 的含有抗生素的蟲(chóng)藥混合物，同理得到終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5 和 15.625 mg/L含有甲維鹽的蟲(chóng)藥混合物及含有甲維鹽和高效抗生素的蟲(chóng)藥混合物。將蟲(chóng)藥混合物放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并記錄線(xiàn)蟲(chóng)的總數(shù)和死亡數(shù)，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，以線(xiàn)蟲(chóng)和無(wú)菌水等體積混合為對(duì)照組。

1.6 甲維鹽和高效抗生素混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的溫室防效測(cè)定

1）馬尾松苗預(yù)備。先將馬尾松種子用無(wú)菌水沖洗干凈，無(wú)菌水浸泡24 h 后，用30% H2O2處理30 min，用滅菌濾紙吸干水分，播種于121 ℃、120 min 滅菌的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)土中，用少量的土覆蓋其上，培養(yǎng)2 周后移栽至一次性塑料水杯中，用無(wú)菌水定期澆水。當(dāng)馬尾松苗長(zhǎng)至180 d 后，將表面消毒的松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3 與濃度為 1×108cfu/mL 的 AMA3-1 菌株水懸液（松材線(xiàn)蟲(chóng)的預(yù)處理和細(xì)菌水懸液的制備參照本文“1.2）”等體積混合2 h后，用滅菌的剪刀剪去馬尾松頂部部分針葉，在傷口上附少許滅菌脫脂棉球，向脫脂棉上滴加40 μL 蟲(chóng)菌混合液（約含線(xiàn)蟲(chóng)500 條），接種后24 h內(nèi)不定時(shí)地向脫脂棉球補(bǔ)充無(wú)菌水，使滅菌棉球始終保持水潤(rùn)，以確保松材線(xiàn)蟲(chóng)侵入馬尾松苗。

2）不同施用時(shí)間下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治效果的測(cè)定。在接種前5 d、接種前2 d和接種當(dāng)天以灌根法［16］向馬尾松苗施藥，每個(gè)施用時(shí)間下將500 mg/L 甲維鹽、高效抗生素以及混合液分別施入馬尾松苗，每株馬尾松苗施藥10 mL。以灌根無(wú)菌水處理為對(duì)照，CK1、CK2、CK3 和 CK4 均作為對(duì)照組。處理組及CK1、CK2、CK3 均接種蟲(chóng)菌混合液。CK1 接種前 5 d 施無(wú)菌水，CK2 接種前 2 d 施無(wú)菌水，CK3 接種當(dāng)天施無(wú)菌水，CK4 接種時(shí)加入無(wú)菌水。每個(gè)處理6株松苗，重復(fù)3次。

3）不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治效果的測(cè)定。在接種前5 d 將500、250、62.5 mg/L 的甲維鹽，500、250、62.5 mg/L 的高效抗生素，500、250 以及62.5 mg/L 的混合液分別以灌根法施入馬尾松苗，每株馬尾松苗施藥10 mL。以無(wú)菌水處理為對(duì)照，CK1、CK2 均施無(wú)菌水。灌根5 d 后處理組及CK1 接種蟲(chóng)菌混合液，CK2 接種時(shí)加入無(wú)菌水，每處理6株馬尾松苗，重復(fù)3次。

接種蟲(chóng)菌混合液后每2 d 記錄馬尾松發(fā)病狀況并計(jì)算感病指數(shù)，接種第7 天計(jì)算馬尾松感病率、死亡率以及藥劑對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果。馬尾松病情分級(jí)和病情指數(shù)的計(jì)算參照Xue 等［17］的方法。感病率和感病指數(shù)計(jì)算公式參照本文“1.2”，死亡率和防治效果計(jì)算公式如下：

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 24.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）分析（顯著水平為α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率、繁殖量和病害發(fā)生的影響

如圖1 A-C 所示，不同濃度菌株AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 分別與松材線(xiàn)蟲(chóng) AMA3 混合后，與對(duì)照組一樣，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活率逐漸降低。菌株濃度為5×107cfu/mL 時(shí)，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線(xiàn)蟲(chóng)存活率分別由第2 天的97.03%、95.02%和90.59%降至第18 天的55.08%、52.44%和41.98%。菌株濃度為5×106cfu/mL 時(shí)，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線(xiàn)蟲(chóng)存活率分別由第2 天的93.15%、91.44%和88.78%降至第18 d 的48.19%、40.56%和37.76%。菌株濃度為5×105cfu/mL 時(shí)，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線(xiàn)蟲(chóng)存活率分別由第2 天的88.96%、83.17%和83.10%降至第18 天的37.82%、35.17%和29.01%。而對(duì)照組松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率由第2天的85.68%降至第18天的30.97%。結(jié)果表明，在3 種濃度處理下，與對(duì)照相比，AMA3 + AMA3-1、AMA3 + AMA3-2 和 AMA3 + AMA3-3 處 理 組 松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率下降速度均小于對(duì)照組，且AMA3-1處理下的線(xiàn)蟲(chóng)存活率下降速度小于A(yíng)MA3-2 和AMA3-3。菌株濃度為5×107cfu/mL時(shí)，3株細(xì)菌中任何一株細(xì)菌處理過(guò)的線(xiàn)蟲(chóng)存活率下降速度小于菌株濃度為5×106cfu/mL 和5×105cfu/mL。因此，相比AMA3-2和AMA3-3，AMA3-1更能延長(zhǎng)松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活時(shí)間，提高其存活率。

由圖1 D 可知，當(dāng)細(xì)菌濃度分別為5×107、5×106cfu/mL 時(shí)，AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 處理的松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且AMA3-1 處理的松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量顯著高于A(yíng)MA3-2和 AMA3-3 處 理 組（P＜0.05），而 AMA3-2 與AMA3-3 處理的松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)細(xì)菌濃度為5×105cfu/mL 時(shí)，AMA3-1處理的松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而AMA3-2 和AMA3-3 處理的松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，3 株細(xì)菌均能提高松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖量，其中，AMA3-1 處理下的線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量高于A(yíng)MA3-2 和AMA3-3處理。

圖1 細(xì)菌處理下松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活率和繁殖量Fig.1 Survival rate and reproduction of B.xylophilus treated with bacteria

2年生馬尾松苗接種試驗(yàn)表明，表面消毒的AMA3 以及 AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 處理過(guò)的松材線(xiàn)蟲(chóng)均能使2年生馬尾松盆栽苗出現(xiàn)感病癥狀，均表現(xiàn)為針葉先失水褪綠、黃化，進(jìn)而枯萎、死亡。接種 10 d 時(shí)，AMA3 + AMA3-1、AMA3 +AMA3-2 和AMA3 + AMA3-3 混合處理組松苗先表現(xiàn)出感病癥狀，部分針葉失綠變黃；而單獨(dú)接種AMA3-1、AMA3-2、AMA3-3 和對(duì)照無(wú)菌水均未表現(xiàn)出感病癥狀，馬尾松保持健康，針葉始終為綠色。各處理具體的發(fā)病情況見(jiàn)表1。2年生馬尾松苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后25 d的發(fā)病癥狀如圖2所示。結(jié)果表明，接種 AMA3-1、AMA3-2 或 AMA3-3 的松材線(xiàn)蟲(chóng)比單獨(dú)接種消毒的松材線(xiàn)蟲(chóng)的馬尾松苗更早表現(xiàn)出感病癥狀，且與接種AMA3-2 或AMA3-3 的松材線(xiàn)蟲(chóng)相比，接種AMA3-1 的松材線(xiàn)蟲(chóng)能使馬尾松苗發(fā)病癥狀更嚴(yán)重。

圖2 2年生馬尾松苗接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后25 d的發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms of the pine wilt disease at 25 days after being inoculated by B.xylophilus on two-year-old P.massoniana

表1 接種不同菌株及松材線(xiàn)蟲(chóng)的馬尾松苗感病率和感病指數(shù)Table 1 Disease incidence and disease index（DI）of P.massoniana inoculated with different bacteria and B.xylophilus

2.2 抗生素的抑菌效果

相比 AMA3-2 和 AMA3-3，AMA3-1 對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活率、繁殖量和病害發(fā)生具有更好的促進(jìn)作用。因此，本研究以AMA3-1 為研究對(duì)象，對(duì)AMA3-1 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同類(lèi)型的抗生素對(duì)AMA3-1 的抑制作用不同。依據(jù)抑菌圈的直徑大小，判定米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星對(duì)細(xì)菌抑制作用最強(qiáng)；氧氟沙星、麥迪霉素、頭孢哌酮、萬(wàn)古霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氯霉素和多西環(huán)素8 種抗生素對(duì)菌株AMA3-1也具有不同程度的抑制作用（表2）。

表2 30種抗生素對(duì)菌株AMA3-1的抑制作用Table 2 Inhibition of 30 kinds of antibiotics on strain AMA3-1

2.3 甲維鹽對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌的抑菌活性

用菌株AMA3-1 涂布平板后，加入不同濃度甲維鹽藥敏片，培養(yǎng)24 h，平板上均未產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明甲維鹽對(duì)AMA3-1沒(méi)有抑制作用。

2.4 甲維鹽與高效抗生素混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺效果

由表3可知，甲維鹽或混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺作用隨著濃度的升高不斷增強(qiáng)（P＜0.05），在藥劑質(zhì)量濃度為500 mg/L 時(shí)，甲維鹽或混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的致死率均達(dá)到80%以上，說(shuō)明甲維鹽或混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺作用。高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)毒殺作用并沒(méi)有隨著濃度升高而有顯著的變化（P＞0.05），且不同濃度的高效抗生素處理下，松材線(xiàn)蟲(chóng)的校正死亡率均維持在較低水平（0.74%～2.43%），表明高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)明顯的毒殺作用。

表3 甲維鹽和高效抗生素混合對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺作用Table 3 Toxicity of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics to B.xylophilus %

2.5 甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的溫室防效

1）不同施用時(shí)間下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果。接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后第7天，對(duì)照組CK1、CK2 和CK3 的馬尾松苗全部死亡（表4），經(jīng)鏡檢，體內(nèi)均含有松材線(xiàn)蟲(chóng)，而空白對(duì)照組CK4始終保持健康，針葉為綠色。此時(shí)，接種前5 d、接種前2 d和接種當(dāng)天用甲維鹽灌根處理對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果分別是50%、33%和17%，表明隨著施藥時(shí)間的提前，甲維鹽對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病具有較好的防治效果。在接種前5 d 灌根，混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治效果為50%，與甲維鹽防效相當(dāng)，但高于高效抗生素（17%）（P＜0.05）。在接種前2 d 灌根，混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果為50%，高于甲維鹽（33%）或高效抗生素（17%）（P＜0.05）。在接種當(dāng)天灌根，混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果為25%，高于甲維鹽（17%）或高效抗生素（0%）（P＜0.05），表明在一定條件下，甲維鹽和高效抗生素混合，可提高松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果。

表4 不同施用時(shí)間下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果Table 4 Control effects of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics on the pine wilt disease under different application time

2）不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果。接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后第7天，對(duì)照組CK1 的馬尾松苗全部死亡，空白對(duì)照組CK2 仍然保持健康（表5）。此時(shí)，用質(zhì)量濃度為500、250 和62.5 mg/L 的甲維鹽處理對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果分別是 50%、29% 和 17%，用 500、250 和 62.5 mg/L 的混合液處理對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果分別為50%、33%和17%，表明隨著藥劑濃度的增加，甲維鹽或混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病具有較好的防治效果。3 種濃度處理下，混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果與甲維鹽相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于高效抗生素處理（P＜0.05），表明與高效抗生素相比，甲維鹽或混合液對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病具有較好的防治效果。

表5 不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果Table 5 Control effects of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics on the pine wilt disease at different application concentrations

3 討 論

不同地區(qū)、不同寄主松樹(shù)上的松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量有所不同［18］。針對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的細(xì)菌已有較多的研究［19-21］，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)與細(xì)菌之間存在特異性和專(zhuān)一性，哪些細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用沒(méi)有定論。本研究從安徽省感病黑松的松材線(xiàn)蟲(chóng)（AMA3）蟲(chóng)體上分離到3 株細(xì)菌：AMA3-1、AMA3-2 和AMA3-3，發(fā)現(xiàn)這3 株細(xì)菌均能促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率和繁殖量，并且經(jīng)接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合接種松材線(xiàn)蟲(chóng)和3 株細(xì)菌中的任何1 株均能使馬尾松苗發(fā)病速度快于單獨(dú)接種松材線(xiàn)蟲(chóng)，說(shuō)明松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的3株細(xì)菌均能加重松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生，加速馬尾松的死亡。相比AMA3-2 和AMA3-3，AMA3-1 對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活率、繁殖量和病害發(fā)生方面具有更好的促進(jìn)作用。有研究表明，在寄主體內(nèi)，致病細(xì)菌通過(guò)調(diào)節(jié)自身的代謝途徑，如降解苯甲酸和松萜類(lèi)物質(zhì)，幫助線(xiàn)蟲(chóng)降解松樹(shù)自身產(chǎn)生的保護(hù)物質(zhì)，提高線(xiàn)蟲(chóng)的適應(yīng)性，從而使松材線(xiàn)蟲(chóng)更能適應(yīng)松樹(shù)體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境［22-23］；松材線(xiàn)蟲(chóng)感染松樹(shù)后，松樹(shù)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)增強(qiáng)［24］，而松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生細(xì)菌可以提高松材線(xiàn)蟲(chóng)抗H2O2脅迫的能力，從而加重病害的發(fā)生［25］；松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生細(xì)菌能夠產(chǎn)生致萎毒素，如苯乙酸［26］、綠膿桿菌螯鐵蛋白［27］、環(huán)二肽［28］和鞭毛蛋白［29］等對(duì)寄主產(chǎn)生毒害作用，這些可能是細(xì)菌協(xié)助松材線(xiàn)蟲(chóng)致萎寄主的原因。但松材線(xiàn)蟲(chóng)病致病機(jī)制比較復(fù)雜，細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用有待明確。本研究中，AMA3-1 在提高松材線(xiàn)蟲(chóng)存活率、繁殖量和加重病害方面表現(xiàn)出更好的作用，這可能是由于A(yíng)MA3-1與松材線(xiàn)蟲(chóng)之間具有更好的協(xié)同作用。

鑒于A(yíng)MA3-1 在加重松材線(xiàn)蟲(chóng)病方面有較顯著作用，本研究以AMA3-1 為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果篩選出抑菌效果較好的環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素2 種高效抗生素。環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類(lèi)抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌DNA 的復(fù)制來(lái)殺滅細(xì)菌。米諾環(huán)素屬于四環(huán)素類(lèi)抗生素，通過(guò)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成達(dá)到抑菌目的。如果將2種類(lèi)型的抗生素混合使用，將取得更好的抑菌效果。通過(guò)甲維鹽抑菌試驗(yàn)可知，甲維鹽對(duì)AMA3-1 沒(méi)有抑制作用。殺線(xiàn)試驗(yàn)中，甲維鹽對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)具有較高的毒殺作用，高效抗生素對(duì)其無(wú)明顯的毒殺作用。通過(guò)甲維鹽和高效抗生素混合應(yīng)用于松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治試驗(yàn)可知，當(dāng)藥劑質(zhì)量濃度為500 mg/L 時(shí)，在混合接種松材線(xiàn)蟲(chóng)和AMA3-1 前2 d（當(dāng)天）根施混合液、甲維鹽和高效抗生素對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果分別是50%（25%）、33%（17%）和17%（0%）。說(shuō)明在松材線(xiàn)蟲(chóng)病防治方面，殺線(xiàn)劑（甲維鹽）發(fā)揮主效作用，高效抗生素雖無(wú)法直接對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)起到毒殺作用，但是通過(guò)控制松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌AMA3-1 的種群數(shù)量，可以提高殺線(xiàn)劑（甲維鹽）對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果，張志超等［6］和楊耀長(zhǎng)等［8］也得到了相似的結(jié)論。因此，利用殺線(xiàn)劑和殺菌劑復(fù)配對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病進(jìn)行防治可能不失為一個(gè)好的手段。

松材線(xiàn)蟲(chóng)與其攜帶的相關(guān)細(xì)菌可能存在某種營(yíng)養(yǎng)共生關(guān)系。談家金等［30-31］從松材線(xiàn)蟲(chóng)體上分離到松材線(xiàn)蟲(chóng)伴生細(xì)菌堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）GD1，且GD1可延長(zhǎng)松材線(xiàn)蟲(chóng)的存活時(shí)間，促進(jìn)其繁殖，并且發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種松材線(xiàn)蟲(chóng)或GD1松枝不發(fā)病，而攜帶GD1 的松材線(xiàn)蟲(chóng)可使病害發(fā)生。趙博光等［32］發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)伴生細(xì)菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）能夠促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵、繁殖和蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育。何龍喜等［33］發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶細(xì)菌嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）在非寄生條件下對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖量具有一定的負(fù)調(diào)控作用，但可增強(qiáng)松材線(xiàn)蟲(chóng)致病力，加速寄主松樹(shù)的死亡。本研究再次證明了細(xì)菌在松材線(xiàn)蟲(chóng)病中的重要作用，展現(xiàn)了應(yīng)用抗生素和甲維鹽控制該病的良好前景。但本研究由于采用灌根法進(jìn)行松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治試驗(yàn)，藥劑被寄主的吸收情況可能影響到防治效果?？紤]到打孔注藥技術(shù)的高效性、經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性，在今后的試驗(yàn)中，可以采用打孔注藥向林間大樹(shù)注入甲維鹽和抗生素，進(jìn)一步研究其對(duì)林間松材線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果。