奶粉功能化石墨烯的制備及其用于藥物載體研究

周婷榮， 宋蔓婷， 羅思宇， 鄧 睿， 楊志國， 渠陸陸， 楊國海

(江蘇師范大學化學與材料科學學院，江蘇徐州 221116)

石墨烯是一種獨特的二維薄膜材料，由密集堆積的碳原子以sp2的雜化方式排列成平面六邊形蜂窩狀網格結構。2004年，英國曼徹斯特大學Novoselov等[1]用微機械剝離法，成功從石墨中分離出石墨烯。石墨烯獨特的結構決定了其具有較好的物理和化學性質，在光學、電學、熱學和機械以及其他方面都表現出優(yōu)異的性能[2 - 5]。石墨烯的制備方法一般包括:微機械剝離法、液相剝離法、化學氣相沉積法、氧化還原法和自下而上合成法[6 - 12]等多種方法。目前最常用的是剝離石墨氧化物的化學還原法，它的成本較低而且可以實現大規(guī)模的制備。石墨烯具有疏水性，且石墨烯納米片之間存在強烈的范德華力[13]，使其趨向于團聚甚至重新形成石墨，但石墨烯的一些獨特性質是與它的單層結構密切相關的[14]，因此防止石墨烯納米片的團聚，使其保持單層的結構是合成高質量石墨烯的關鍵因素。在以往的合成當中，通常利用功能化試劑通過共價或非共價作用來防止石墨烯的團聚[15 - 17]。制備過程中一般使用水合肼等還原劑，通常具有毒性和腐蝕性，影響了它在生物醫(yī)學方面的應用。近年來，科研工作者在研究采用環(huán)境友好的方法制備石墨烯等領域取得了一定的進展。如利用葡萄糖、明膠、牛血清白蛋白等作為還原劑，同時不需要其它功能化試劑，得到穩(wěn)定分散的石墨烯溶液[18 - 21]。另一方面，各種碳納米材料憑借其獨特的物理化學性質，成為了生物醫(yī)藥分析領域的研究熱點。相比于其它材料，碳納米材料容易穿過細胞膜等特點[22]，使其成為一種理想的藥物載體。氧化石墨烯納米片作為石墨烯的一種衍生物，表面修飾了含氧等官能團，增加了其親水性和生物相容性，在藥物傳輸等領域的研究取得了一定的進展。而石墨烯由于疏水性的特點，其在生理緩沖體系條件下的穩(wěn)定性較差，限制了其在相關領域的應用[23 - 26]。因此，尋找新的既可做還原劑又可做穩(wěn)定劑的物質，建立綠色合成石墨烯的方法，提高其生物相容性，使其可達到更高的藥物負載量，實現藥物的高效運輸和可控釋放，具有重要的意義和廣闊的應用前景。

已有報道將半胱氨酸、天冬氨酸等氨基酸用于石墨烯的制備[27,28]，但是所得產物在水或緩沖溶液中容易團聚，限制了其進一步應用。奶粉廉價易得，環(huán)境友好，其主要成分之一蛋白質，含有多種氨基酸殘基等還原性官能團[29]，同時有大量的π-π共軛結構和疏水作用賦予其一定的吸附性[30]，可以有效防止納米片團聚。在這些特性的共同作用下，奶粉具有既作還原劑又可作穩(wěn)定劑的潛力，可用于石墨烯的制備并應用于生物醫(yī)學研究。本文通過一種簡便的方法合成了奶粉功能化的石墨烯納米片(mp-GNS)，并證實了其具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性。另外，以羅丹明6G(R6G)為抗癌藥物模型，考察了mp-GNS對R6G的吸附和釋放行為。結果表明mp-GNS/R6G對R6G的釋放具有pH響應和緩釋作用，因此，mp-GNS有望成為一種新型的抗癌藥物遞送載體。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

原子力顯微鏡(AFM)圖在Agilent 5500儀器上，SPI3800控制器，采用輕敲模式獲得；透射電子顯微鏡(TEM)在JEOL 2100儀器上進行分析，操作電壓為200 kV；掃描電子顯微鏡(SEM)在HitachiS-4800型儀器上獲得照片；X-射線粉末衍射(XRD)的測定在Shimadzu XRD -6000衍射儀上進行；紫外-可見光譜(UV-Vis)圖采用UV-3600(日本)紫外-可見分光光度計進行測量；MTT法中的吸光度使用Bio-Rad680酶標儀(美國)在490 nm進行測定。

石墨粉、H2SO4(98%)、KMnO4、NaNO3、H2O2(30%)、HCl、BaCl2和二甲亞砜購自南京試劑有限公司。阿霉素(DOX)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自Sigma-Aldrich。細胞培養(yǎng)液3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自上海生工生物工程有限公司，其它均為分析純試劑。實驗所用去離子水通過Millipore Autopure系統(tǒng)得到。

奶粉(雀巢脫脂成人奶粉)購自當地超市。

1.2 氧化石墨烯(GO)的合成

采用Hummers的方法[31]合成GO。將250 mL圓底燒瓶浸入冰水浴中，向燒瓶中加入濃H2SO4、4 g石墨粉和2 g NaNO3的混合物。在劇烈攪拌的同時，向懸浮液中分多次添加12 g KMnO4(小心控制加入速率)，反應過程中溫度始終保持在20 ℃以下。在不斷攪拌下將溶液升溫至40 ℃。隨著實驗的進行溶液逐漸變稠，呈現棕灰色，氣泡逸出的速率明顯下降。35 min后，邊攪拌邊緩慢加入約180 mL去離子水，有大量氣泡逸出，經過20 min后，顯棕色。接著加入H2O2至溶液呈亮黃色。在溶液保持余熱的時候過濾，得到一個黃棕色的濾餅，用5%的HCl和去離子水洗滌，從而制得GO。

1.3 mp-GNS的制備

將10 mL 0.5 mg/mL剝離的GO加入盛有30 mL去離子水的圓底燒瓶中，充分攪拌均勻，加入1 g奶粉，滴加NaOH溶液調節(jié)pH至中性，升溫至80 ℃攪拌30 min使其混合均勻。將混合物在油浴環(huán)境下保持95 ℃恒溫加熱攪拌6 h。將得到的黑色反應溶液冷卻至室溫，經過多次離心洗滌后，備用。

1.4 R6G的負載和釋放

為了將熒光探針R6G裝載在mp-GNS上，先將R6G和不同量的mp-GNS溶液分別混合，室溫振蕩反應2 h，離心洗滌后，用熒光光譜儀測量上清液中R6G的熒光強度變化，根據計算得到飽和吸附量。為了研究R6G從mp-GNS/R6G復合物上的釋放過程，將飽和吸附的mp-GNS/R6G復合物，加入到不同pH的緩沖溶液或無水乙醇中。在37 ℃振蕩不同的時間，離心分離后，用熒光光譜儀測定上清液中熒光強度的變化，研究不同pH條件下復合物上R6G的釋放行為。

1.5 細胞毒性和藥物運輸

將DOX與不同量的mp-GNS溶液分別混合均勻，在室溫下振蕩2 h，離心10 min后，在480 nm激發(fā)波長下，于500～700 nm波長范圍內測定上清液中DOX的熒光光譜，確定DOX的飽和吸附量。將得到的mp-GNS/DOX復合物在超聲輔助下重新分散到水中，于4 ℃下保存，備用。

細胞增長的抑制通過MTT實驗獲得。即在96孔板中接入100 μL 1.0×104cells/孔的MCF-7細胞溶液，接著加入一系列濃度梯度的mp-GNS、DOX和mp-GNS/DOX，分別培養(yǎng)24 h和48 h。通過噻唑藍方法驗證細胞存活情況，為了保證實驗的準確性，需要重復4次。對照實驗在其他條件都相同時，以5 μL MTT(5 mg/mL)代替復合物，在對照孔中培養(yǎng)4 h，然后離心10 min。保留滴液，接著在每個孔中加入二甲基亞砜，于振蕩培養(yǎng)箱中充分振蕩后，用酶標儀在波長570 nm下測量得光強度值，通過計算得到細胞相對存活率。

2 結果與討論

2.1 mp-GNS的表征

本實驗由Hummer法制得GO，然后以奶粉為還原劑和穩(wěn)定劑得到石墨烯，如圖1所示。反應過程中，奶粉釋放出還原性的自由電子，然后自由電子對GO進行還原。反應的最終產物為CO2和H2O等無毒無害小分子，同時未反應的奶粉以及氧化得到的有機小分子均安全無毒且容易通過水洗除去。

圖1 mp-GNS的制備示意圖Fig.1 Illustration of the green synthesis of mp-GNS

圖2(A)中曲線a為GO的吸收曲線，在231 nm處出現吸收峰，是C=C的π-π*躍遷，另外300 nm處的肩峰是由于C=O的n-π*躍遷，表明生成了GO；曲線b為mp-GNS的吸收曲線，通過奶粉還原GO之后，吸收峰由231 nm紅移至267 nm處，而267 nm處的吸收峰說明GO被還原成了石墨烯，這是由于石墨烯的大π鍵恢復導致的；同時300 nm左右處的肩峰消失，則進一步說明含氧官能團被除去[32]。

圖2(B)和2(C)分別是對mp-GNS納米片通過AFM進行的形貌的表征和厚度分析圖。mp-GNS的厚度明顯比純石墨烯納米片的理論值要厚[16]，這是由于奶粉吸附到石墨烯納米片上導致mp-GNS的厚度有所增加，mp-GNS呈片層狀結構，片層間距增大。說明奶粉的修飾有效阻止了石墨烯的團聚，拉開了層間距，因此mp-GNS具有較好的分散性和穩(wěn)定性。

如圖2(D)所示，通過對mp-GNS納米片的TEM進行形貌表征分析，可以觀察到mp-GNS呈半透明薄紗狀，紋理清晰，表面存在一些褶皺，但沒有發(fā)生團聚。表明奶粉均勻牢固地附著在石墨烯片層上，保持了mp-GNS的穩(wěn)定性。

如圖2(E)所示，當石墨被氧化后，在2θ=10.04°處出現了GO的晶面衍射峰，表明生成了氧化石墨晶體結構。當氧化石墨摻雜奶粉并還原后，在2θ為10.4°處的衍射峰消失，并在2θ為24°左右處出現新的衍射峰，表明GO被還原成了石墨烯[15]。石墨烯的衍射峰變寬，強度減弱，主要是由于奶粉的加入阻礙了石墨烯片層團聚現象的產生，制備成較多為單層結構的石墨烯，使其層間距增加，而導致衍射現象不明顯[33]。

同時，為了探究石墨烯納米片在各種環(huán)境下的穩(wěn)定性，將GO和mp-GNS分別在水和PBS中于室溫下培養(yǎng)24 h。通過圖2(F)和2(G)可以看出，GO在水中呈現出較好的分散性和穩(wěn)定性，但在PBS中發(fā)生了嚴重的團聚；而mp-GNS在水中和PBS中都表現出好的分散性和穩(wěn)定性，且在觀察時間內無任何團聚現象。這就說明奶粉吸附到石墨烯表面形成mp-GNS，有效改變了石墨烯納米片表面的疏水性，使納米片不易發(fā)生團聚，且在緩沖溶液環(huán)境下能夠長時間的保持穩(wěn)定。

圖2 (A)GO(a)和mp-GNS(b)的紫外-可見吸收光譜圖;(B)mp-GNS的AFM圖；(C)厚度分析圖；(D)TEM圖像;(E)GO(a)和mp-GNS(b)的XRD譜圖;(F)GO和mp-GNS(G)在水和PBS中的穩(wěn)定性比較Fig.2 (A) UV-Vis absorption spectra of GO (a) and mp-GNS (b);(B) AFM image of mp-GNS；(C) Cross-section analysis along with the line in AFM image of mp-GNS;(D) TEM image of mp-GNS;(E) XRD patterns of GO (a) and mp-GNS (b);(F) Dispersibility of GO and mp-GNS (G) in water and PBS

2.2 R6G的負載和釋放

為了研究mp-GNS作為藥物載體的作用，選擇R6G作為熒光探針對mp-GNS進行標記。R6G是一種陽離子染料，而mp-GNS呈電負性，它們通過靜電作用吸引在一起，形成mp-GNS/R6G復合物，如圖3(A)所示。實驗通過檢測mp-GNS的不同加入量在550 nm下對R6G的熒光猝滅來監(jiān)控整個負載過程。隨著mp-GNS加入量的增加，上清液中的熒光強度逐漸減小，為激發(fā)態(tài)的R6G和mp-GNS表面之間發(fā)生共振能量轉移從而導致的熒光猝滅，說明了R6G已經負載在mp-GNS上[34]。在mp-GNS加入量為100 μL時，R6G達到了飽和吸附量。通過計算，R6G的吸附容量為85 μg/mg。R6G在mp-GNS上具備高度負載能力可以歸因為mp-GNS具有較高的比表面積，以及R6G與mp-GNS之間存在強烈的π-π共軛作用和氫鍵相互作用[35]。

進一步研究了mp-GNS/R6G在不同pH緩沖溶液中的釋放性行為。釋放的R6G由于遠離mp-GNS，不再發(fā)生熒光共振能量轉移，因而R6G熒光得到恢復[36]。如圖3(B)所示，R6G在不同pH值時都經歷了一個持續(xù)釋放的過程，并且在開始階段釋放速度較快，幾乎與時間呈指數型關系，后面釋放速度趨于平緩。但是在不同的pH值下R6G的釋放量不同。在pH=7.4時，R6G的釋放速度很慢，10 h只釋放了約20%，40 h后釋放量為27%。而pH=4.6和pH=2.0時，10 h內R6G的釋放量分別達到32%和50%，之后R6G的釋放量隨時間的增加而緩慢減少。這表明在相同的時間內，酸性條件下R6G的釋放量要遠遠高于中性條件下的釋放量。

圖3 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)對R6G(4 μg/mL)的熒光光譜；(B)mp-GNS/R6G在pH=2.0、4.6和7.4下的釋放量；(C)mp-GNS/R6G在乙醇(a)和水溶液(b)中的熒光光譜Fig.3 (A)Fluorescence spectra of R6G solution (4 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) R6G release profiles for mp-GNS/R6G measured in PBS at pH 2.0,4.6 and 7.4 at 37 ℃;(C) Fluorescence spectra of mp-GNS/R6G in ethanol (a) and water (b)

為了分析在不同極性溶液中mp-GNS/R6G的釋放行為，以乙醇為介質進行了實驗。如圖3(C)所示，結果發(fā)現mp-GNS/R6G在水溶液中發(fā)生熒光猝滅現象(b)，經過乙醇處理后溶液熒光強度得以恢復(a)。熒光猝滅現象表明R6G和mp-GNS之間除了靜電引力和氫鍵相互作用之外，還存在著強烈的π-π共軛作用，而熒光強度的恢復則說明用乙醇處理之后，R6G和mp-GNS之間的氫鍵發(fā)生了解離，使得R6G在乙醇中的溶解度要遠遠高于在水中的溶解度，導致R6G在乙醇中能很好的釋放卻很難負載到mp-GNS表面。細胞中富含有機化合物如多糖，蛋白質和脂質等，它們可以誘導mp-GNS/R6G解離，使其熒光得以恢復。這種誘導釋放過程證明mp-GNS是一種在細胞內能夠承擔運輸作用的絕佳材料[37]。

2.3 藥物負載和傳輸分析

為了評估m(xù)p-GNS對真實藥物的運載能力，將DOX負載在mp-GNS上，制備得到mp-GNS/DOX復合物，利用與mp-GNS/R6G類似的方法考察其飽和吸附量。圖4(A)所示為不同mp-GNS加入量對DOX的熒光猝滅結果，產生最大DOX熒光猝滅的mp-GNS的體積為100 μL，此時DOX恰好在mp-GNS上達到飽和吸附。通過計算，DOX的吸附容量是170 μg/mg。

為了考察mp-GNS的細胞毒性，將MCF-7細胞分別與不同濃度梯度的mp-GNS溶液于37 ℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h，然后用MTT測定相對細胞活力(圖4(B))。結果表明，所制備的mp-GNS對細胞的毒性較低，且具有良好生物相容性，有望成為一種藥物輸送的理想納米載體。

以游離的DOX和mp-GNS/DOX溶液作對比，如圖4(C)所示，在相同條件下，mp-GNS/DOX的毒性要低于DOX，這與mp-GNS/DOX上DOX的釋放過程有關。當細胞內吞作用發(fā)生之后，DOX逐漸從mp-GNS/DOX上釋放出來，表現出緩釋效果，表明奶粉在藥物釋放過程中起到了調節(jié)作用。由于所得物質可以控制藥物在胞內的釋放速度，使藥物在一定時間內維持穩(wěn)定的水平，因此具有較好的臨床治療效果前景。

圖4 (A)mp-GNS(1.0 mg/mL)的加入量(a-j：0，10，20，30，40，50，60，80，100，120 μL)對DOX(8 μg/mL)的熒光光譜；(B)不同濃度的mp-GNS對MCF-7細胞毒性的影響；(C)DOX和mp-GNS/DOX對MCF-7細胞毒性的影響Fig.4 (A) Fluorescence spectra of DOX solution (8 μg/mL) with increasing amounts of mp-GNS with a concentration of 1.0 mg/mL (from a to j:0,10,20,30,40,50,60,80,100,120 μL) using the excitation wavelength of 350 nm;(B) Relative cell viability of MCF-7 cells treated with different concentrations of mp-GNS after 24 h and 48 h incubation;(C) Cytotoxicity of free DOX and mp-GNS/DOX to MCF-7 cells after 24 h and 48 h incubation

3 結論

本文采用一種簡單綠色的合成方法，以廉價易得的奶粉為功能化試劑，成功制備了mp-GNS。奶粉有效發(fā)揮了還原的作用，同時作為穩(wěn)定劑防止了石墨烯納米片的團聚。結合石墨烯大的比表面積和良好的生物相容性等特點，mp-GNS可被用于藥物傳輸研究。藥物吸附實驗結果表明，mp-GNS對R6G具有較好的吸附容量，同時mp-GNS/R6G對R6G的釋放具有pH響應性和緩釋作用。另外，細胞實驗表明，制備的mp-GNS毒性低，可以作為一種理想的載體用于細胞內的藥物運輸、生物成像等其他方面。隨著研究的不斷深入，將還原效果好且綠色的還原劑用于石墨烯的功能化已成為研究趨勢。本工作為制備高生物相容性和水溶性的石墨烯的合成和應用開辟了新的道路，具有重要的意義。