免疫親和柱凈化-柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定中藥薏苡仁中的伏馬毒素

張 太， 毛 丹， 王少敏， 劉賢賢， 周 恒， 季 申*，1

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

伏馬毒素(Fumonisins,FBs)是一類由鐮刀菌屬真菌串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌、輪狀鐮刀菌和尖孢鐮刀菌等代謝產(chǎn)生的真菌毒素[1]。1988年，Glomelderd等人[2]首次分離純化出FB1和FB2[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)28種FBs類似物，分為A、B、C和P四組，其中FB1、FB2、FB3是自然界存在最普遍且毒性最強(qiáng)的3種毒素。FBs可導(dǎo)致馬產(chǎn)生白腦軟化癥，豬產(chǎn)生肺水腫綜合征[3]。同時(shí)有研究表明FBs和人類的食道癌和神經(jīng)管缺陷有關(guān)[4]。1993年，國(guó)際癌癥研究中心(IARC)將FBs列為2B類致癌物質(zhì)[5]。

FBs污染大多存在于玉米及玉米制品中，在大米、小麥、生咖啡、調(diào)味品、啤酒以及中藥材中也有檢出[6 - 8]。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定玉米中FB1和FB2的總量為4 000 μg/kg，玉米粉和玉米渣中總量為2 000 μg/kg；美國(guó)對(duì)脫胚的干磨玉米制品、制爆米花的凈玉米、部分脫胚的干磨玉米制品中FBs(FB1、FB2、FB3)的限量分別為2 000、3 000、4 000 μg/kg[9]。FBs的檢測(cè)有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、核酸適配體、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法[10 - 12]。其中，薄層色譜法靈敏度低、重現(xiàn)性較差；酶聯(lián)免疫吸附法假陽(yáng)性率高，不能準(zhǔn)確定量；核酸適配體受環(huán)境影響較大。液相色譜法因其靈敏度高、定量準(zhǔn)確，被廣泛應(yīng)用于FBs的檢測(cè)。FBs沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)，也沒(méi)有熒光特性，應(yīng)用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一般使用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生FBs生成具有熒光的衍生物，從而可以采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量分析[13 - 15]。

薏苡仁(Coicis Semen)為禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Romen)Stapf)的干燥成熟種仁，具有利水滲濕、健脾止瀉等作用。與其他種仁類中藥類似，薏苡仁富含油脂、淀粉等化學(xué)成分，在種植、采收、儲(chǔ)存等過(guò)程易發(fā)生霉變，進(jìn)而被FBs污染。本研究建立了免疫親和柱凈化-自動(dòng)柱前衍生-高效液相法測(cè)定薏苡仁中FB1、FB2和FB3的含量，為準(zhǔn)確反應(yīng)薏苡仁中FBs污染水平提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司);1500振蕩器(美國(guó)，Spexsampleprep公司);Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf公司);Sartorius CP225D分析天平(美國(guó)，梅特勒-托利多儀器有限公司);Milli-Q純水儀(美國(guó)，密理博公司);免疫親和柱(普瑞邦公司)。

FBs對(duì)照品溶液：將FB1、FB2和FB3標(biāo)準(zhǔn)品(普瑞邦公司)用乙腈-水(1∶1)配制成5 μg/mL的混合儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存，使用前根據(jù)需要將儲(chǔ)備溶液稀釋。甲醇、乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司);KCl、NaH2PO4、H3PO4、NaB4O7·10H2O、NaCl、KH2PO4(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);2-巰基乙醇(美國(guó)Fluka公司);鄰苯二甲醛(美國(guó)Pickering公司)。

1.2 樣品前處理

精密稱取薏苡仁樣品粉末約2 g(過(guò)二號(hào)篩)，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)混合溶液25 mL，高速振蕩10 min，離心10 min(4 000 r/min)，移取上清液10 mL，于50 mL容量瓶中，用吐溫-20/磷酸鹽緩沖溶液(稱取8.0 g NaCl、1.2 g NaH2PO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4，用980 mL水溶解，然后用HCl調(diào)整pH至7.4，用水稀釋至1 000 mL，最后加入1 mL 吐溫-20，混合均勻)稀釋至刻度，混勻，離心10 min(4 000 r/min)。移取上清液20 mL通過(guò)免疫親合柱，流速3 mL/min，用20 mL水清洗，棄去全部流出液。用0.75 mL 0.1%甲酸甲醇洗脫兩次，合并洗脫液，置于2 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3 自動(dòng)柱前衍生程序及色譜條件

Kinetex-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1 mol/L KH2PO4(H3PO4調(diào)節(jié)pH=3.3)，等度洗脫(A∶B=(68∶32)；流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量：40 μL;柱溫：40 ℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)335 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

FBs常采用乙腈-水或甲醇-水提取。本研究比較了水、甲醇-水(1∶1)、乙腈-水(1∶1)、甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)、甲醇-乙腈-水(1∶1∶1)5種溶液提取FBs的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，使用甲醇-乙腈-水的回收率高于其他提取液,FB1、FB2、FB3的回收率均在80%以上。實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)為提取溶劑。

表1 不同提取溶液下薏苡仁中FB1、FB2、FB3的平均回收率

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇分別考察了Kinetex XB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Kinetex XB-C18柱(150 mm×4.6 mm,3.6 μm)和Kinetex C18柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm)三種色譜柱，其中Kinetex C18色譜柱的分離度高、對(duì)稱因子好，最終選擇該色譜柱分離目標(biāo)化合物。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇液相色譜法檢測(cè)FBs，流動(dòng)相常用甲酸緩沖鹽-甲醇和磷酸緩沖鹽-甲醇體系。經(jīng)過(guò)比較，選擇基線平穩(wěn)的0.1 mol/L NaH2PO4-甲醇為流動(dòng)相。0.1 mol/L NaH2PO4的pH值為4.5，不能很好的分離FB2和FB3，需要使用H3PO4調(diào)劑pH值來(lái)達(dá)到更好的分離度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值達(dá)到3.3時(shí)，F(xiàn)B2和FB3的分離度為2，滿足分離的要求。最終確定流動(dòng)相為0.1 mol/L Na2H2PO4(H3PO4調(diào)pH=3.3)-甲醇(32∶68)。選定色譜條件下FB1、FB2和FB3的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 伏馬毒素B1、B2、B3的液相色譜圖(pH=3.3)Fig.1 Liquid chromatogram of FB1,FB2 and FB3(pH=3.3)

2.3 進(jìn)樣程序的確定

自動(dòng)進(jìn)樣程序的混合功能在次數(shù)設(shè)置較少的時(shí)候常出現(xiàn)混合不完全的情況，因此比較了混合次數(shù)。結(jié)果表明：混合次數(shù)為15次以上時(shí)，F(xiàn)B1、FB2和FB3的峰面積均不再增加，證明FBs與衍生試劑能夠完全混合。最終將衍生次數(shù)設(shè)置為15次。

為保證所用標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液都能衍生完全，分別使用線性范圍濃度最高的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、加標(biāo)供試品溶液與衍生溶液混合進(jìn)行比例考察。結(jié)果表明當(dāng)衍生試劑與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的比例為4∶10時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液即衍生完全。但由于樣品溶液中可能存在其他化合物影響FBs的衍生化，只有當(dāng)衍生試劑與溶液比例達(dá)到8∶10時(shí)，才能夠完全衍生。因此，最終衍生試劑與溶液比例選為8∶10。

2.4 回收率與精密度

將濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的FB1、FB2、FB3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用“1.4”的方法進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為Y軸、濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見(jiàn)表2。FB1、FB2、FB3在5～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r)分別為1.0000、0.9999、0.9998。以信噪比3∶1和10∶1分別確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，F(xiàn)B1、FB2、FB3檢測(cè)限分別為6、10、10 μg/kg；定量限分別為20、30、30 μg/kg(表2)。

表2 方法的線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限

在陰性樣品中分別添加50 μg/kg、250 μg/kg、1 000 μg/kg低中高3個(gè)水平的伏馬毒素，按照“1.3”和“1.4”的方法進(jìn)行測(cè)定，3個(gè)加標(biāo)水平平均回收率分別為83.97%、81.58%、81.45%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.46%、3.64%和3.44%。

2.5 方法應(yīng)用

根據(jù)建立的方法對(duì)21批薏苡仁(由上海青浦中藥飲片有限公司、上海和堂中藥飲片公司等提供，經(jīng)上海食品藥品檢驗(yàn)研究院鑒定為薏苡仁)樣品進(jìn)行分析。檢測(cè)結(jié)果表明，薏苡仁易受FBs的污染，其中FB1檢出率為66.7%，濃度范圍13～447 μg/kg。FB2和FB3僅有一批檢出，分別為31 μg/kg和47 μg/kg。

3 結(jié)論

本文建立免疫親和柱凈化-柱前衍生-液相色譜測(cè)定薏苡仁中伏馬毒素的方法，樣品經(jīng)甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)提取，免疫親和柱凈化，設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣程序使用OPA衍生伏馬毒素。有效解決了伏馬毒素的OPA衍生物不穩(wěn)定問(wèn)題，節(jié)省大量人工成本。本方法準(zhǔn)確度、精密度和線性等均滿足相應(yīng)要求，可為薏苡仁中伏馬毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供分析方法。